阅读说明：本技术 具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物 (Composition for inhibiting proliferation of bacteria having menaquinone synthesis pathway via futalosine or futalosine derivative ) 是由 松井英则 川口真里奈 于 2018-02-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供：具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物,该组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸作为有效成分；以及由具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌引起的疾病的预防或治疗用组合物。(The present invention provides: a composition for inhibiting the growth of a bacterium having a menaquinone synthesis pathway via futalosine or a futalosine derivative, the composition containing a fatty acid having a hydroxyl group at the 10-position and having 18 carbon atoms as an active ingredient; and a composition for preventing or treating a disease caused by a bacterium having a menaquinone synthesis pathway via futalosine or a futalosine derivative.)

具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途 径的细菌的增殖抑制用组合物

技术领域

本发明涉及具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌(优选螺杆菌属细菌(ヘリコバクター属細菌)或弯曲杆菌属细菌(カンピロバクター属細菌))的增殖抑制用组合物，该组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸作为有效成分。而且，本发明涉及由螺杆菌属细菌引起的疾病的预防或治疗用组合物、或者由弯曲杆菌属细菌引起的疾病的预防或治疗用组合物。另外，本发明还涉及作为食品、药品或饲料等的该组合物。

背景技术

目前，有约50%的人口在消化道内携带螺杆菌属细菌。已知螺杆菌属细菌携带者(保有者)虽然有时没有携带的自觉症状，但会引发胃炎、胃痛或者胃癌。由于螺杆菌属细菌的感染途径是经口和经由粪便的感染，因此在卫生状况差的发展中国家螺杆菌属细菌的感染率更高。

在感染了作为螺杆菌属细菌之一种的幽门螺杆菌(ヘリコバクター・ピロリ)的情况下，其感染通过尿素酶试验(13C-UREA BREATH TEST)来检测，进行除菌治疗。作为除菌方法，确立了抑制胃酸分泌的质子泵抑制剂与抗生素(青霉素类和大环内酯类)的3剂联用疗法，但据说为约90%的除菌率，未除净的幽门螺杆菌有可能再次增殖。而且，报道了该除菌方法存在腹泻、味觉障碍、过敏反应、出现多药耐性菌等副作用。认为副作用的主要原因是广谱抗生素的大量给药所引起的肠道菌群的变化。

另外，在人胃所感染的螺杆菌属细菌中，猪螺杆菌(ヘリコバクター・スイス)即使感染也往往对尿素酶试验呈阴性，并且因其是难培养性的菌而难以诊断，除菌方法也尚未确立。而且，已知在作为胃癌之一种的胃MALT淋巴瘤发病患者中的约60%，幽门螺杆菌检查结果为阴性，但已感染了广义的海尔曼螺杆菌(ヘリコバクター・ハイルマニイ センス ラト)中所包含的猪螺杆菌等细菌。

另外，感染了弯曲杆菌属细菌的家禽是人的食物中毒的重大原因。特别是，据说流通中的鸡肉的携菌率高。虽然列举了在鸡舍或食用禽类处理厂(食鳥処理場，屠宰场)有发生弯曲杆菌属细菌污染的可能性，但目前确切的污染源也还尚未清楚。人的弯曲杆菌感染症以发热或胃肠炎症状为主要症状，并发症有作为神经障碍的格林-巴利综合征。

作为抑制螺杆菌属细菌增殖的益生菌细菌，报道了加氏乳杆菌(ラクトバチルス・ガセリ)(专利文献1、非专利文献1)。另外，充分得知甲基萘醌(维生素K2)是细菌的电子传递系统中的必需成分，但暗示了螺杆菌属细菌和弯曲杆菌属细菌具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径(非专利文献2)，该合成途径不同于乳酸菌或大肠杆菌等所具备的甲基萘醌合成途径。迄今为止，报道了认为以经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径为靶向的直链不饱和脂肪酸(专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)或支链饱和脂肪酸(非专利文献5)具有抑制幽门螺杆菌增殖的效果。而且，还报道了以游离羟基脂肪酸作为有效成分的用于除去幽门螺杆菌的饮食品(飲食物，饮料和食品)(专利文献3)。另外，作为抑制弯曲杆菌属细菌增殖的化合物，已知有作为中链脂肪酸的辛酸(非专利文献6)。

如上所述，由于甲基萘醌的合成途径根据细菌而不同，所以仅可更强地阻断包括螺杆菌属细菌或者弯曲杆菌属细菌在内的病原性微生物所具备的甲基萘醌合成途径的化合物，可以抑制病原性微生物的增殖而不会破坏肠道菌群。因此，寻求可以更有效地阻碍经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的化合物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2015-117220号公报；

专利文献2：US2011/0064789A1；

专利文献3：日本特开2002-85012号公报；

非专利文献

非专利文献1：H. Matsui等人, Mouse Models for Assessing the ProtectiveEfficacy of Lactobacillus gasseri SBT2055 against Helicobacter suis InfectionAssociated with the Development of Gastric Mucosa-Associated Lymphoid TissueLymphoma, Helicobacter, 2015; 20: 291-298；

