阅读说明：本技术 组合物及其用于治疗慢性猫呼吸系统疾病的用途 (Composition and application thereof for treating chronic feline respiratory disease ) 是由 A·贝克 E·霍奇金斯 M·拉宾 V·提尼斯 于 2018-03-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及可用于兽药领域的组合物,更具体地涉及包含信息素的组合物,其用于治疗猫慢性呼吸系统疾病及其并发症和/或猫慢性感染性疾病或病症。(The present invention relates to compositions useful in the field of veterinary medicine, more particularly to compositions comprising pheromones for use in the treatment of feline chronic respiratory disease and its complications and/or feline chronic infectious disease or disorder.)

组合物及其用于治疗慢性猫呼吸系统疾病的用途

发明领域

本发明涉及可用于兽药领域的组合物，更具体地涉及包含信息素的组合物，其用于治疗猫慢性呼吸系统疾病及其并发症和/或猫慢性感染性疾病或病症。

发明背景

猫感染性疾病很常见。猫感染性疾病的主要诱因被认为是感染猫呼吸道的病毒，并且被病毒感染的猫大多表现出类似于常见感冒的症状，例如上呼吸道炎症、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、鼻漏、鼻涕、流口水、发烧、肺炎、口炎、舌炎、颗粒性腺炎、舌溃疡、鼻端溃疡、系统性皮肤溃疡、鼻甲溃疡、泄泻、呕吐、厌食和活力减退。更具体地，当猫被猫疱疹病毒感染时，它们更容易显示上述症状。

猫疱疹病毒1(FHV-1)是在猫中最常见的猫感染性疾病，超过90％的在群体环境下安置的猫被感染。该生物体在感染的急性期(上呼吸道疾病、结膜炎和角膜炎)期间与严重的发病率相关，并且许多被感染的猫出现疾病的慢性和复发性临床症状。

据信，猫疱疹病毒1(FHV-1)是猫中最常见的猫感染性疾病；感染可能是亚临床的，或者其可能导致疾病的临床症状，包括打喷嚏、咳嗽、结膜炎、发热、角膜炎、呼吸困难、食欲不振、嗜睡、偶尔的肺炎和死亡。在诸如避难所等拥挤或紧张的环境中的发病率和死亡率可能很高。上呼吸道疾病包括打喷嚏、咳嗽和/或结膜炎。

在急性暴露后，大多数猫会出现持续感染，其中三叉神经节是病毒潜伏的主要部位。随着临床症状的复发和FHV-1散播(shedding)的增加，可以发生潜伏的FHV-1的重新激活。据信，应激事件在最初几周内导致FHV-1重新激活。在一项研究中，发生上呼吸道感染(URI)迹象的平均时间为8.3天，并且在避难所中在第一周内具有最高应激得分的猫更可能发展成URI(Tanaka A,Wagner DC,Kass PH,et al.Associations among weight loss,stress,and upper respiratory tract infection in shelter cats.J Am Vet MedAssoc 2012；240:570–576)。

目前，对于猫病毒疾病以及猫呼吸系统疾病，还没有值得一提的治疗方法，实际上这些疾病只能采用对症治疗，例如营养治疗，向待治疗的猫给予营养饲料，以缓解并恢复其身体活力和/或脱水症状，以及向它们给予抗生素以预防多重或继发感染，以及物理地去除粘性分泌物。

因此，需要开发用于治疗猫慢性呼吸系统疾病及其并发症和/或猫感染性疾病或病症，特别是与感染相关的猫打喷嚏的新疗法。

信息素疗法(“pheromonatherapy”或“pheromonotherapy”)是一种通过使用具有信息素性质的化学品来管理非人类哺乳动物行为问题的方法。它是非人类哺乳动物(包括家养动物，特别是猫和狗，以及非伴侣动物)的应激相关问题的创新治疗方法。信息素疗法已在狗和猫中进行了最广泛的研究。

信息素是用于同一物种的个体之间交流的化学物质。一些提供物种间交流的化学品称为他感素(allelochemical)。已知一些化合物在一个物种中是信息素，但已经观察到在其他物种中具有行为效应。信息素在本文中将在广泛的意义上使用，即任何天然或非天然(合成)存在的化合物，其对非人类哺乳动物具有行为影响。大多数信息素的确切作用机制尚不清楚，但它们引起边缘系统和下丘脑的某些改变。

