阅读说明：本技术 一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的结构开关型核酸适配体 (rapid screening method of aptamer based on crosslinking reaction and structure switch type aptamer obtained through screening ) 是由 娄新徽 乔娜 吴晓 刁冬林 于 2018-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选新方法及其通过该方法筛选获得的人血清白蛋白的结构开关型核酸适配体。本方法中靶标与核酸适配体文库进行均相孵育,然后通过交联反应将靶标捕获在磁珠上,这样与靶标结合的核酸序列被捕获在磁珠上；将磁性分离出来的与靶标结合的核酸序列通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增；将双链PCR产物进行单链制备得到次级文库,次级文库进入下一轮的筛选。将上述过程循环2-3轮可以实现对文库的快速富集。该方法还可以与其它筛选技术联用,大幅提高筛选效率。按照本方法经3轮富集后的文库仅经过1轮基于文库固定的筛选方法就得到了具有高亲和力和选择性的HSA的SSA。(The invention relates to a novel method for rapidly screening aptamer based on cross-linking reaction and a structural switch type aptamer of human serum albumin obtained by screening through the method. In the method, a target and a nucleic acid aptamer library are subjected to homogeneous incubation, and then the target is captured on magnetic beads through a cross-linking reaction, so that a nucleic acid sequence combined with the target is captured on the magnetic beads; amplifying the magnetically isolated target-bound nucleic acid sequence by Polymerase Chain Reaction (PCR); and (3) carrying out single-chain preparation on the double-chain PCR product to obtain a secondary library, and screening the secondary library in the next round. The process is circulated for 2-3 rounds to realize the rapid enrichment of the library. The method can be used together with other screening technologies, so that the screening efficiency is greatly improved. According to the method, the library after 3 rounds of enrichment is subjected to only 1 round of screening method based on library fixation to obtain SSA of HSA with high affinity and selectivity.)

一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得 的结构开关型核酸适配体

技术领域

本发明涉及一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的人血清白蛋白的结构开关型核酸适配体，属于生物技术领域。

背景技术

核酸适配体的筛选技术，即富集配体进化技术(Systematic Evolution ofLigandsby Exponential Enrichment，SELEX)(Nature,1990,346(6287),818-822；Science,1990,249(4968),505-510.)是一种以体外合成文库、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以及测序等技术为基础建立的核酸适配体体外筛选技术。SELEX技术的基本原理是将寡聚核苷酸(DNA或者RNA)文库与特定的靶标分子进行孵育，通过分离技术将与靶标分子结合的寡聚核苷酸分离出来，通过PCR技术进行指数扩增，将得到的产物进行单链制备得到次级文库，将次级文库作为下一轮的起始文库重新开始新一轮的筛选。通过多轮的筛选过程，最终获得具有高亲和力、高特异性的核酸适配体。

SELEX技术自提出以来，在多个领域得到了广泛的应用。然而传统的SELEX技术操作繁琐，筛选周期较长。为了加快核酸适配体的筛选过程，近些年来发展了多种改进的SELEX技术，缩短了筛选周期。这些改进技术多是通过对SELEX过程中的分离步骤进行改进，将传统的基于亲和柱或者醋酸纤维素膜的分离技术用更为高效或者便捷的分离方式替代。这些改进的方法包括：磁珠分离(Nucleic Acids Research 2003,31(18),e110-e118.)、毛细管电泳技术(Analytical Chemistry 2004,76(18),5387-5392.)、凝胶电泳技术(Nucleic Acids Research 2005,33(17),e141-e147.)、微流控芯片法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009,106,2989-2994.)、表面等离子体共振技术(Analytical Biochemistry 2005,342(2),312-317.)。尽管近些年来多种核酸适配体筛选技术不断出现，但是核酸适配体的筛选依然富有挑战性，常常面临筛选失败的问题，迫切需要新的筛选技术。

在目前的各种核酸适配体筛选技术当中，基于靶标固定的方法由于其操作便捷，应用最为广泛。但是固定靶标分子的核酸适配体筛选方法中固相基质存在严重的非特异性吸附，靶标在固相表面固定还会掩蔽靶标的结合位点，影响靶标的构象，具有很大的不确定性。这些因素都会造成核酸适配体筛选效率低，甚至失败。均相核酸适配体的筛选方法避免了此类问题，不需要将靶标分子固定到固相介质上，而是将文库直接与靶标分子在溶液中孵育，随后进行分离。由于筛选过程中靶标分子处于自由的游离状态，与实际样品中所处的状态相同，因而通过均相筛选技术获得的核酸适配体理论上更加适合于后期的应用。目前均相的核酸适配体筛选技术包括毛细管电泳法(Journal of the American ChemicalSociety 2005,127(9),3165-3171.)、硝化纤维素膜分离法(Journal of GeneralVirology 2006,87(3),479-487.)、离心分离法(International Journal forParasitology 2003,33(12),1309-1317.)、凝胶电泳分离法(Chemistry&Biology 1995,2(11),741-750.)以及氧化石墨烯的分离法(Chemical Communications 2014,50(72),10513-10516.)等。