非专利文献2：T. Hiratsuka等人, An Alternative Menaquinone BiosyntheticPathway Operating in Microorganisms, Science, 2008 Sep 19; 321(5896): 1670-3；

非专利文献3：T. Yamamoto等人, Narrow-spectrum inhibitors targeting analternative menaquinone biosynthetic pathway of Helicobacter pylori, J.Infect. Chemother., 2016 Sep; 22(9): 587-92；

非专利文献4：L. Thompson等人, Inibitory effect of polyunsaturated fattyacids on the growth of Helicobacter pylori: a possible explanation of theeffect of diet on peptic ulceration, Gut, 1994; 35: 1557-1561；

非专利文献5：R. Tanaka等人, Branched fatty acids inhibit the biosynthesisof menaquinone in Helicobacter pylori, J. Antibiot., 2011; 64: 151-153；

非专利文献6：F. Solis de los Santos等人, Therapeutic Supplementation ofCaprylic Acid in Feed Reduces Campylobacter jejuni Colonization in BroilerChicks, Appl. Environ. Microbiol., 2008 Jul; 74 (14): 4564-6。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于：发现比阻碍经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的已知化合物更有效地阻碍该途径的化合物，提供含有该化合物作为有效成分的细菌增殖抑制用组合物，所述细菌具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径；以及提供由具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌引起的疾病的预防或治疗用组合物。

用于解决课题的手段

本发明人鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现了：10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸具有以往未知的生理功能，即幽门螺杆菌和猪螺杆菌的增殖抑制作用、Ki-67阳性细胞数的增加抑制作用、CD19表达量和CD20表达量的上升抑制作用、胃MALT淋巴瘤的病态发病抑制作用。另外，本发明人还发现了：10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸具有空肠弯曲杆菌(カンピロバクター・ジェジュニ)和大肠弯曲杆菌(カンピロバクター・コリ)的增殖抑制作用。

根据以上见解，完成了本发明。

即，本发明如下。

[1] 具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物，该组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸。

[2] [1]所述的组合物，其中，该脂肪酸至少在12位上具有顺式双键。

[3] [2]所述的组合物，其中，该脂肪酸为选自10-羟基-顺-12-十八碳烯酸、10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸和10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸的至少一种。

[4] [3]所述的组合物，其中，该脂肪酸为10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。

[5] [1]～[4]中任一项所述的组合物，其中该细菌为螺杆菌属细菌。

[6] [5]所述的组合物，其中，该螺杆菌属细菌选自幽门螺杆菌、猪螺杆菌。

[7] [5]或[6]所述的组合物，该组合物用于选自急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫)、特发性血小板减少性紫癜、小儿缺铁性贫血、慢性荨麻疹和帕金森病的疾病的预防或治疗。

[8] [1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，该细菌为弯曲杆菌属细菌。

[9] [8]所述的组合物，其中，该弯曲杆菌属细菌选自空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌。

[10] [8]或[9]所述的组合物，该组合物用于弯曲杆菌食物中毒或者格林-巴利综合征的预防或治疗。

[11] [1]～[10]中任一项所述的组合物，该组合物为食品或食品添加剂。

[12] [1]～[10]中任一项所述的组合物，该组合物为药品。

[13] [1]～[10]中任一项所述的组合物，该组合物为饲料或饲料添加剂。

[14] 具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制方法，该方法包括：向对象给予10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸。

[15] 选自急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜、小儿缺铁性贫血、慢性荨麻疹和帕金森病的疾病的预防或治疗方法，该方法包括：向对象给予10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸。

[16] 弯曲杆菌食物中毒或者格林-巴利综合征的预防或治疗方法，该方法包括：向对象给予10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸。

[17] 10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸，该脂肪酸用于选自急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜、小儿缺铁性贫血、慢性荨麻疹和帕金森病的疾病的预防或治疗。

[18] 10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸，该脂肪酸用于弯曲杆菌食物中毒或者格林-巴利综合征的预防或治疗。

[19] 10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸在制造具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制剂中的应用。

[20] 10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸在制造选自急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜、小儿缺铁性贫血、慢性荨麻疹和帕金森病的疾病的预防或治疗药中的应用。

[21] 10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸在制造弯曲杆菌食物中毒或者格林-巴利综合征的预防或治疗药中的应用。

发明效果

本发明提供：具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物，该组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸作为有效成分；以及由具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌引起的疾病的预防或治疗用组合物。该组合物能够在药品、食品、饲料等各种各样的领域中使用，因此本发明在产业上也非常有用。