信息素疗法是管理非人类哺乳动物福利(尤其是家养哺乳动物(例如狗和猫)中一些常见的应激相关的行为障碍)的一种很好的方式。

已经发现，信息素的组合物可以减少由于感染引起的猫慢性呼吸系统疾病的临床症状。更具体地，这里已经显示，暴露于信息素减少了与FHV-1相关的打喷嚏并且增加了在睡眠期间的放松。信息素的同一组合物可以帮助预防这些呼吸系统疾病的重现或复发。

因此，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗慢性猫呼吸系统疾病或其并发症和/或猫慢性感染性疾病或病症。

本发明还涉及用于治疗猫慢性呼吸系统疾病或其并发症和/或猫慢性感染性疾病或并发症的方法，该方法包括向有此需要的猫施用包含信息素的兽医用组合物。

本发明还涉及信息素的兽医用组合物在制备用于治疗猫慢性呼吸系统疾病或其并发症和/或猫慢性感染性疾病或病症的药物中的用途。

本发明还涉及包含信息素的兽医用组合物用于减轻由于猫慢性感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的临床症状的用途。本发明还涉及包含信息素的兽医用组合物用于减轻由于感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的猫慢性呼吸系统疾病，特别是猫慢性上呼吸道疾病引起的临床症状的用途。

附图说明

图1：研究时间表

图2：不同组和时间在观察点打喷嚏的比例。

*表示组之间的统计差异。

发明详述

在一个具体实施方案中，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗猫呼吸系统疾病，更具体地说是慢性上呼吸道疾病。更具体地，猫慢性呼吸系统疾病是由感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的。更具体地，本发明提供了一种包含信息素的兽医用组合物，其特别用于治疗与感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)相关的猫打喷嚏。

在一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗由感染(更特别是由疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的猫慢性呼吸系统疾病的临床症状(例如打喷嚏)和/或预防其重现或复发。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗由感染(更特别是由疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的猫慢性呼吸系统疾病的临床症状(例如打喷嚏)和/或预防其重现或复发。

本发明的另一个目的是包含信息素的兽医用组合物用于减轻由于猫慢性感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的临床症状的用途。

本发明的另一个目的是包含信息素的兽医用组合物用于减轻由于感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的猫慢性呼吸系统疾病，特别是猫慢性上呼吸道疾病引起的临床症状的用途。

通常由FHV-1感染引起的猫慢性呼吸系统疾病的临床症状更具体地是上呼吸道炎症、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、鼻漏、鼻涕或鼻塞。它也可能演变为流口水、眼分泌物、眼睑痉挛、发热、哮喘、肺炎、口炎、胃肠疾病，如肠易激综合征、舌炎、颗粒性腺炎、舌溃疡、鼻端溃疡、系统性皮肤溃疡、鼻甲溃疡、泄泻、呕吐、厌食和/或活力减退。猫慢性上呼吸道疾病通常是上呼吸道炎症、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、鼻漏、鼻涕、鼻塞或其混合。

在一个具体实施方案中，由感染引起的猫慢性呼吸系统疾病引起的临床症状是咳嗽、打喷嚏、鼻涕和/或鼻塞，并且优选打喷嚏。

猫慢性感染性疾病的临床症状通常是感染猫呼吸道，因此包括上呼吸道炎症、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、鼻漏，鼻涕或鼻塞。症状还可以包括流口水、眼分泌物、眼充血、眼睑痉挛、发热、哮喘、肺炎、口炎、胃肠疾病，如肠易激综合征、舌炎、颗粒性腺炎、舌溃疡、鼻端溃疡、系统性皮肤溃疡、鼻甲溃疡、泄泻、呕吐、厌食和/或活力减退。

在一个具体实施方案中，由猫慢性感染引起的临床症状是咳嗽、打喷嚏、鼻涕、鼻塞、眼分泌物、眼充血和/或眼睑痉挛，并且优选打喷嚏。

由感染(更具体地是由于FHV-1)引起的猫呼吸系统疾病的重现或复发经常发生，这就是为什么这种疾病被认为是慢性的。这些猫呼吸系统疾病(特别是由感染引起的打喷嚏)的重现或复发似乎是由于缺乏活力、缺乏放松、缺乏免疫防御和/或缺乏睡眠。在此已经发现，通过施用包含信息素的组合物可以预防或减少这种重现或复发，特别是通过增加猫睡眠期间的放松。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗由感染(更特别是由疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的猫慢性呼吸系统疾病的临床症状和/或预防其重现或复发。

更优选地，猫慢性上呼吸道疾病通常是上呼吸道炎症、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、鼻漏、鼻涕、鼻塞或其混合。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗猫上呼吸道疾病。更具体地，猫慢性呼吸系统疾病是由感染(例如疱疹感染，包括FHV-1感染)引起的。根据一个具体实施方案，本发明涉及包含信息素的兽医用组合物，其用于治疗打喷嚏，更优选与感染相关的打喷嚏。