尽管均相核酸适配体的筛选方法克服了传统固定靶标分子的核酸适配体筛选方法的问题，但仍有一定的缺陷。比如，毛细管电泳法需要特殊的设备和专业化的人员，高电压也会影响靶标蛋白的性质；膜分离、离心分离和电泳分离的分离效率低，会导致筛选效率低；石墨烯分离的分离效率受靶标的物理性质影响很大，难于控制。急需开发操作更简单、分离效率更高和更容易控制的均相核酸适配体筛选技术。

另外，结构开关型核酸适配体(SSA)在生物传感领域应用广泛，但是目前筛SSA的方法效率低(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,14053-14058.)，需要15-20个筛选循环，而且获得的核酸适配体选择性差、亲和力低，急需开发高效的SSA筛选技术。

发明内容

本发明目的是提供一种基于交联反应的核酸适配体快速筛选新方法，并通过该方法筛选获得的人血清白蛋白的SSA。

本发明提供一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法，该方法包括如下步骤：步骤1、文库热处理；步骤2、活化磁珠；步骤3、磁珠负筛选；步骤4、文库与靶标孵育；步骤5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列；步骤6、磁珠上结合核酸的洗脱；步骤7、PCR；步骤8、单链DNA制备。

其中将上述步骤1-8循环2-3轮以实现对文库的快速富集。

在上述方法中，

步骤1、文库热处理如下：取适量文库于缓冲溶液中进行热处理：95℃水浴加热，冰浴猝冷，放置室温；

步骤2、活化磁珠如下：将羧基修饰的磁珠用N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，生成NHS活性酯修饰的磁珠；

步骤3、磁珠负筛选如下：取部分步骤2制备的NHS活化磁珠与步骤1中的文库孵育，磁性分离，上清用于步骤4；

步骤4、文库与靶标孵育如下：在筛选缓冲液中将步骤3所收集的文库与靶标按照一定摩尔比混合、孵育；

步骤5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列如下：步骤2制备的NHS活化磁珠与步骤4中的文库和靶标混合液孵育、磁性分离，清洗磁珠；

步骤6、磁珠上结合核酸的洗脱如下：将一定量蛋白酶K与步骤5得到的磁珠孵育，或者将步骤5得到的磁珠加缓冲溶液加热，孵育，收集上清液；

步骤7、PCR如下：将步骤6所得到的洗脱液进行PCR，乙醇沉淀法纯化PCR产物；

步骤8、单链DNA制备如下：使用λ噬菌体核酸外切酶进行单链制备，乙醇沉淀法纯化λ噬菌体核酸外切酶酶切产物，紫外定量每轮产物，所获得的单链DNA文库为次级文库，该次级文库进入下一轮的筛选或进行克隆测序。

在上述中还包括以下步骤：

(1)将上述步骤1-8循环2-3轮以实现对文库的快速富集而形成的富集文库与生物素修饰的与文库中间固定序列互补的探针杂交孵育；

(2)将(1)形成的双链文库固定在链霉亲和素包被的磁珠上；

(3)文库固定磁珠与靶标孵育，孵育结束后，磁性分离，收集上清液；

(4)PCR：将(3)所得到的上清液进行PCR，乙醇沉淀法纯化PCR产物；

(5)克隆测序；

(6)选取代表性富集序列进行化学合成；

(7)对化学合成的序列进行亲和力、选择性和功能性测试。

另一方面，本发明提供一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法，该方法包括：基于交联反应的均相Tb核酸适配体的第一轮筛选，基于交联反应的均相Tb核酸适配体的第二轮筛选，基于靶标固定磁珠法的Tb核酸适配体的第三轮筛选以及基于磁珠法的Tb核酸适配体的第四轮筛选，

其中所述第一轮筛选包括如下步骤：

(1)起始DNA文库热处理；

(2)文库与Tb孵育；

(3)活化磁珠；

(4)磁珠与DNA-Tb复合物孵育；

(5)DNA洗脱；

(6)小规模PCR，获得凝胶电泳结果图；

(7)根据(6)凝胶电泳结果图，选择出最佳扩增轮数后，对(5)中所得到的所有样品进行PCR扩增；

(8)PCR反应结束后，将所得样品两两混合，使得每组样品体积均为200μL，进行乙醇沉淀；

(9)小规模λExo酶切；

(10)大规模λExo酶切；

(11)乙醇沉淀λExo酶切产物，操作过程同(8)；

(12)紫外定量，

其中所述第二轮筛选包括如下步骤：

(1)上述富集DNA文库热处理；

(2)文库与Tb孵育、活化磁珠、磁珠与DNA-Tb复合物孵育、DNA洗脱、PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第一轮筛选；

其中所述第三轮筛选包括如下步骤：

(1)活化磁珠；

(2)将Tb偶联到磁珠表面；

(3)蛋白包被的磁珠与富集文库孵育；

(4)DNA洗脱；

(5)PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第一轮筛选，

其中所述第四轮筛选包括如下步骤：

(1)活化磁珠、将Tb偶联到磁珠表面均参照第三轮筛选(1)(2)操作；

(2)包被蛋白的磁珠与DNA孵育；

(3)DNA的洗脱、PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第三轮筛选。

在上述方法中还包括如下步骤：克隆测序以及选取代表性序列进行化学合成和亲和力测定。

再一方面，本发明提供一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法，该方法包括：基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第一轮筛选，基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第二轮筛选，基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第三轮筛选以及基于文库固定的SSA第四轮筛选，