附图说明

[图1-1]显示HYA对幽门螺杆菌SS1株的增殖抑制效果(体外)。

[图1-2]显示HYA对幽门螺杆菌TN2GF4株的增殖抑制效果(体外)。

[图1-3]显示HYA对幽门螺杆菌ATCC43579株的增殖抑制效果(体外)。

[图1-4]显示HYA对幽门螺杆菌NCTC11637株的增殖抑制效果(体外)。

[图1-5]显示HYA对幽门螺杆菌TY281株的增殖抑制效果(体外)。

[图1-6]显示HYA对幽门螺杆菌TY1345株的增殖抑制效果(体外)。

[图2-1]显示低浓度HYA对幽门螺杆菌SS1株的增殖抑制效果(体外)。

[图2-2]显示低浓度HYA对幽门螺杆菌TN2GF4株的增殖抑制效果(体外)。

[图2-3]显示低浓度HYA对幽门螺杆菌TK1029株的增殖抑制效果(体外)。

[图2-4]显示低浓度HYA对幽门螺杆菌RC-1株的增殖抑制效果(体外)。

[图3-1]显示脂肪酸对幽门螺杆菌SS1株的增殖抑制效果(体内)。

[图3-2]显示脂肪酸对幽门螺杆菌TN2GF4株的增殖抑制效果(体内)。

[图4-1]显示HYA对幽门螺杆菌SS1株的增殖抑制效果(体内)。

[图4-2]显示HYA对幽门螺杆菌TN2GF4株的增殖抑制效果(体内)。

[图4-3]显示HYA对猪螺杆菌TKY株或SNTW101株的增殖抑制效果(体内)。

[图5-1]显示HYA对猪螺杆菌TKY株的增殖抑制效果(体内)。

[图5-2]显示HYA对猪螺杆菌TKY株感染小鼠的胃组织中的Ki-67阳性细胞数的增加抑制效果(体内)。

[图5-3]显示HYA对猪螺杆菌TKY株感染小鼠的胃组织中的CD20表达上升的抑制效果(体内)。

[图5-4]显示HYA对猪螺杆菌TKY株感染小鼠的胃组织中的CD19表达上升的抑制效果(体内)。

[图6-1]显示HYA对空肠弯曲杆菌ATCC33560株的增殖抑制效果(体外)。

[图6-2]显示HYA对大肠弯曲杆菌ATCC33559株的增殖抑制效果(体外)。

[图6-3]显示HYA对空肠弯曲杆菌ATCC33560株的增殖抑制效果(体外)。

[图6-4]显示HYA对大肠弯曲杆菌ATCC33559株的增殖抑制效果(体外)。

具体实施方式

本发明提供：具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物(以下也称作本发明的组合物)，该组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸。

本发明的组合物含有10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸(以下也称作本发明的羟基化脂肪酸)。本发明的羟基化脂肪酸可以是饱和脂肪酸，也可以是不饱和脂肪酸。在为不饱和脂肪酸的情况下，优选具有至少一个选自6位上顺式双键、12位上顺式双键、15位上顺式双键和11位上反式双键的双键的不饱和脂肪酸，更优选至少在12位上具有顺式双键的不饱和脂肪酸。

更具体而言，本发明的羟基化脂肪酸可以列举：10-羟基-顺-12-十八碳烯酸(以下也称作HYA)、10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸(以下也称作αHYA)、10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸(以下也称作γHYA)、10-羟基-顺-6,顺-12,顺-15-十八碳三烯酸(以下也称作sHYA)、10,12-二羟基十八烷酸(以下也称作rHYA)、10-羟基-反-11-十八碳烯酸(以下也称作HYC)、10-羟基-反-11,顺-15-十八碳二烯酸(以下也称作αHYC)、10-羟基-顺-6,反-11-十八碳二烯酸(以下也称作γHYC)、10-羟基-顺-6,反-11,顺-15-十八碳三烯酸(以下也称作sHYC)等，优选列举10-羟基-顺-12-十八碳烯酸、10-羟基-顺-12,顺-15-十八碳二烯酸、10-羟基-顺-6,顺-12-十八碳二烯酸，进一步优选列举10-羟基-顺-12-十八碳烯酸。

本发明的羟基化脂肪酸可以通过已知的方法来调制，例如WO2013/168310中也记载了制造方法。另外，10-羟基-顺-12-十八碳烯酸可以参考Biochemical and BiophysicalResearch Communications 416(2011) 第188-193页等来调制。

本发明的羟基化脂肪酸对具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌(以下也称作futalosine合成细菌)具有增殖抑制效果。在本发明中，futalosine合成细菌是指在生物合成甲基萘醌的代谢途径中具备由分支酸经由futalosine或futalosine衍生物生物合成甲基萘醌的代谢途径(以下也称作futalosine途径)的细菌。这里，作为futalosine衍生物，可以列举：氨基脱氧futalosine、脱次黄嘌呤基futalosine、环状脱次黄嘌呤futalosine和1,4-二羟基-6-萘甲酸。在futalosine途径中，futalosine由分支酸和肌苷合成。另外，氨基脱氧futalosine由分支酸和腺苷合成。接着，futalosine或氨基脱氧futalosine代谢成脱次黄嘌呤基futalosine，脱次黄嘌呤基futalosine代谢成环状脱次黄嘌呤futalosine，环状脱次黄嘌呤futalosine代谢成1,4-二羟基-6-萘甲酸，最后1,4-二羟基-6-萘甲酸代谢成甲基萘醌。