在一个具体实施方案中，根据本发明的组合物减轻或减少打喷嚏，更特别是与感染(例如疱疹病毒，包括更特别是FHV-1)相关的打喷嚏。

在另一个具体实施方案中，根据本发明的组合物增加松弛，这通过增加患有感染性疾病和/或呼吸系统疾病的猫的睡眠时间来证明。

本发明涉及包含信息素的组合物或混合物。所述信息素是一种或多种脂肪酸和/或其酯，或更具体地是其乙酯或甲酯，作为活性成分。因此，该组合物包含脂肪酸酯或脂肪酸甲酯衍生物的部分或混合物。它们可以通过扩散到周围空气中而向猫给药。

组合物中脂肪酸、酯衍生物或甲酯衍生物的量可在宽范围内变化。相对于兽医用组合物的总量，它们可以为约0.5至95％，优选1至70％或1；5至50％。

根据本发明，“脂肪酸”是指具有单羧酸或二羧酸的烃链，其是饱和或不饱和的、直链或支链的、活性的、并且能够在非人哺乳动物中诱导行为改变。这些脂肪酸通常具有C4-C22。它们选自油酸、棕榈酸、壬二酸、庚二酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、亚油酸、硬脂酸、花生四烯酸、正丁酸、异丁酸、α-甲基丁酸、癸酸、新戊酸、γ-亚油酸、二十碳五烯酸、十五烷酸、十三烷酸或二十二碳六烯酸。

“脂肪酸的衍生物”是指脂肪酸的所有活性挥发性衍生物。优选地，衍生物是酯或甲酯或乙酯形式。

该混合物包含至少一种脂肪酸，例如油酸、油酸的衍生物、其酯或甲酯衍生物。

举例来说，我们可以列举脂肪酸混合物或其衍生物，包括其酯或甲酯，例如：

油酸和棕榈酸的混合物；

油酸和正丁酸的混合物；

油酸、棕榈酸和亚油酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸和棕榈油酸的混合物；

癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸和油酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸、肉豆蔻酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸、月桂酸和肉豆蔻酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸、肉豆蔻酸和十五烷酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸、肉豆蔻酸、十五烷酸和硬脂酸的混合物；

油酸、棕榈酸、亚油酸、肉豆蔻酸、月桂酸和十五烷酸的混合物；

月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸的混合物；或者更优选地

油酸、壬二酸、庚二酸和棕榈酸的混合物。

本发明的组合物可包含适当比例的上述脂肪酸，这是本领域技术人员所熟知的。举例来说，相对于脂肪酸及其衍生物的总重量，混合物可以含有：

约55-65％的油酸和45-35％的棕榈酸、它们的衍生物及其酯或甲酯衍生物；

约45％的油酸、16％的壬二酸、18％的庚二酸和21％的棕榈酸、它们的衍生物、其酯或甲酯衍生物；

约30％的棕榈酸、30％的油酸和40％的亚油酸、它们的衍生物、其酯和甲酯衍生物；或者

约30％的棕榈酸、40％的亚油酸、10％的棕榈油酸和20％的油酸、它们的衍生物、其酯和甲酯衍生物。

除非另有说明，否则百分比以重量表示。

如本文所用，术语“约”或“大约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据其使用的上下文而变化。如果根据其使用的上下文，该术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不明确的，则“约”或“大约”将意味着至多为特定术语的正负10％。

根据本发明的一个实施方案，组合物包含至少治疗有效量的活性脂肪酸、其衍生物(包括其酯或甲酯衍生物)，其更特别地选自油酸、壬二酸、庚二酸和棕榈酸。相对于脂肪酸及其衍生物的总重量，脂肪酸的混合物优选包含至少约45-60％的油酸、6-10％的壬二酸、8-12％的庚二酸和13-18％的棕榈酸。在使用酯和甲酯形式的情况下，相对于脂肪酸及其衍生物的总重量，混合物包含约45-65％的油酸甲酯、约6-10％的壬二酸二甲酯、约8-12％的庚二酸二甲酯和约13-18％的棕榈酸甲酯。优选地，相对于脂肪酸及其衍生物的总重量，脂肪酸酯的混合物包含大约47-51％的油酸甲酯、大约7-9％的壬二酸二甲酯、9-11％的庚二酸二甲酯和大约14-16％的棕榈酸甲酯。

