阅读说明：本技术 一种信使rna的提取方法 (messenger RNA extraction method ) 是由 不公告发明人 于 2019-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种信使RNA的提取方法,其中,所述提取方法将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术转染至胚胎内,待生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术,获得纯化的信使RNA。本发明采用子宫内胚胎点转染技术和翻译核糖体亲和纯化技术相结合,根据大脑皮质不同板层神经元发育的时间特性,在特定时间和脑区上标记特定的神经元,并取发育过程中的不同时间点进行实验,以期取得发育期动态分子库构建翻译谱,为总结规律,发现特定关键因子,筛选有效基因打下坚实基础。(The invention discloses a method for extracting messenger RNA, wherein, the method comprises the steps of transfecting a plasmid marked with ribosome into an embryo by an intrauterine embryo electrotransfection technology, and carrying out a translation ribosome affinity purification technology after the plasmid grows to a specific time to obtain purified messenger RNA. The invention combines the intrauterine embryo point transfection technology and the translation ribosome affinity purification technology, marks specific neurons on specific time and brain areas according to the time characteristics of the development of neurons of different laminae of cerebral cortex, performs experiments at different time points in the development process so as to obtain a dynamic molecule library in the development period to construct a translation spectrum, and lays a solid foundation for summarizing rules, finding specific key factors and screening effective genes.)

一种信使RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种信使RNA的提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

哺乳动物的大脑新皮层是一种复杂的、具有高度组织性的结构，由6层不同类型的板层(layer)组成，其间由数百种不同类型的神经元细胞和神经胶质细胞。大脑新皮层是负责认知功能、感官知觉和意识的大脑区域，在进化过程中经历了显著的扩充和发展。在发育过程中，各板层具有固定的发育顺序和时间，并按时间顺序产生不同板层的特点神经元。神经元发育是基于中心法则，将遗传物质通过转录和翻译，最终产生蛋白质，发挥生物学作用，通过其各过程的复杂编排组合，以获得特定的细胞身份。决定特定神经元发育的最终类型及其所具备的功能作用是由基因组控制的，但由于神经元发育过程中时间及空间方面的复杂性，给这类研究造成了巨大障碍。寻找大脑新皮质中这种多样性和特异化的神经元的起源，发现形成和维持神经元多样性的规律，是目前亟待解决的科学问题。

目前对于神经元发育过程的研究大多集中在转录层面，通过提取全脑或者全皮质组织中的RNA，进行转录谱学分析。尽管通过生物信息学分析可以从转录谱中发现一些神经发育过程中的分子变化规律，但是同时其具有一些局限性，其中比较重要的：第一，由于神经元发育的时间性和空间性特点，常规组织样本提取方法取样较杂，包含多个区域、皮质板层及细胞类型，无法对特定区域，特定板层，或特定的神经元亚型进行归类性分析研究；第二，转录谱为转录水平的研究，研究的是细胞总RNA，里面既含有可以在翻译时编码蛋白质的外显子(exon)，也含有非编码性的内含子(Intron)，由于存在转录后修饰，翻译及翻译后修饰等一系列生物反应，因此其对最终发挥生物学效应的蛋白质变化规律并不能很好地反应。而解决这一挑战需要高质量的神经元亚类纯化方法，并考虑神经元动态、多层的特点，在转录翻译期间采集神经元并进行整合分析。同时也需从相同组织获得多种神经元亚型的组合谱以更好地理解形成复杂网状联系的调节通路。目前，已经通过各种遗传学及手术的方式来尝试解释新皮质的复杂性和不同表征神经元细胞类型的问题，然而标记和纯化并定义神经元亚型仍然具有挑战性，因为在皮质发育过程中，特异性标记物总是动态变化的。因此，急需一种准确提取神经元样本的方法，便于对神经元发育进行精准的检测与研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以荧光质粒标记的核糖体为基础，收集与标记核糖体结合的信使RNA，获得一种提取正在进行翻译的信使RNA的信使RNA的提取方法。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的信使RNA的提取方法的技术方案如下：

本发明的提取方法通过将标记核糖体的质粒通过子宫内胚胎电转染技术(IUE)转染至小鼠胚胎内，在小鼠生长到特定时间进行翻译核糖体亲和纯化技术(TRAP)，获得纯化的信使RNA(mRNA)。

本发明采用将子宫内胚胎电转染技术和翻译核糖体亲和纯化技术相结合的方式，可以对特定对象在特定时间的胞内核糖体进行提取和检测，本发明以神经发育的研究作为目的，以特定神经层中的mRNA作为提取对象进行提取，小鼠仅为常规实验客体，但本发明的方法不应限于对小鼠神经细胞中mRNA的提取。

IUE技术可以在活体状态下对目标质粒进行转染，成功率高且不影响转染后的活体生长发育，为研究生长发育状态等科研方向奠定了更为坚实的技术基石。TRAP的技术优势在于：能够在不分选细胞的情况下原位提取特定细胞类型中mRNA；TRAP提取的是细胞中正在进行翻译的mRNA，比总RNA更能准确代表细胞内蛋白翻译情况；TRAP技术提取的不仅是神经元胞体的mRNA，还包括轴突、树突和棘突的mRNA。

优选的，所述标记核糖体的质粒为pUBC-EGFP-L10a。本发明中的质粒使用在神经元中高表达的人UBIQUITIN C为启动子，其后添加EGFP-L10a结构域。