甲基萘醌是细菌的电子传递系统中的必需成分，作为细菌内的合成途径，已知有两种途径。一种是由分支酸经由琥珀酰苯甲酸合成甲基萘醌的途径(以下也称作琥珀酰苯甲酸途径)，主要在大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、耶尔辛氏菌、枯草杆菌等中具备。另一种是近年来通过遗传分析明确的futalosine途径。目前为止，具有琥珀酰苯甲酸途径和futalosine途径这两种途径的细菌，已知有作为放线菌之一种的Stackebrandtia nassauensis DSM 44728，除该细菌以外，具备生物合成甲基萘醌的代谢途径的细菌，仅具备上述途径中的任一种途径。因此，可以阻碍futalosine途径的本发明的羟基化脂肪酸可以特异性地抑制futalosine合成细菌的增殖。在本发明中，futalosine合成细菌只要具备futalosine途径即可，没有特别限定，优选为不具备琥珀酰苯甲酸途径的细菌。另外，作为futalosine合成细菌，可以列举：螺杆菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、衣原体属细菌(クラミディア属細菌)、栖热菌属细菌(サーマス属細菌)、沃林氏菌属细菌(ウォリネラ属細菌)、链霉菌属细菌(ストレプトマイセス属細菌)、热酸菌属细菌(アシドサーマス属細菌)、北里孢菌属细菌(キタサトスポラ属細菌)和芽孢杆菌属细菌(バシラス属細菌)等。在本发明中，作为螺杆菌属细菌，可以列举：幽门螺杆菌、广义的海尔曼螺杆菌(包括猪螺杆菌、猫胃螺杆菌、鲑鱼螺杆菌、毕氏螺杆菌、棒状螺杆菌、犬胃螺杆菌、狭义的海尔曼螺杆菌)、鹅螺杆菌、猎豹螺杆菌、胆汁螺杆菌、白雁螺杆菌、加拿大螺杆菌、犬螺杆菌、胆囊螺杆菌、同性恋螺杆菌、肝螺杆菌、小家鼠螺杆菌、鼬鼠螺杆菌、帕美特螺杆菌、啮齿类螺杆菌、频齿螺杆菌等，优选列举幽门螺杆菌和猪螺杆菌。在本发明中，作为弯曲杆菌属细菌，可以列举：大肠弯曲杆菌、简明弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、唾液弯曲杆菌、粘膜弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌等，优选列举空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。在本发明中，作为衣原体属细菌，可以列举：鼠衣原体、猪衣原体、沙眼衣原体等。在本发明中，作为栖热菌属细菌，可以列举：安氏栖热菌、水生栖热菌、火地栖热菌、嗜热栖热菌等。在本发明中，作为沃林氏菌属细菌，可以列举：曲形沃林氏菌、产琥珀酸沃林氏菌、直肠沃林氏菌等。在本发明中，作为链霉菌属细菌，可以列举：阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、疮痂病链霉菌、变铅青链霉菌等。在本发明中，作为热酸菌属细菌，可以列举：解纤维热酸菌等。在本发明中，作为北里孢菌属细菌，可以列举：白丝北里孢菌等。在本发明中，芽孢杆菌属细菌可以列举：蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等。

另外，由于本发明的羟基化脂肪酸可以抑制futalosine合成细菌的增殖，所以在该futalosine合成细菌为感染人或人以外的动物而引起疾病的细菌(以下还称作病原性futalosine合成细菌)的情况下，可以用于该疾病的预防或治疗。作为病原性futalosine合成细菌，可以列举：螺杆菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、衣原体属细菌、沃林氏菌属细菌、芽孢杆菌属细菌等。在病原性futalosine合成细菌为螺杆菌属细菌的情况下，作为本发明的组合物所能预防或治疗的疾病，可以列举：急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤等胃部疾病；或者，弥漫性大B细胞淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜、小儿缺铁性贫血、慢性荨麻疹等胃外疾病和帕金森病等，优选列举急性胃炎、慢性胃炎、结节性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤等胃部疾病。在病原性futalosine合成细菌为弯曲杆菌属细菌的情况下，作为本发明的组合物所能预防或治疗的疾病，可以列举：弯曲杆菌食物中毒、格林-巴利综合征等。在病原性futalosine合成细菌为衣原体属细菌的情况下，作为本发明的组合物所能预防或治疗的疾病，可以列举：衣原体感染症、沙眼、肺炎、鹦鹉热等。在病原性futalosine合成细菌为沃林氏菌属细菌的情况下，作为本发明的组合物所能预防或治疗的疾病，可以列举牙周炎等。在病原性futalosine合成细菌为芽孢杆菌属细菌的情况下，作为本发明的组合物所能预防或治疗的疾病，可以列举：食物中毒、菌血症、肺炎、心内膜炎、眼部感染、机会性感染等。

本发明的组合物例如可以作为药品、食品、饲料等、或者掺混在其中使用。

在将本发明的组合物用作药品的情况下，作为该药品的剂型，可以列举：散剂、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、溶液剂、混悬剂、栓剂、软膏、霜剂、凝胶剂、贴剂(粘付剤)、吸入剂、注射剂等。这些制剂可以按照常规方法进行调制。