其中所述第一轮筛选包括如下步骤：

(1)起始DNA文库热处理；

(2)活化磁珠；

(3)磁珠负筛选；

(4)文库与HSA孵育；

(5)文库与HSA孵育期间进行活化磁珠；

(6)DNA洗脱；

(7)PCR；

(8)用UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒对第一轮筛选产物进行切胶纯化；

其中所述第二轮筛选包括如下步骤：

(1)起始DNA文库热处理；

(2)活化磁珠；

(3)磁珠负筛选；

(4)文库与HSA孵育；

(5)文库与HSA孵育期间进行活化磁珠；

(6)DNA洗脱；

(7)PCR；

(8)切胶纯化；

(9)λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量，

其中所述第三轮筛选包括如下步骤：

本轮除投入0.048nmol第二轮富集文库，其余操作步骤均与所述第二轮筛选相同，

其中所述第四轮筛选包括如下步骤：

(1)对第三轮产物进行杂交；

(2)清洗磁珠；

(3)文库固定磁珠；

(4)文库固定磁珠与HSA孵育；

(5)PCR、乙醇沉淀法纯化PCR产物、UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物、使用λExo进行单链生成、乙醇沉淀法纯化λExo酶切产物、紫外定量。

在上述方法中还包括如下步骤：克隆测序；选取代表性序列进行化学合成和亲和力测定以及选择性和功能性测试。

又一方面，本发明提供一种根据上述任意一种方法筛选获得的结构开关型核酸适配体。所述该结构开关型核酸适配体为Tb－1、Tb－2、Tb－3、Tb－4、HSA－1、HSA－2、HSA－3、HSA－4、HSA－5或HSA－6。

本发明的具体实验步骤

本发明方法的一个筛选流程包括下面步骤：

1、文库热处理：取适量文库于缓冲溶液中进行热处理：95℃水浴加热，冰浴猝冷，放置室温。

2、活化磁珠：将羧基修饰的磁珠用N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)进行活化，生成NHS活性酯修饰的磁珠。

3、磁珠负筛选：取部分步骤2制备的NHS活化磁珠与步骤1中的文库孵育，磁性分离，上清用于步骤4。

4、文库与靶标孵育：在筛选缓冲液中将步骤3所收集的文库与靶标按照一定摩尔比混合、孵育。

5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列：步骤2制备的NHS活化磁珠与步骤4中的文库和靶标混合液孵育、磁性分离，清洗磁珠。

6、磁珠上结合核酸的洗脱：将一定量蛋白酶K与步骤5得到的磁珠孵育，或者将步骤5得到的磁珠加缓冲溶液加热，孵育，收集上清液。

7、PCR：将步骤6所得到的洗脱液进行PCR，乙醇沉淀法纯化PCR产物。

8、单链DNA制备：使用λ噬菌体核酸外切酶(λExo)进行单链制备，乙醇沉淀法纯化λExo酶切产物，紫外定量每轮产物。所获得的单链DNA文库为次级文库，该次级文库进入下一轮的筛选或进行克隆测序。

将上述步骤1-8循环2-3轮即可以实现对文库的快速富集。将富集文库进入下一阶段的核酸适配体的筛选，比如SSA的筛选。

SSA的筛选包括以下步骤：

(1)将上述富集文库与生物素修饰的与文库中间固定序列互补的探针杂交孵育；

(2)将(1)形成的双链文库固定在链霉亲和素包被的磁珠上；

(3)文库固定磁珠与靶标孵育，孵育结束后，磁性分离，收集上清液；

(4)PCR：将(3)所得到的上清液进行PCR，乙醇沉淀法纯化PCR产物；

(5)克隆测序；

(6)选取代表性富集序列进行化学合成；

(7)对化学合成的序列进行亲和力、选择性和功能性测试。

本发明的方法具有如下优势：

1、本发明方法无需靶标的固相固定，克服了现有筛选技术中靶标固定住固相上的缺陷，避免了表面固定掩蔽靶标结合位点和影响靶标构象的问题，也同时大幅减小了固相介质对文库的非特异性吸附，非常有利于加快核酸适配体的筛选效率；

2、本发明方法通过磁性分离技术将与靶标结合的核酸序列分离出来，无需昂贵或者特殊的设备，操作简单快捷，无需任何条件优化；

3、本发明方法可以用于文库的预富集，加快现有核酸适配体的筛选技术的效率和成功率；

4、本发明方法可以用于SSA的快速筛选，所获得的SSA选择性高，亲和力强。

附图说明

图1是本发明方法的原理图。

图2是本发明实施例1中所采用的现有技术中基于靶标固定的核酸适配体磁珠筛选法的流程图。

图3是本发明实施例1筛选所得的凝血酶核酸适配体Tb-2的亲和力测试图。

图4是本发明实施例2中所采用的基于文库固定的SSA筛选流程图。

图5是本发明使用实时定量PCR技术(RT-PCR)测定的实施例2中前三轮基于交联反应的均相筛选的洗脱百分比；洗脱百分比是文库中与靶标结合的核酸序列在总投入文库中所占的比例。

图6A和图6B是本发明使用RT-PCR测定的实施例2中SSA筛选中各磁珠清洗和与靶标蛋白孵育后的上清中的核酸占总投入文库的比例(图6A)以及背景与靶标孵育液中核酸的解链温度图(图6B)。