本发明的组合物包含如上文所述的信息素。该组合物可以不含溶剂、赋形剂、植物提取物或甚至水相。或者，组合物可以包含溶剂、赋形剂、植物提取物。它们可包含溶剂，包括异烷烃和环烷烃。根据温度，它们通常以油相和液相的形式存在，并且可以通过任何适当的方式加热，以便获得脂肪酸及其衍生物、其酯或甲酯衍生物在空气中的扩散。

因此，根据本发明的脂肪酸混合物可以通过在环境空气中扩散而向猫给药。猫的给药可以通过加热或不加热来进行。组合物在环境空气中的扩散连续6至30天。

在一个具体实施方案中，本文公开的组合物是用于口服、鼻、皮内、皮肤、吸入或肠胃外给药的形式。优选地，组合物是用于在环境空气中扩散的形式。

在另一个具体实施方案中，用于本发明的组合物是液体溶液、悬浮液、固体或半固体、粉末、小球、胶囊(capsule)、颗粒、糖衣丸、凝胶剂(gelule)、喷雾剂、丸剂、片剂、糊剂或凝胶(gels)的形式。

在环境温度下，组合物可以是液体形式或固体形式，这取决于本发明的组合物中所含的化合物(特别是溶剂或赋形剂和信息素)的长度和结构，以及因此化合物碳链的长度和结构。

用于扩散的分配器可由本领域技术人员根据组合物的形式(固体或液体)来选择。它可以是例如美国外观设计专利US D752,730S中描述的分配器。

在一个优选的实施方案中，通过使猫吸入信息素的组合物来完成给药，该组合物可以在猫栖息地周围的环境空气中扩散。

猫包括猫和猫科的所有成员、家猫以及更常见的所有猫种族。它们包括家猫、农场猫或动物园猫，特别是任何年龄的猫，如幼猫。

本发明的另一个目的是用于使如上定义的本发明的组合物扩散到猫、允许组合物在空气中扩散的试剂盒或给药装置。

这些装置尤其可以是用于蒸发或扩散的电子装置，包括具有陶瓷板和聚合物基质的固体载体，在其上可以以可以发生扩散的方式施加足够量的如上定义的本发明的组合物。这些装置可以是电针的形式，其配有由适于加热的支撑陶瓷板组成的隔室，并且在其上可以放置浸渍有根据本发明的脂肪酸组合物的小板。通过***电源将设备激活。本发明的组合物的部分在热量的作用下通过小板的隔室中的开口扩散。这些与用于扩散防蚊驱虫剂的那些相当。装置也可以是美国外观设计专利US D752,730S中描述的分配器。

本发明的其他方面和优点将在以下实验部分中公开。

实施例

实施例1–兽医用组合物的制备

通过混合如下表1中所示的下列组分来制备兽医用组合物

表1：

QSP 100克，含Isopar V(溶剂)

使用的扩散器如外观设计专利US D752’730S中所述

扩散器可用于面积为20至70m²的房间中。补充包含有48ml Feliway产品，并将在20至30天内释放该产品。

实施例2：

这里描述的研究被设计为确定饲养在含有扩散器或安慰剂扩散器的等效房间中并且经受住所变化引起的应激的具有实验诱导的FHV-1感染的幼猫在行为评分、临床评分、FHV-1散播或血清皮质醇浓度方面是否有不同。

材料和方法

猫。在这项为期12周的初步研究中，使用了6只去势雄性和6只绝育雌性5月龄专门繁殖的幼猫。在此处描述的研究前8周，通过鼻内滴注使12只幼猫中的每一只被FHV-1感染，以用于研究，在该研究中12只幼猫是对照组。为了这项新研究的目的，重新使用这些幼猫，而不必通过实验重新接种其他猫。在该研究中，所有幼猫都证实了FHV-1感染，并且每只幼猫都出现了由发烧、打喷嚏、眼和/或鼻分泌物、鼻塞、结膜炎和/或眼睑痉挛组成的临床症状。在本研究期间，幼猫均未接受URI治疗，并且偶尔的打喷嚏、浆液性鼻涕和浆液性眼分泌物是FHV-1在幼猫中间歇性出现的仅有的潜在表现。这里描述的研究得到了机构动物护理和使用委员会的批准。

将幼猫随机分为信息素组(扩散器)或安慰剂组(安慰剂扩散器)；每个组由三只雄性和三只雌性组成。这些小组被安置在研究设施的具有两个独立的空气交换器的两个独立但大小相似的房间(信息素组＝8’6”宽度×10’3”长度×9’高度；安慰剂组＝9’7”宽度×9’长度×9’高度)中。向所有幼猫无限制地提供干食物和水，并提供相同的栖息处和富集装置。