可用于制成制剂的添加剂例如可以列举：大豆油、红花油、橄榄油、胚芽油、葵花油、牛油、沙丁鱼油等动植物性油；聚乙二醇、丙二醇、甘油、山梨糖醇等多元醇；脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等表面活性剂；纯净水；乳糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇、卵磷脂、***胶、山梨糖醇溶液、糖液等赋形剂；甜味剂、着色剂、pH调节剂、香料等。需要说明的是，液体制剂可以是服用时溶解或悬浮于水或其他适当的介质的形式。另外，片剂、颗粒剂可以通过已知的方法进行包衣。

在以注射剂的形式进行给药的情况下，优选向静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、经皮、关节内、滑膜囊(滑液囊)内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等给药，特别是优选静脉内给药或腹腔内给药。静脉内给药可以是点滴给药、推注给药的任一种。

在将本发明的组合物用作食品或食品添加剂的情况下，该食品只要是溶液、悬浮物、粉末、固体成型物等可经口摄取的形态即可，没有特别限定。作为具体例子，可以列举：补充剂(散剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片、速崩片、糖浆、溶液剂等)、饮料(碳酸饮料、乳酸饮料、运动饮料、果汁饮料、蔬菜饮料、豆乳饮料、咖啡饮料、茶饮料、粉末饮料、浓缩饮料、营养饮料、酒精饮料等)、点心(软糖、果冻、口香糖、巧克力、曲奇、糖果、焦糖、日式点心、零食点心等)、方便食品类(方便面、蒸煮食品、罐头、微波食品、速食汤/味噌汁类、冷冻干燥食品等)、油、油脂食品(蛋黄酱、调味品、黄油、奶油、人造黄油等)、小麦粉制品(面包、意大利面、面条、蛋糕混合料、面包粉等)、调味料(酱汁、番茄加工调味料、风味调味料、烹饪混合料、汤汁类等)、畜产加工品(畜肉火腿、香肠等)。

在上述食品中，根据需要可以掺混各种营养素、各种维生素类(维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等)、各种矿物质类(镁、锌、铁、钠、钾、硒等)、食物纤维、分散剂、乳化剂等稳定剂、甜味剂、呈味成分(枸橼酸、苹果酸等)、香精、蜂王浆、蜂胶、落叶松蕈等。

在将本发明的组合物用作饲料或饲料添加剂的情况下，作为该饲料，可以列举：宠物食品、畜产或水产养殖饲料添加剂等。

作为给予或者摄取本发明的组合物的对象，可以列举：人或者人以外的动物(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猪、牛、鸡、鹦鹉、鹩哥、山羊、马、绵羊、猴等)。

本发明组合物的给药或者摄取量还根据给药或者摄取对象、对象疾病、症状、给药或者摄取途径等而不同，例如，通常可以将本发明的组合物中所含的脂肪酸以0.02～100mg/kg体重、优选0.2～50 mg/kg体重、更优选0.5～20 mg/kg体重作为1日的给药或者摄取量进行口服(经口)或者胃肠外给药或者摄取。给药或者摄取可以1日分成几次。另外，可以根据症状而增量或者减量。

通过以下的实施例来更具体地说明本发明，但实施例只不过是本发明的例示而已，对本发明的范围没有任何限定。

实施例

菌株

本实施例中使用的菌株如下。幽门螺杆菌SS1株是由胃病患者分离、且适合感染小鼠的实验株。幽门螺杆菌TN2GF4株、NCTC11637株、ATCC43579株、TK1029株、TY281株、TY1345株是由胃病患者的胃活检标本分离的株。幽门螺杆菌RC-1株是由胃病患者的胃活检标本分离的株，呈克拉霉素耐性。猪螺杆菌TKY株是由食蟹猴分离的株。猪螺杆菌SNTW101株是由患有结节性胃炎的患者分离的株。空肠弯曲杆菌ATCC33560株是由牛粪便分离的空肠弯曲杆菌的标准株。大肠弯曲杆菌ATCC33559株是由猪粪便分离的大肠弯曲杆菌的标准株。

脂肪酸的调制或准备

本实施例中使用的10位上具有羟基或羰基的碳原子数为18的脂肪酸(10-羟基十八烷酸(以下也称作HYB)、10-氧代-顺-12-十八碳烯酸(以下也称作KetoA)、10-氧代-反-11-十八碳烯酸(以下也称作KetoC))按照WO2013/168310的方法进行调制。另外，HYA、αHYA、γHYA参考Biochemical and Biophysical Research Communications 416 (2011) 第188-193页的报告等进行调制。本实施例中使用的硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、DHA、EPA从Nacalai Tesque(株)购入。本实施例中使用的蓖麻油酸从Sigma-Aldrich Co. LLC购入。

实施例1 通过ED₅₀测定得到的对幽门螺杆菌TK1029株的增殖抑制效果(体外)