图7是本发明实施例2筛选所得的HSA核酸适配体HSA-6的亲和力测试图。

图8A和图8B是本发明对HSA-6进行结构开关性能和特异性测试:荧光方法(图8A)与凝胶电泳方法(图8B)；图8A中所测定的是磁性分离后上清液的荧光强度；图8B与不同靶标孵育后的磁性分离后上清液的凝胶电泳图。

具体实施方式

图1是本发明方法的原理图。如图1所示，每个筛选循环包括1.文库热处理；2.活化磁珠，生成NHS活性酯修饰的磁珠；3.磁珠负筛选：NHS活化磁珠与1中的文库孵育，磁性分离，去掉与活化磁珠结合的核酸序列；4.文库与靶标孵育；5.通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列；6.磁珠上结合核酸的洗脱：热洗脱或者蛋白酶K水解靶标实现核酸洗脱；7.PCR；8.单链DNA的制备。

图2是本发明实施例1中所采用的现有技术中基于靶标固定的核酸适配体磁珠筛选法的流程图。如图2所示，每个筛选循环包括1.活化磁珠；2.将靶标固定在磁珠上；3.文库与包被蛋白的磁珠孵育；4.蛋白酶K洗脱磁珠上结合的核酸；5.PCR；6.λExo单链DNA制备。图3是本发明实施例1筛选所得的凝血酶核酸适配体Tb-2的亲和力测试图。

图4是本发明实施例2中所采用的基于文库固定的SSA筛选流程图。如图4所示，每个筛选循环包括1.文库与中间互补序列杂交；2.杂交链固定在磁珠上；3.固定杂交链的磁珠与靶标孵育；4.PCR；5.λExo单链制备。图5是本发明使用实时定量PCR技术(RT-PCR)测定的实施例2中前三轮基于交联反应的均相筛选的洗脱百分比；洗脱百分比是文库中与靶标结合的核酸序列在总投入文库中所占的比例。

图6A和图6B是本发明使用RT-PCR测定的实施例2中SSA筛选中各磁珠清洗和与靶标蛋白孵育后的上清中的核酸占总投入文库的比例(图6A)以及背景与靶标孵育液中核酸的解链温度图(图6B)。图7是本发明实施例2筛选所得的HSA核酸适配体HSA-6的亲和力测试图。图8A和图8B是本发明对HSA-6进行结构开关性能和特异性测试:荧光方法(图8A)与凝胶电泳方法(图8B)；图8A中所测定的是磁性分离后上清液的荧光强度；图8B与不同靶标孵育后的磁性分离后上清液的凝胶电泳图。

实施例1.利用基于交联反应的均相凝血酶核酸适配体快速筛选方法筛选人凝血酶(Tb)核酸适配体。

1.基于交联反应的均相Tb核酸适配体的第一轮筛选

下面的筛选步骤如图1所示：

(1)起始DNA文库热处理：取5微升(μL)100微摩尔每升(μM)的P-Tb序列(表1)，加入到1×Tbb-2(1倍的凝血酶结合缓冲液-2:50毫摩尔每升(mM)4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、100mM NaCl、1mM MgCl₂、5mM KCl、1mM CaCl₂,pH7.4)溶液中，使溶液的总体积为490μL。95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷5分钟，放置室温5分钟。

(2)文库与Tb孵育：向热处理过的DNA文库中加入1微克(μg)Tb，室温下孵育1小时。

(3)活化磁珠：取10μL混合均匀的磁珠放置于1.5毫升(mL)离心管中，用25mM 100μL的2-(N-***啉)乙磺酸(MES)溶液清洗三次。用冷的25mM的MES溶液新鲜配制50毫克/毫升(mg/mL)的EDC溶液和50mg/mL的NHS溶液各100μL。向清洗后的磁珠中先加入50μL的新鲜配制的EDC溶液混匀，接着加入50μL新鲜配制的NHS溶液混匀。将离心管放置于旋转混合仪上室温低速旋转30分钟。旋转结束后将装有磁珠的离心管放置在强力磁铁上静置4分钟，移去上清液。活化后的磁珠用100μLMES溶液清洗四次。然后加入10μL1×Tbb-2溶液。

(4)磁珠与DNA-Tb复合物孵育：将活化后的磁珠全部加入到DNA-Tb孵育后的溶液中，总体积为500μL，室温下孵育35分钟。

(5)DNA洗脱：孵育结束后弃上清液，留磁珠，向磁珠中加入1.8μL蛋白酶K(20mg/mL)，用1×Tbb-2定容至120μL，放置于52℃的恒温箱中2小时。反应结束后得到120μL洗脱液，在90℃下加热20分钟，使蛋白酶K失活。

(6)小规模PCR：取8个200μL的离心管，在管壁上分别标记上Blank 10，Blank15，Blank 20，Blank 25，PCR 10，PCR 15，PCR 20，PCR 25，在标有Blank的离心管中，按顺序依次加入6μL无核酸酶水，2μL 10μMFP-Tb(表1),2μL10μM5’-PO₄-RP-Tb(表1)以及10μL 2×PremixHot Start。在标有PCR的离心管中，按照顺序依次加入4μL无核酸酶水，2μL 10μMFP-Tb(表1),2μL 10μM5’-PO₄-RP-Tb(表1),10μL 2×PremixHot Start以及2μL从(5)中得到的产物。并按照如下程序设定PCR仪器：预解链处理95℃，1分钟(min)；25个循环：95℃30s，45℃30s，72℃30秒(s)；72℃，2min；4℃6min。运行程序时，设定样品加热体积为20μL，当仪器运行到第10，15，20，25轮的延伸步骤的20s时，暂停程序，打开仪器盖取出相应标编号的管子，放置在4℃保存，然后继续运行程序，直至反应结束。