临床评分。在该研究中使用了改编自其他FHV-1疫苗接种或治疗研究的临床评分表(表1)。对于一些比较，通过将当天记录的单个临床评分参数相加来计算每只幼猫每天的总临床评分。体温由微芯片来估算。体温升高被定义为>102.5°F。每天在听诊没有被大的咕噜声遮盖时测量心跳和呼吸频率。每周测量体重。

表1：临床评分说明由于统计学上很少发生得分>1，进行二项式分析，使用0或1来指示临床征象的存在或不存在

行为评分。评估了在先前的避难所和其他研究中使用的许多不同的行为评估标尺，作为评估幼猫的应激和行为的工具。基于对这些幼猫在接种FHV-1的研究期间的观察以及这里研究的幼猫是已经***静或与应激相关的行为(表2)。由于本研究中特定幼猫组的整体吸引人的个性和性情，在平衡期之前和期间进一步调整了该量规。当将扩散器引入到房间时应用的最终量规包含28个个体行为，在每个早晨每个房间的45分钟评分期间的五个不同的指定时间点记录(表2)。在以下四个时间点对每只幼猫进行15秒的“快照”观察：进入室内时(“SS1”时间点)、临床评分处理期间(“SS2”时间点)、紧接着临床评分处理之后(“SS3”时间点)以及在45分钟标记处(“SS4”时间点)。在SS3和SS4之间的整个20-30分钟内(“长”时间点)也记录了行为(表2)。

表2

实验设计。两名经训练的评分者，在治疗分配方面不知情，在整个研究过程中，每个早晨大约在同一时间和顺序，对每个房间应用标准化的临床和行为评分系统45分钟(图1)。

测定。在研究开始时和六个时期(E、G1、K1、G2、K2、G3)中的每一个之后，给幼猫服镇静剂，将丙美卡因(proparacaine)施用于它们的角膜，并且采集血液、尾咽粘膜细胞和结膜拭子。将血清、口咽和结膜拭子储存在-80℃直至分批测定。从口咽和结膜拭子中提取总DNA，并对FHV-1 DNA和GAPDH进行定量PCR测定(qPCR)。FHV-1qPCR测定的结果表示为FHV-1DNA/GAPDH DNA的比率。在商业实验室(密歇根州立大学内分泌学实验室)测量血清皮质醇浓度。

统计学评估

在随机化之后但在开始研究之前，通过Wilcoxon秩和检验比较了信息素组和安慰剂组之间在先前研究中初次感染后发生的与FHV-1相关的总临床得分，并且发现这些组是相似的(p＝0.9)。

计算描述性统计数据，并将分类数据表示为频率，而将连续数据表示为平均值、中间值和范围。通过Wilcoxon秩和检验比较了信息素组和安慰剂组之间的总临床得分(表1)的组中间值结果、个体临床参数、个体行为得分、幼猫总应激得分、睡眠得分、FHV-1/GAPDH比率、体重。

在使用单变量分析对变量进行关联筛选后，如果p值<0.25，则将变量包括在多变量回归分析中。使用多级混合效应逻辑回归来评估个体幼猫差异对临床(二项式)和行为得分(二项式)结果的影响，并且对于总临床得分和总应激得分使用多级混合效应线性回归。通过双尾学生T检验比较各组间的组平均皮质醇浓度。

使用商业上可获得的软件(STATA参考)进行所有比较。显著性被定义为p<0.05。

结果

临床发现。所有幼猫都有健康的食欲，体重持续增加，并且在整个研究过程中每天都有柔软整齐的皮毛。所有猫都不需要针对FHV-1感染进行医学干预。对于12只幼猫中的1只，温度传感微芯片发生故障，因此在腋窝内测量该幼猫的体温。由于在G1中除了添加扩散器之外没有对幼猫进行操作，因此这不被认为是组之间的最终比较的应激期：仅来自K1、G2、K2和G3期间的结果被单独地和组合地评估。在平衡期结束时，组之间没有统计学上显著的临床差异(p＝0.58)。表3中按组和研究期列出了总临床得分的平均值、范围和组比较结果。

表3.按组和研究期的总临床得分的平均值、范围和组比较结果

G2、G3＝在G1中放置扩散器后的两个2周的群养期；K1、K2＝两个2周的笼养期。显示平均值和范围，以显示每组6只幼猫之间的差异，但是通过Wilcoxon秩和检验比较中间值，用于统计评估，p<0.05是显著的。