使用含有10% FCS的布鲁氏菌肉汤培养幽门螺杆菌TK1029株(临床分离株)，之后向6-孔板的3mL含有2% FCS的脑心浸液肉汤(BHI)培养基(事先分别添加了0、0.5、5、50、500μg/mL的游离脂肪酸(硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻油酸、HYA)的培养基)中分别加入1×10⁶CFU的菌。在温度37℃、湿度100%、微需氧(微嗜氧)(5% O₂、10% CO₂、85% N₂)的条件下进行振荡培养，在15小时后和25小时后由各孔向Nissui板/螺杆菌琼脂培养基涂布0.1mL的培养液，计数3天微需氧培养后生成的集落(菌落)。用对数表示该活菌数，在活菌数的检测限为10²的对数图上，以添加了游离脂肪酸的培养基中的活菌数达到未添加游离脂肪酸的培养基中的活菌数的1/2的浓度作为ED₅₀值(ED₅₀值是指添加了游离脂肪酸的培养基中的活菌数达到{10×(未添加游离脂肪酸的培养基中的活菌数)^1/2}的浓度)。其结果，HYA在培养15小时后已经以较不具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸(硬脂酸、油酸、亚油酸)低约1000～100倍的ED₅₀值显示出抗幽门螺杆菌效果，另外，以较具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸即蓖麻油酸低约10倍的ED₅₀值显示出抗幽门螺杆菌效果(表1)。另外，在培养25小时后，HYA仍以较上述脂肪酸显著低或者相同程度的ED₅₀值显示出抗幽门螺杆菌效果。

[表1]

脂肪酸	15小时后(<i>μ</i>g/mL)	25小时后(<i>μ</i>g/mL)
			硬脂酸	500	＞500
油酸	50	＞50
			亚油酸	50	50
蓖麻油酸	5	0.5
			HYA	0.5	0.5

实施例2 HYA对幽门螺杆菌的增殖抑制效果(体外)

在含有3mL液体培养基(添加了10% FCS的布鲁氏菌肉汤)的6-孔板上分别接种幽门螺杆菌SS1株、TN2GF4株、ATCC43579株、NCTC11637株、TY281株、TY1345株，添加200μM或者1000μM的脂肪酸和100μg/mL的甲基萘醌(MK-4)。在温度37℃、微需氧条件(5% O₂、10% CO₂、85%N₂)下静置培养3天，之后在螺杆菌琼脂平板上涂布培养液，进行3天的培养，计数生成的集落(图1-1 A：SS1株、图1-2 B：TN2GF4株、图1-3 C：ATCC43579株、图1-4 D：NCTC11637株、图1-5 E：TY281株、图1-6 F：TY1345株。项目C：对照(未添加)、项目1：添加HYA、项目2：添加HYA和甲基萘醌、项目3：添加亚油酸、项目4：添加亚油酸和甲基萘醌)。HYA较亚油酸更能抑制幽门螺杆菌SS1株、TN2GF4株、ATCC43579株、NCTC11637株、TY281株、TY1345株的增殖。另外，通过添加甲基萘醌(MK-4)，脂肪酸对幽门螺杆菌的增殖抑制得到缓解。

实施例3 低浓度HYA对幽门螺杆菌的增殖抑制效果(体外)

在含有2mL液体培养基(添加了5% FCS的BHI)的6-孔板上分别接种幽门螺杆菌SS1株、TN2GF4株、TK1029株、RC-1株，添加20μM的脂肪酸和100μg/mL的甲基萘醌(MK-4)。在温度37℃、微需氧条件(5% O₂、10% CO₂、85% N₂)下振荡培养24小时，之后在螺杆菌琼脂平板上涂布培养液，进行3天的培养，计数生成的集落(图2-1 A：SS1株、图2-2 B：TN2GF4株、图2-3 C：TK1029株、图2-4 D：RC-1株。项目1：对照(未添加甲基萘醌)、项目2：对照(添加100μg/mL的甲基萘醌)、项目3：20μM的HYA(未添加甲基萘醌)、项目4：20μM的HYA(添加100μg/mL的甲基萘醌)、项目5：20μM的亚油酸(未添加甲基萘醌)、项目6：20μM的亚油酸(添加100μg/mL的甲基萘醌)。*, P<0.0001 vs. 对照(ordinary one-way ANOVA))。HYA较亚油酸更能抑制幽门螺杆菌SS1株、TN2GF4株、TK1029株、RC-1株的增殖。另外，通过添加甲基萘醌(MK-4)，脂肪酸对幽门螺杆菌的增殖抑制得到缓解。

实施例4 脂肪酸对幽门螺杆菌SS1株和TN2GF4株的抑制效果(体内)

使5周龄的C57BL/6雌小鼠每隔1天经口感染幽门螺杆菌SS1株或者TN2GF4株(1～5×10⁸CFU) 3次，从最终感染日起2周后解剖，测定胃粘膜的菌数。胃粘膜的菌数测定如下实施。首先，使用眼科用解剖剪刀切开小鼠的胃大弯部分，用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4、PBS)清洗除去内容物。接下来，用载玻片刮下粘膜，加入1mL的PBS，夹在2块载玻片的磨砂玻璃部分，以压碎的方式无遗漏地进行磨合，调制胃粘膜的悬浮液。在螺杆菌琼脂平板上涂布培养液，进行3天的培养，计数生成的集落。从感染的1周前起对小鼠给予分别添加了200μM脂肪酸(HYA、HYB、KetoA、KetoC、亚油酸、油酸、DHA、EPA)的水。对照没有添加脂肪酸(图3-1 A：感染SS1株、图3-2 B：感染TN2GF4株)。对于S1株和TN2GF4株的任一菌株，HYA与对照相比显著抑制了幽门螺杆菌数，与HYB、KetoA、KetoC、亚油酸、油酸、DHA、EPA相比也显示出较强的抑制作用。