制备12％变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，在200μL离心管中依次4.8μL无核酸酶水，6μL2倍的RNA上样液以及1.2μL PCR产物，混匀。在95℃下热处理10分钟，冰浴5分钟。随后将热处理过后的样品加入垂直电泳系统，在170伏(V)电压下进行预电泳和电泳，电泳液为1×TBE缓冲液，电泳时间为45分钟。电泳后凝胶用gold核酸染料于1×TBE缓冲液进行染色10分钟，用凝胶成像系统拍摄电泳照片。

(7)根据(6)凝胶电泳结果图，选择出最佳扩增轮数后，对(5)中所得到的所有样品进行PCR扩增。准备200μL离心管若干，在每个离心管中分别加入20μL无核酸酶水，10μL 10μM FP-Tb(表1),10μL 10μM 5’-PO₄-RP-Tb(表1)，50μL 2×PremixHot Start以及10μL从(5)中得到的产物。并按照如下程序设定PCR仪器：预解链处理95℃，1min；25个循环：95℃30s，45℃30s，72℃30s；72℃，2min；4℃6min。运行程序时，设定样品加热体积为100μL。

(8)PCR反应结束后，将所得样品两两混合，使得每组样品体积均为200μL。按照如下操作进行乙醇沉淀：

①加入15μL体积的醋酸钠(3M,pH5.2)溶液，混合均匀。

②加入4μL DNA mate溶液，混合均匀。

③加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，混合均匀。

④4℃，15000转，离心20分钟，小心吸弃上清液，留白色沉淀。

⑤加入-20℃预冷70％乙醇溶液400μL，上下颠倒洗涤沉淀。

⑥4℃，15000转，离心5分钟，小心吸弃上清液，留白色沉淀，重复洗涤3次。

⑦开盖、封口膜扎孔，在40℃下使乙醇挥发，至白色沉淀变为透明，-20℃冷藏。

(9)小规模λExo酶切

每管乙醇沉淀纯化产物加入100μL无核酸酶水溶解。酶切样品(总体积20μL)：PCR纯化产物5μL；2μL 10倍的反应缓冲液；0酶单位(U)，1U，2U，3U和5UλExo；加不同体积无核酸酶水至20μL。酶切反应条件：37℃30分钟；85℃反应15分钟灭活；4℃10分钟。产物放入4℃冰箱待用。

凝胶电泳条件：电泳上样总体积10μL，12％非变性PAGE，酶切产物5μL，10倍的DNA上样缓冲液1μL，无核酸酶水4μL。通过垂直电泳系统在150V电压下进行预电泳和电泳，电泳液为1×TBE缓冲液，电泳时间为45分钟。电泳后凝胶用gold核酸染料于1×TBE缓冲液进行染色10分钟，用凝胶成像系统拍摄电泳照片。

(10)大规模λExo酶切

选择能够完全产生单链DNA的λExo最小量用于大规模λExo酶切反应，反应按比例放大。例如：如果2U是所需的λExo的最小量，则混合50μL(9)中乙醇沉淀产物，10μL10倍的反应缓冲液，38μL无核酸酶水和2μL 10U/μL的λExo进行酶切反应。

(11)乙醇沉淀λExo酶切产物，操作过程同(8)。

(12)紫外定量

将乙醇沉淀后的λExo酶切产物用110μL无核酸酶水溶解，充分震荡混匀，取10μL产物稀释至100μL，通过紫外测定样品在260纳米(nm)处的吸光度。

2.基于交联反应的均相Tb核酸适配体的第二轮筛选

(1)上述富集DNA文库热处理：取0.1纳摩尔(nmol)的第一轮产物，加入到1×Tbb-2中，使溶液的总体积为490μL。95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷5分钟，放置室温5分钟。

(2)文库与Tb孵育、活化磁珠、磁珠与DNA-Tb复合物孵育、DNA洗脱、PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第一轮筛选。

3.基于靶标固定磁珠法的Tb核酸适配体的第三轮筛选

下面的筛选步骤如图2所示：

(1)活化磁珠：将装有磁珠的玻璃瓶混匀。吸取20μL磁珠与100μL，25mM的MES溶液(pH5.0)充分混合10分钟后再清洗两次。用25mM的MES溶液溶解EDC，新鲜制备50mg/mL的EDC溶液。用25mM的MES溶液溶解NHS，新鲜制备50mg/mL的NHS溶液。加60μL的上述EDC溶液和60μL的上述NHS溶液于洗过的磁珠中，充分混匀，室温下低速振摇30分钟。将离心管放置于强力磁铁上4分钟，移去上清液后用200μL，25mM的MES溶液清洗2次。