在研究期间很少听到咳嗽声。在应激期之前和期间，对于多只猫在许多观察点记录了严重的眼分泌物，但从未与结膜炎相关。经常记录严重的鼻涕，但在研究期间未检测到与鼻塞相关的粘液样分泌物。因此，未进一步评估咳嗽、眼分泌物和鼻涕。一般报告轻度鼻塞(得分＝1)，但很少报告中度堵塞，因此未进一步评估该参数。打喷嚏是最常见的可能与FHV-1感染有关的发现。在G1期间放置扩散器之后但在诱导应激之前，各组间在打喷嚏组方面没有差异(安慰剂组＝32.1％；信息素组＝25.0％)。

在控制个体幼猫效应后，在K1期间(p＝0.006)、G3期间(p＝0.005)和组合的应激期间(p<0.001)，信息素组中的幼猫打喷嚏的频率较低。

行为参数

根据文献综述和临床评分者在研究评分期间结束时的一致性，四种行为被认为是该种群中猫应激的客观指标(表4)。

表4.行为相关的应激相关得分

行为	评估的时间期间
		笼踱步	SS1、SS3、SS4*、长期
笼抓	SS1、SS3、SS4、长期
		笼凌乱	长期
过度喵喵叫	长期

*关于如何确定行为和对其进行评分的进一步描述，参见表2。

在笼养期间，在两组之间检测到许多差异(表5)。在控制个体幼猫效应后，安慰剂组幼猫中更频繁的笼踱步在SS3时间点期间接近统计学显著性(p＝0.05)。

表5.在笼养期间在各时间点期间的潜在的与应激相关的行为的频率

n/a＝不适用

通过在K1和K2应激期内添加4个与应激相关的行为得分来计算每只幼猫的总应激得分；然后比较各组之间的总应激得分。信息素组的总应激得分显著低于安慰剂组(表6)。然而，在控制个体幼猫效应后，各组之间的总幼猫应激得分没有统计学差异。

表6.安慰剂组和信息素组在笼养期间的总应激得分的中间值和范围

	K1中间值(范围)	K2中间值(范围)	K1和K2组合的中间值(范围)
				安慰剂组	36(19-52)	19(6-45)	55(26-97)
信息素组	25(19-46)	16(4-27)	42(23-73)
				p-值	0.04	0.04	0.004

中间值表示每个期间内每只幼猫的6个总应激得分的中间值。

范围代表每个组中6只幼猫中6个总应激得分中的最低(最小)和6只幼猫中最高(最大)的总应激得分；

使用睡眠作为“平静/放松”行为的相关性，因为在房间在前45分钟的活动后逐渐平静之后在SS4时间点在观察期结束时观察并记录睡眠。在该最后一个时间点，如果幼猫身体姿势放松并闭眼，则记录“睡眠”。在平衡期间，信息素组或安慰剂组中的幼猫都没有发生任何睡眠(表7)。

表7.在每个观察期结束时睡觉的猫的比例

平衡

G1*

K1

G2

K2

G3

安慰剂组

0％

0％

0％

0％

0％

1％

信息素组

0％

2％

10％

4％

13％

20％

*在G1的开始时放置扩散器

在研究期G1期间，在信息素组中仅发生两次睡眠，并且在安慰剂组中没有发生睡眠。当组合K1和K2应激期时(p<0.0001)和当组合所有4个应激期(K1、G2、K2和G3)时(p<0.0001)，信息素组具有显著更多的睡眠事件。在多级混合效应逻辑回归分析中控制个体幼猫效应后，只有当所有4个应激期组合时，信息素组才有显著更多的睡眠(p＝0.002)。

应激的其他潜在的行为指标很少发生在这个幼猫群体中。在与新物体的小组玩耍期间，在幼猫之间发生的孤立的嘶嘶叫事件，在E期间两组中有四次，在G1期两组中有两次，并且在G2和G3组合期间在信息素组中两次，在安慰剂组中六次。类似地，在与新物体的小组玩耍期间，打斗在信息素组中在E期间发生两次，在G1期间发生一次，并且在安慰剂组中在G2期间发生四次。在整个研究期间，在三只幼猫中报告了一次腹泻，在一只幼猫中报告了四次腹泻。当群养时，所有幼猫每天都在门口迎接评分者。在幼猫中没有观察到隐藏，也没有任何幼猫在评分期间表现出任何攻击性或恐惧行为。

皮质醇结果。所有血清皮质醇浓度均在实验室报告的正常范围内。信息素组和安慰剂组的平均结果在研究过程中没有差异。然而，对于信息素组(p＝0.046)、安慰剂组(p＝0.04)和2个组的组合(p＝0.007)，当与第一个应激期(K1)的开始相比时，平均皮质醇结果在最后应激期(G3？)结束时更大。