实施例5 HYA对螺杆菌属细菌的增殖抑制效果(体内)

使5周龄的C57BL/6雌小鼠每隔1天经口感染幽门螺杆菌SS1株或TN2GF4株(1～5×10⁸CFU) 3次，从最终感染日起2周后解剖，测定胃粘膜的菌数。从感染的1周前起对小鼠给予添加了HYA或者亚油酸(200μM)的水(图4-1 A：SS1株、图4-2 B：TN2GF4株)。另外，使5周龄的C57BL/6雌小鼠仅经口感染猪螺杆菌TKY株或SNTW101株感染小鼠的胃悬浮液1次，2周后解剖，测定胃粘膜的菌数。从感染的1周前起对小鼠给予添加了200μM HYA的水(图4-3 C)。其结果，HYA抑制了幽门螺杆菌SS1株、幽门螺杆菌TN2GF4株、猪螺杆菌TKY株、猪螺杆菌SNTW101株的增殖。需要说明的是，感染小鼠胃内的猪螺杆菌菌数的测定如下实施。

使用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood & Tissue Kit)(Qiagen)由一部分胃组织调制DNA，进行实时PCR(机型：CFX96 (Bio-Rad))。猪螺杆菌定量用引物参考Diagn.Microbiol. Infect. Dis. 46(1): 1-7, 2003而使用了以下引物。

HeilF (5’ AAG TCG AAC GAT GAA GCC TA 3’) (SEQ ID NO: 1)；

HeilR (5’ ATT TGG TAT TAA TCA CCA TTT C 3’) (SEQ ID NO: 2)。

小鼠的β-肌动蛋白定量用引物参考J. Clin. Microbiol. 37: 1958-1963, 1999使用了以下引物。

5’ TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 3’ (SEQ ID NO: 3)；

5’ GGATGCCACAGGATTCCATACCCA 3’ (SEQ ID NO: 4)。

通过实时PCR进行的定量使用了iQTM SYBR Green Supermix。反应条件如下。

1个循环

95℃　2分钟；

40个循环；

95℃　5秒；

55℃　15秒；

72℃　45秒。

之后，使温度从65℃到95℃每隔5秒升高0.5℃，测定荧光。相对定量是采用多重反应(相同的管)和比较ΔΔCT法(ABI Prism 7700)，以猪海尔曼螺杆菌基因量/β-肌动蛋白基因量的比例进行数值化，进一步调整使未处理的平均值为1。

实施例6 HYA对胃MALT淋巴瘤的病态发病抑制效果(体内)

怀疑猪螺杆菌是胃MALT淋巴瘤的发病原因。使5周龄的C57BL/6雌小鼠仅经口感染猪螺杆菌TKY株感染小鼠的胃悬浮液1次，感染6个月后解剖，按照实施例5所记载的方法测定胃粘膜的菌数。从感染的1周前起对小鼠给予添加了200μM HYA的水。

(1) 感染小鼠胃内的猪螺杆菌菌数的测定

感染小鼠胃内的猪螺杆菌菌数的测定与实施例5同样地进行。显示以HYA未给药时作为1时的胃粘膜菌数的相对值(图5-1 A、项目1：HYA未给药组、项目2：HYA给药组)。与未给药组相比，在HYA给药组中菌数得到了显著抑制。

(2) 组织化学分析

Ki-67作为细胞增殖和细胞周期标志物而已知。在抗Ki-67抗体的免疫染色中检测了肿瘤组织中的增殖细胞。将一部分胃用10%中性***缓冲液固定，制作石蜡块，使用切片机连续切出切片，进行苏木精·伊红(HE)染色。使用将Ki-67(克隆SP6)兔单克隆抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行了1：300稀释的稀释抗体和作为二次抗体的Histofine simple stain mouse MAX-PO(R)((株)NICHIREI BIOSCIENCE、Code：414341)DAB染色(DAKO公司)，对比染色使用苏木精。阴性对照使用兔IgG抗体(Code No. X 0936Lot 050 (DAKO公司))。显示以HYA未给药时作为1时的淋巴滤泡内的Ki-67阳性细胞数(图5-2 B、项目1：HYA未给药组、项目2：HYA给药组)。与未给药组相比，在HYA给药组中Ki-67阳性细胞数的增加得到了显著抑制。

(3) CD19、CD20表达的定量

CD19和CD20是B细胞性淋巴瘤的细胞表面标志物。采用实时逆转录PCR(实时RT-PCR)测定CD19和CD20的表达量。使用NucleoSpin(注册商标)RNA试剂盒(Takara Bio(株))，由小鼠胃粘膜调制RNA。使用PrimeScript^TM RT Reagent试剂盒(Takara Bio(株))，由RNA调制cDNA。实时RT-PCR使用了KAPA SYBR Fast ROX Low qPCR试剂盒(KAPA BIOSYSTEMS公司)和QuantStudio7 Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific Inc.)。