(2)将Tb(或牛血清蛋白(BSA))偶联到磁珠表面：向活化后的磁珠中加入5μg Tb(或者5μgBSA作为负筛蛋白)，加入25mM的MES溶液,使溶液最终体积为300μL，充分混匀,在室温下孵育30分钟。在强力磁体上放置4分钟，分离上清与磁珠。用100μL1×Tbb-1(1倍的凝血酶结合缓冲液-1:50mM Tris、100mM NaCl、1mM MgCl₂、5mM KCl、1mM CaCl₂,pH7.4)清洗3次，最后将磁珠悬浮在20μL1×Tbb-1中。

(3)蛋白包被的磁珠与富集文库孵育:取0.08nmol上述第二轮富集文库，加入到1×Tbb-1中，使溶液的最终体积为490μL，混合均匀，分装到5个薄壁离心管中进行热处理：95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷10分钟，放置室温10分钟。在上述溶液中加入10μLBSA包被的磁珠，充分混匀，在室温下孵育1小时。孵育结束后，通过磁性分离将磁珠和上清液分开，在上清液中加入10μLTb包被的磁珠，充分混匀，在室温下孵育1小时。

(4)DNA洗脱：孵育结束后弃上清液，留磁珠。向磁珠中加入200μL1×Tbb-1后，置于旋转混合仪上充分混合5分钟，置于强力磁铁上3分钟，重复清洗4次。向清洗后的磁珠中加入1.8μL蛋白酶K(20mg/ml)，用1×Tbb-1定容至120μL，放置于52℃的恒温箱中2小时(每隔半小时需用枪混匀一次)。反应结束，在90℃下加热20分钟，使蛋白酶K失活。磁性分离后得到120μL洗脱液。

(5)PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第一轮筛选。

4.基于磁珠法的Tb核酸适配体的第四轮筛选：

(1)活化磁珠、将Tb偶联到磁珠表面均参照第三轮筛选(1)(2)操作。

(2)包被蛋白的磁珠与DNA孵育：取0.5nmol第三轮富集文库，加入到1×Tbb-1溶液中，使溶液的最终体积为490μL，混合均匀，分装到5个薄壁离心管中进行热处理：95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷10分钟，放置室温10分钟。在上述溶液中加入10μL BSA包被的磁珠，充分混匀，在室温下孵育1小时。孵育结束后，通过磁性分离将磁珠和上清液分开，在上清液中加入10μL Tb包被的磁珠，充分混匀，在室温下孵育1小时。

(3)DNA的洗脱、PCR、λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照第三轮筛选。

5.克隆测序；

6.选取代表性序列进行化学合成和亲和力测定：

(1)活化磁珠：吸取140μL磁珠进行活化，其他操作过程同本实施例第一轮筛选步骤(1)。

(2)将Tb偶联到磁珠表面：向活化后的磁珠中加入25mM的MES溶液(pH5.0)，然后加入14μg Tb，使溶液最终体积为400μL，充分混匀,在室温下培养30分钟。在强力磁体上放置4分钟，移去上清液300μL。

(3)清洗磁珠：用含20％Tween 20的1×PBS溶液200μL清洗4次，将磁珠悬浮在140μL1×Tbb-1中。

(4)连有Tb的磁珠与DNA进行孵育：用1×Tbb-1稀释Tb-2(表2)，稀释后DNA的体积为490μL，浓度依次为1皮摩尔每升(pM)、100pM、1纳摩尔每升(nM)、10nM、20nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM，用封口膜封好口，95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷5分钟，放置室温5分钟。向处理好的DNA溶液中分别加入10μLTb包被的磁珠，充分混匀，在室温下孵育1小时。用1×Tbb-1冲洗磁珠4次，每次用量200μL。清洗结束后，向磁珠中加入1.8μL蛋白酶K(20mg/ml)，用1×Tbb-1定容至120μL，放置于52℃的恒温箱中2小时。反应结束后得到120μL洗脱液，在90℃下加热20分钟，使蛋白酶K失活。(注：清洗磁珠时优选地将溶液在强磁铁上放置至少3分钟，尽量将上清液全部取走。)

(5)RT-PCR测定洗脱液中DNA的数量。配制标准曲线：用无核酸酶水将100μM的Tb-2(表2)溶液逐级稀释，得到最终浓度分别为10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、0.1pM的标准溶液。在200μLPCR管中依次加入3μL无核酸酶水，2μL 10μMFP-Tb,2μL 10μM5’-PO₄-RP-Tb，10μL 2×Premix Taq Hot Start以及3μL稀释100倍后的DNA洗脱液(或者3μLTb-2的标准溶液，或者3μL无核酸酶水)，离心2秒。每个样品准备三个平行组，同时进行RT-PCR。

经过前两轮的基于交联反应的均相筛选和两轮基于靶标蛋白固定的传统的基于磁珠的筛选，第四轮的富集文库进行了克隆测序。在测得的51条序列均富含大量的腺嘌呤和胸腺嘧啶。其中有四条序列出现了两次(表2)。高度富集的序列特征说明本发明的方法能够实现文库的快速富集。为了进一步验证是否获得具有较高亲和力的核酸适配体，我们将Tb-2进行了化学合成，对其进行解离常数的测定。如图3所示，基于RT-PCR技术测定的Tb-2的解离常数为135±29纳摩(nM)。该实施例表明，本发明的方法可以加快传统磁珠核酸适配体筛选方法的效率，仅需4轮筛选就得到具有纳摩尔级高亲和力的核酸适配体。