FHV-1/GAPDH比率。虽然从几乎所有从幼猫收集的拭子中扩增出GAPDH DNA，但在开始第一个应激期(K1)之后，仅对安慰剂组中的2只幼猫和信息素组中的4只幼猫扩增了FHV-1 DNA。具有可检测的FHV-1/GAPDH比率的样品数太小，不能用于组间病毒散播幅度的比较。当在应激期间在散播或未散播FHV-1的幼猫之间比较来自最后应激期结束时的组平均皮质醇结果时，没有统计学差异(p＝0.125)。

讨论

即使在使用标准剂量的FHV-1接种未经FHV-1免疫的雌性所生的幼猫时，也会出现疾病的临床症状的变化。此外，收集用于评估猫行为的客观数据可能很困难，而且个体猫对应激的反应也不同。某些猫可能不会发生响应于应激的FHV-1相关疾病或病症的重新激活，并且当的确发生重新激活时，直到识别临床症状的时间可能在4-11天之间变化。因此，组合来自不同应激期的结果可能是评估本研究中各组之间差异的最准确方法。作者相信，该初步研究的最大局限是每组仅包含6只猫，这可能已经减少了检测组间差异的统计学差异的可能性。然而，在控制个体幼猫效应并组合4个假定的应激期后，与具有安慰剂扩散器的房间中的幼猫相比，在具有信息素扩散器的房间里的幼猫在观察期结束时睡眠增加，并且整个期间整体总体打喷嚏更少，这支持了治疗效果。

试图重新激活FHV-1的该应激模型仅用于具有假定的免疫调节活性的益生菌的一项研究中。与当前研究中描述的结果类似，FHV-1重新激活的证据在猫之间不同，但记录了治疗效果。在先前的研究中，结膜炎是常见的，打喷嚏很少见，而在这里描述的研究中，结膜炎很少见，但打喷嚏很常见。研究之间的这些差异可能来自使用2种不同的FHV-1菌株和接种方法。在先前的研究中，将FHV-1的野生菌株施用于结膜穹窿，而在此描述的研究中使用的不同FHV-1菌株通过鼻接种施用。

在本研究中，咳嗽很少见，浆液性眼分泌物与结膜炎无关，没有发生粘液性鼻涕，且中度鼻塞仅很少地报道，因此没有单独评估。然而，打喷嚏是一个客观的发现，并且一次有2名评分者可以确定哪些幼猫在观察期间打喷嚏。所有幼猫在进入本研究时仍然由于初次FHV-1感染而间歇性打喷嚏，并且在首次放置扩散器时的G1期间，在安慰剂组(32.1％的时间)和信息素组(25.0％)中，打喷嚏仍然常见。然而，在4个假定的应激期中，随着时间的推移，在具有信息素扩散器的房间中的猫发生打喷嚏的观察点的比例通常减少，而在具有安慰剂扩散器的房间中的猫发生打喷嚏的观察点的比例保持与在假定诱导应激之前的时间段相似(图2)。这些发现可能表明安慰剂室中与FHV-1相关的打喷嚏的重新激活或维持，这可能是因为对应激暴露的接受度更高。如果将来再次进行这样的研究，将FHV-1接种体在鼻和眼睛之间分开可能更好地反映自然感染并使其更有可能识别疾病的重新激活。

从几乎所有的口咽拭子和结膜拭子中扩增出GAPDH，表明样品采集是足够的。然而，很少从这些样品位点和时间扩增出FHV-1 DNA。由于FHV-1在接种后未被消除，因此许多FHV-1 PCR测定结果可能是错误的阴性。多项已经研究表明，即使存在疾病，FHV-1 PCR测定结果也可能是阴性，因为免疫反应抑制感染性生物数目。结膜的小活组织检查的使用可能比使用拭子更敏感，这应该考虑用于未来的研究中。