CD19表达定量用引物使用了以下的引物。

Fw: 5’-AGTGACTAGCCTGGACTT-3’ (SEQ ID NO: 5)；

Rv: 5’-ACTGACTGACACCATCTG-3’ (SEQ ID NO: 6)。

CD20表达定量用引物使用了以下的引物。

Fw: 5’-CAGGAAGAGTTTGGTCAA-3’ (SEQ ID NO: 7)；

Rv: 5’-GGTTCACAGTCGTAGATAT-3’ (SEQ ID NO: 8)。

甘油醛-3-磷酸(GAPDH)表达定量用引物使用了以下的引物。

Fw: 5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’ (SEQ ID NO: 9)；

Rv: 5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 10)。

两步法实时RT-PCR的条件如下。

1个循环；

95℃ 3分钟；

40个循环；

95℃ 3秒；

60℃ 20秒。

将相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达量的CD19或CD20的表达量数值化，进一步调整使未感染组的CD19或CD20的平均表达量为1，显示HYA给药组和未给药组中的CD20相对表达量(图5-3 C、项目1：未感染组、项目2：HYA未给药组、项目3：HYA给药组)。同样，显示HYA给药组和未给药组中的CD19相对表达量(图5-4 D、项目1：未感染组、项目2：HYA未给药组、项目3：HYA给药组)。其结果，与未给药组相比，在HYA给药组中相对表达量得到了显著抑制。

实施例7 HYA对空肠弯曲杆菌ATCC33560株和大肠弯曲杆菌ATCC33559株的增殖抑制效果(体外)

将-80℃下保存的空肠弯曲杆菌ATCC33560株或大肠弯曲杆菌ATCC33559株涂布在添加了SR0155E的CCDA琼脂培养基上，在孵卵器(5% O₂、10% CO₂、85% N₂、湿度100%、42℃)内培养2天。挑取所生成的集落，接种在添加了10% FBS的布鲁氏菌液体培养基中，在孵卵器内振荡培养一夜。在12-孔板的各孔内分别注入以1×10⁶CFU/mL的浓度含有空肠弯曲杆菌ATCC33560株或大肠弯曲杆菌ATCC33559株的2mL添加了5% FBS的布鲁氏菌液体培养基，进一步加入任意浓度(0、100、200、400 μM)的脂肪酸，在孵卵器内振荡培养24小时。24小时后，测定振荡培养后的液体培养基的吸光度(600nm)。另一方面，将振荡培养后24小时的液体培养基用BSG(含有0.01%明胶的PBS、pH7.4)稀释1×10⁶倍，将0.1mL涂布在添加了10% FBS的布鲁氏菌琼脂培养基上，在孵卵器内培养2天后，测定所生成的集落数(图6-1～6-4、C：对照、LA 100：100μM的亚油酸、LA 200：200μM的亚油酸、LA 400：400μM的亚油酸、HYA 100：100μM的HYA、HYA 200：200μM的HYA、HYA 400：400μM的HYA、αHYA 100：100μM的αHYA、αHYA 200：200μM的αHYA、αHYA 400：400μM的αHYA、γHYA 100：100μM的γHYA、γHYA 200：200μM的γHYA、γHYA 400：400μM的γHYA)。其结果，HYA、αHYA、γHYA均浓度依赖性地抑制空肠弯曲杆菌ATCC33560株或大肠弯曲杆菌ATCC33559株的增殖，与亚油酸相比也显示出了较强的抑制作用。

以上的结果显示：10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸具有：幽门螺杆菌和猪螺杆菌等具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制作用、Ki-67阳性细胞数的增加抑制作用、CD19表达量和CD20表达量的上升抑制作用、胃MALT淋巴瘤的病态发病抑制作用。另外，结果还显示：10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸具有空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的增殖抑制作用。

产业实用性

在本发明中，发现了10位上具有羟基的碳原子数为18的脂肪酸会抑制具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖。含有该脂肪酸的组合物能够在药品、食品、饲料等各种各样的领域中使用，因此在产业上非常有用。

本申请以在日本申请的特愿2017-053056(申请日：2017年3月17日)为基础，其内容均包含在本说明书中。

<110> 日东药品工业株式会社

<120> 具备经由futalosine或futalosine衍生物的甲基萘醌合成途径的细菌的增殖抑制用组合物

<130> 092688

<150> JP 2017-053056

<151> 2017-03-17

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

aagtcgaacg atgaagccta 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

atttggtatt aatcaccatt tc 22

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

tcacccacac tgtgcccatc tacga 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ggatgccaca ggattccata ccca 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

agtgactagc ctggactt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

actgactgac accatctg 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 7

caggaagagt ttggtcaa 18

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<211> 19

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<213> 人工序列

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ggttcacagt cgtagatat 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtgtccgtc gtggatctga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 10

ttgctgttga agtcgcagga g 21