实施例2.交联反应均相筛选大幅加快结构开关型核酸适配体(SSA)的筛选：以人血清白蛋白(HSA)的筛选为例。

1.基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第一轮筛选

下面的筛选步骤如图1所示：

(1)起始DNA文库热处理：取5μL 100μM的pool₀序列(表1)，加入到1×Tbb-2中，使溶液的总体积为490μL。95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷5分钟，放置室温5分钟。

(2)活化磁珠：操作同实施例1第一轮筛选步骤(3)基本相同，除去最后磁珠用100μL 25mM的MES溶液清洗2次后，加入10μL 1×Tbb-2，使磁珠分散在该溶液中。

(3)磁珠负筛选：将活化后的磁珠全部加入到热处理过的DNA溶液中，总体积为500μL，室温下孵育30分钟。

(4)文库与HSA孵育：去掉磁珠，取上清液，加入1μg HSA，室温下孵育1小时。

(5)活化磁珠(文库与HSA孵育期间进行)：操作条件与实施例1第一轮筛选步骤(3)基本相同，除去最后磁珠用100μL 25mM的MES溶液清洗2次后，加入10μL含有0.1％Tween-20的1×Tbb-2溶液，使磁珠分散在该溶液中。

(6)DNA洗脱：孵育结束后弃上清液，留磁珠。向磁珠中加入溶液:200μL 1×Tbb-2后，置于旋转混合仪上充分混合5分钟，置于强力磁铁上3分钟，取出上清(切记保留上清液，用于后续RT-PCR监控)，重复清洗4次。向清洗后的磁珠中加入1.8μL蛋白酶K(20mg/ml)，用1×Tbb-2定容至120μL，放置于52℃的恒温箱中2小时(每隔半小时需用枪混匀一次)。反应结束，磁性分离后得到120μL洗脱液，在90℃下加热20分钟，使蛋白酶K失活。

(7)其他操作条件同实施例1第一轮筛选步骤(6)—(12)

(8)用UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒对第一轮筛选产物进行了切胶纯化:

UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒操作步骤如下：

①.通过PAGE电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。(尽可能多地去掉不含目标DNA的PAGE胶，每管胶块不要超过400毫克(mg)，否则导致溶胶不完全)

②.根据胶块的重量和浓度，按每100mg PAGE胶(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加200μL的比例加入扩散缓冲液，然后用枪头将泡在溶液当中的胶块捣碎。

③.将离心管置于55℃水浴2小时，间或混匀，以促进胶中DNA扩散到溶液中。

④.将上述溶液10,000转离心10分钟。

⑤.将上清转移到一个干净的1.5ml离心管中，依次加入5倍体积结合缓冲液II和3倍体积的100％的异丙醇，充分混匀。

⑥.将上述溶液全部移入吸附柱，室温放置2分钟，8,000转离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。(如果溶胶液总体积大于750μL，则每次使用750μL，多次上柱。)

⑦.向吸附柱中加入500μL洗脱液，10,000转离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

⑧.重复步骤⑦一次。

⑨.将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000转离心2分钟。

⑩.将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50μL无核酸酶水，室温静置1-2分钟，12,000转离心1分钟。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

验证切胶产物：12％变性PAGE，每块凝胶电泳上每个上样孔的上样量为10μL：marker 1μL/切胶前乙醇沉淀产物稀释1000倍1μL/切胶后产物1μL，2倍RNA上样液5μL，无核酸酶水4μL，其它操作条件同实施例1第一轮筛选(7)。

2.基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第二轮筛选

(1)起始DNA文库热处理：取0.029nmol第一轮富集文库，加入到1×Tbb-2中，使溶液的总体积为490μL。95℃水浴加热10分钟，冰浴猝冷5分钟，放置室温5分钟。

(2)活化磁珠、磁珠负筛选、文库与HSA孵育、活化磁珠、DNA洗脱同本实施例第一轮筛选步骤(2)—(6)。

(3)PCR、乙醇沉淀法纯化PCR产物均与实施例1第一轮筛选步骤(6)—(8)。

(4)切胶纯化：将乙醇沉淀得到的所有产物溶解于100μL无核酸酶水中，操作条件同本实施例第一轮筛选步骤(5)。

(5)λExo酶切、乙醇沉淀以及紫外定量均参照实施例1第一轮筛选步骤(9)—(12)。

3.基于交联反应的均相HSA核酸适配体的第三轮筛选

本轮除投入0.048nmol第二轮富集文库，其余操作步骤均与本实施例第二轮筛选相同。

4.基于文库固定的SSA第四轮筛选

下面的筛选步骤如图4所示：

(1)按以下体系进行杂交：100μL 0.44μM第三轮产物，1.3μL 169μMbiotin-EG18-c-pool(表1)，30μL5×结合洗脱液(50mM Tris，5mM EDTA，5MNaCl)，18.7μL无核酸酶水。进行热处理：95℃10分钟,缓冷到室温。

(2)清洗磁珠：将装有磁珠的玻璃瓶放在旋转混合仪上缓慢混匀10分钟。吸取44μL磁珠与100μL 1×结合洗脱液在1.5mL离心管中充分混合后，放在强力磁铁上静置3分钟，吸干上清液，再清洗两次。