另一个限制是，在本研究开始时，没有先前公布的评分量规用于研究已经很好地适应的研究幼猫中的应激。因此，在该初步研究中，发明人试图设计他们自己的行为度量以评估这些具有独特个性和经历的特定幼猫，这些独特个性和经历是研究者和观察者在研究开始之前就知道的(表2)。幼猫们已经很好地交往、充满感情、寻求人的关注并且习惯于研究环境、彼此和观察者。所有幼猫都被接受并经常寻求轻柔的对待和人类接触、抚摸和互相玩耍以及与观察者和观察者的评分工具和服装玩耍。因此，在本研究中，无法评估典型的应激和恐惧指标，如隐藏、不动、僵硬、蹲伏，发出嘶嘶声、瞳孔放大和收耳，因为这些特定的幼猫并未表现出那些行为。因此，即使对在多个时间点记录的总共28个行为收集了数据，但仅能客观地评估笼踱步、笼抓、笼凌乱和过度喵喵叫(表4和5)以进行组间的统计学比较。最终使用的行为评分量规可能没有获得足够的数据来评估总体应激或放松，因为我们仅使用了一个45分钟的时间段并且没有在一天中其他23小时观察幼猫。因此，尽管笼应激期明显导致幼猫在被观察时的急性应激，但我们不知道幼猫在一天中的其他23小时的行为。当观察者不在房间里时，他们可能没有表现出应激行为，因此没有经历长时间的应激。所有幼猫都保留了整齐的毛皮，适当地吃并且增加重量，并且没有观察到相关的腹泻和呕吐。

虽然在具有安慰剂扩散器的房间内，笼踱步、笼抓、笼凌乱和过度喵喵叫通常在数值上更大，但考虑到个体幼猫的变化，安慰剂扩散器组中笼踱步的增加仅在一个时间点接近统计学显著性(表5)。此外，虽然在单变量分析中在每个笼养期间和组合的笼养期中，安慰剂扩散室中的猫的总应激得分显著更高，但是当针对个体幼猫变化调整分析时，这种差异消失。在多变量分析中找不到组之间的差异可能仅仅是由于样本量有限。

重新激活FHV-1所需的应激量、类型、频率和持续时间仍不清楚。上呼吸道疾病(URTD)是避难所中的常见现象，随着在避难所中的停留时间增加，患URTD的概率逐渐增加。一项研究发现，超过80％的猫在避难所中在第14天之前发生了URTD。然而，避难所使猫和幼猫暴露于多个变量，包括应激和集体环境，其可能同时导致URTD和临床症状。我们的研究主要试图通过居所改变和静脉穿刺来改变压力，以评估对FHV-1复发的影响。

虽然所有皮质醇浓度均保持在参考实验室的正常范围内，但两组猫的应激期之前和研究结束时的皮质醇浓度之间存在显著差异，表明应激随着时间的推移而发生。此外，除了居所变化之外，研究中还有其他事件可能与应激相关，包括血液采集、目击其他幼猫在采血期间的痛苦以及喂养时间的偶然变化。^11,23,52-55此外，安慰剂组中的幼猫总是先被评分，信息素扩散器组中的幼猫可能听到幼猫-人类的互动，导致另外45分钟的激动，可能是紧张的。这些潜在的混杂因素应在未来的研究中加以解决。

在许多测量中，组之间的差异可能是由于样本量小，这将受到幼猫之间的应激响应的个体差异的影响。即使暴露在相同的应激下，个体也会在应激响应方面经历广泛的变化。动物的不同之处不仅在于它们对压力的外在行为响应，还在于它们的个性、神经生理学和免疫响应。²⁰因此，我们的幼猫对应激的响应的个体差异也可能导致FHV-1的重新激活和外在临床症状的个体差异，因为个体之间的应对机制和应对效率不同。

在本研究的幼猫中，放松状态的最佳指标被认为是在45分钟观察期结束时的睡眠(SS4)。作者相信，SS4时间点是真正睡眠的可靠指标，因为它记录了幼猫***衡期间、在房间活动期间(包括评分)、当观察者第一次进入房间时或者听到房间外的设施噪声时，不会发生睡眠。此外，在每次睡眠发生期间，幼猫的身体姿势放松，闭眼。当45分钟的观察时间结束，并且观察员从地板上起身离开房间时，所有幼猫都被唤醒，有时伸懒腰，并且再次从观察者那里积极寻求关注。这也支持我们对这种行为作为真正放松状态的指标的评估。在扩散器就位之后，在具有信息素扩散器的房间中观察到睡眠频率逐渐增加(表7)。“假睡眠”已被用作猫(尤其是避难所和笼养猫)的应激指标，并且它已被描述为例如动物园中圈养猫的防御性睡眠姿势。然而，这里似乎没有一个代表假睡眠。

结论。总的来说，数据支持在安慰剂扩散器房间中的幼猫中与FHV-1相关的打喷嚏的重新激活或维持，与之不同的是暴露于信息素组合物的幼猫中打喷嚏的发生率显著降低。与安慰剂扩散器房间相比，信息素扩散器房间中的幼猫在观察期结束时睡眠增加所证明的应激减少和松弛增加的证据支持了暴露于信息素减少与FHV-1相关的应激和打喷嚏的假设。