(3)文库固定磁珠：与(1)中清洗后的磁珠孵育30分钟，孵育结束后，在强力磁体上放置3分钟，吸取上清液于1.5mL离心管中。用1×结合洗脱液(NaCl 1摩尔每升(M)—100mM)150μL清洗4次。

(4)文库固定磁珠与HSA孵育：向(3)中磁珠加入HSA(按体系中HSA浓度60nM加入，与文库浓度比是1:5),使溶液最终体积为150μL，充分混匀,在室温下培养1小时。反应体系：磁珠，4.5μL 2μM HSA，75μL 2×Tbb-1，70.5μL无核酸酶水。孵育结束后，在强力磁体上放置3分钟，吸取上清液于1.5mL离心管中。用200μL1×Tbb-1溶液清洗4次。

(5)PCR、乙醇沉淀法纯化PCR产物、UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物、使用λExo进行单链生成、乙醇沉淀法纯化λExo酶切产物、紫外定量的操作流程及步骤均与本实施例第三轮筛选相同。

5.克隆测序；

6.选取代表性序列进行化学合成和亲和力测定：与实施例1中步骤6基本相同，仅将Tb换为HSA，且HSA-6的浓度梯度为0nM、10nM、5nM、10nM、25nM、40nM、50nM、100nM、200nM。

7.选择性和功能性测试：

(1)按以下体系进行杂交：4.5μL1.23μM 5’端Cy3修饰的HSA-6(表2)，5μL 16.9μMbiotin-EG18-c-pool，90μL 5倍结合洗脱液，350.5μL无核酸酶水。进行热处理：95℃10分钟,缓冷到室温。

(2)吸取50μL磁珠进行清洗、文库固定磁珠，操作过程同本实施例第四轮筛选步骤(2)和(3)。

(3)文库固定磁珠与各类对比蛋白孵育：将(2)中磁珠等分为5份，分别加入800nMHSA、BSA、β-酪蛋白、链霉亲和素、小肽文库,使溶液最终体积为150μL，充分混匀,在室温下孵育1小时。孵育结束后，在强力磁体上放置3分钟，吸取上清液于1.5mL离心管中。

(4)测定(3)中所得上清液的荧光：打开荧光分光光度计，预热30分钟，设定实验参数为：激发狭缝宽度：10nm；发射狭缝宽度：10nm；激发波长：520nm；扫描范围：540-640nm。

前三轮均相筛选的文库富集情况通过RT-PCR实时监测(图5)。前三轮的文库的洗脱百分比分别是百分之0.001,0.6和0.018。经过1轮筛选，文库就富集了600倍，第二轮富集，文库的富集程度显著下降，但仍比起始文库高18倍。第四轮的SSA的筛选文库富集情况也通过RT-PCR实时监测，加入靶标的孵育液中核酸序列的数量是背景孵育液中的250倍(图6A)。而且靶标孵育液中核酸序列的解链温度比背景孵育液中的高3度(图6B)。这些结果表明具有结构开关性能的文库已经显著富集。随后将第四轮的富集文库进行克隆测序(表3)，文库序列出现明显富集。选择代表性序列HSA-6进行化学合成，亲和力测试。按照RT-PCR技术测得的HSA-6的亲和力为20±4nM(图7)。基于结构开关的荧光实验表明，该核酸适配体对链霉亲和素和小肽库具有高的选择性(15倍)；对β-酪蛋白和免疫球蛋白具有中等选择性(3倍)(图8A)。凝胶电泳实验也进一步证实在与HSA孵育的上清液中核酸的量远远大于与其它靶标孵育时的数量(图8B)，验证了所筛到的HSA核酸适配体的具有结构开关性能而且具有良好的选择性。

表1、本发明方法及实例中所使用的DNA序列

表2、实施例1中第四轮筛选产物克隆测序结果

表3、实施例2中第四轮筛选产物克隆测序结果

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都师范大学

<120> 一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的结构开关型核

酸适配体

<130> 180205CNF03IC

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 76

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(59)

<223> n is a, c, g, or t

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18

<400> 2

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 18

<220>

<221> misc_feature

<223> 5'端磷酸根修饰反向引物

<400> 3

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<213> Artificial

<220>

<223> 100

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(41)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(81)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 20

<400> 5

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 20

<220>

<221> misc_feature

<223> 5'端磷酸根修饰反向引物

<400> 6

ggcttctgga ctacctatgc 20

<210> 7

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 15

<220>

<221> misc_feature

<223> 5'端生物素及寡聚乙二醇修饰的与文库中部互补的捕获探针

<400> 7

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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ataccagctt attcaatt 18

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<212> DNA

<213> Artificial

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aagaatcgac gaatagtcat actcaccccc accaccccgt 40

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gcaggaacgt atgtccggaa tccagcgcgc cacctccccc 40

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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agatagtaag tgcaatct 18

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<212> DNA

<213> Artificial

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ctcctctgac tgtaaccacg 20

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<212> DNA

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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caaaacgcct gatatgagtt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 20

<400> 19

atcaatcgcg gacagggaac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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gacagacagc cgaaatacgg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 20

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ttgatgccta actatctaca 20

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<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 13

<400> 23

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<212> DNA

<213> Artificial

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<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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aattgcgtgg tctaatctgc 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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