小鼠子宫内胚胎电转染技术采用两个质粒进行共转染。由于单独转染EGFP-L10a质粒时，荧光强度较弱，无法在解剖荧光显微镜下检验活体内转染建模成功与否，因此我们选取pCAG-tdTomato质粒(表达红色荧光)进行共转染，tdTomato荧光强易于检验并可标记区域，还能为荧光下显微解剖特定脑区提供范围标记。而且两种质粒共转染其效率可达90％以上。因此优选的，共转染的质粒为pUBC-EGFP-L10a和pCAG-tdTomato质粒。

作为一种优选的实施方式，共转染时一同加入细胞染色液。

更优选的，细胞染色液选自：固绿(fast green)、苏木精(hematoxylin)或亚甲基蓝染液。

为能直接观察到质粒溶液被准确顺利的注入小鼠胚胎大脑的侧脑室内，我们一并加入细胞染色液在质粒混合溶液内。优选为fast green，其呈蓝色，无毒害及副作用，并可在数小时内消散干净。

本发明中的翻译核糖体亲和纯化技术以抗GFP抗体的磁珠吸附小鼠大脑皮层核糖体上正在翻译的mRNA，纯化后获得mRNA。

本发明的提取方法主要针对小鼠大脑皮层layerⅡ/Ⅲ中的神经元进行mRNA提取，该层神经元主要在胚胎期E15.5天产生，因此利用这一发育周期，针对E15.5天的小鼠胚胎进行IUE处理，特异性标记我们想要研究的layerⅡ/Ⅲ内的神经元，并将目标质粒pUBC-EGFP-L10a转染入小鼠胚胎内进行验证，待子代小鼠出生后，选取建模成功的子代小鼠进行后续验证实验。在小鼠胚胎期E19-E20天时子代小鼠出生，一窝子代小鼠全部出生完毕后立即在解剖荧光显微镜下检测建模是否成功，及建模质量。建模完成待子代小鼠出生后，我们选取P0/P7/P14这三个时间点进行后续TRAP实验。

具体的，所述提取方法包括如下步骤：

a)取怀孕小鼠暴露小鼠胚胎，将质粒溶液注射入暴露的小鼠胚胎脑内；

b)电极头端夹住小鼠胚胎脑部两侧，电转仪脉冲刺激脑部，刺激后恢复体内培养；

c)小鼠出生后冰浴取脑，冰上解剖目标皮层区域，裂解离心取上清；

d)取步骤c)中上清与抗体beads进行免疫共沉淀，4℃条件下孵化过夜；

e)在冰上采用磁性装置分离出beads，使mRNA从beads上分离。

优选的，采用质粒pUBC-EGFP-L10A标记小鼠layerⅡ/Ⅲ神经元。

优选的，质粒溶液中包括：pUBC-EGFP-L10A质粒、pCAG-tdTomato质粒和固绿染料。

优选的，电转仪共刺激4～8次，刺激每次持续50ms，强度40V，每次之间间隔950ms。

优选的，小鼠于冰解剖缓冲液中剖出大脑，冰组织裂解液中消化裂解。

更优选的，解剖缓冲液(dissection buffer)(50mL)：1×HBSS 5ml；2.5mM HEPES-KOH 125μL，35mM glucose 700μL，4mM NaCO₃ 224μL；RNase-free water 43.901ml；临用前加入100ug/ml cycloheximide 50μL。

组织裂解液(Tissue-lysis buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.4)200μL，150mM KCl 750μL，10mM MgCl₂ 100μL，RNase-free water 8.735ml；临用前加入EDTA-freeprotease inhibitors 1tablet；0.5mM DTT 5μL；100ug/ml cycloheximide 10μL；10μL/mlrRNasin 100μL；Superasin 100μL。

低盐溶液(Low-salt buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.3)200μL，150mM KCl750μL，10mM MgCl₂ 100μL，1％(vol/vol)NP-40 1ml，RNase-free water 6.935ml；临用前加入EDTA-free protease inhibitors tablet，0.5mM DTT 5μL，100ug/ml cycloheximide10μL。

高盐溶液(High-salt buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.3)200μL，350mMKCl 1.75μL；10mM MgCl₂ 100μL，1％(vol/vol)NP-40 1ml，RNase-free water 6.935ml；临用前加入0.5mM DTT 5μL，100ug/ml cycloheximide 10μL。

优选的，亲和基质每次的beads用量为300μL，且biotinylated protein L为120μL，GFP antibody(19C8或19F7)为50μL。

优选的，裂解的具体过程包括：

c1)将消化裂解后的裂解物离心分离，向上清液中加入1/9上清液量的10％的NP-40，混匀得混合液；

c2)向c1)步骤中的混合液中加入现存液体量1/9的300mM DHPC并反转离心管，使充分混合，冰上孵育后离心取上清。

优选的，步骤d)中的免疫共沉淀步骤具体包括：

d1)将预先准备好的抗体-Protein L-Dynabeads复合物混合加入步骤(H)最终所获得的上清液中行免疫共沉淀反应，在4℃条件下孵化过夜；

d2)次日，孵育完成后将混悬液置于冰上，并用磁性装置分离，用high saltbuffer清洗4遍；第4次清洗完成后，去掉所有清洗液，并将磁性装置分离出的Bead-mRNA混合物放在室温下复温，随后使用Stratagene Absolutely RNA Nanoprep kit试剂盒，按操作说明，将含0.7μLβ-ME的100μL Nanoprep lysis buffer加入Beads-mRNA复合物放入中，并充分混匀后，在室温下孵育10分钟，使得mRNA从Beads上分离；

d3)随后用磁性装置将Beads与含有mRNA的lysis buffer分离，将lysis Buffer取出放入新的离心管内；

d4)按试剂盒厂家指导步骤进行RNA纯化操作，纯化完成后，将最终产物mRNA转移至新的干净的冻存管内，储存于-80℃低温冰箱备用。

根据上述方法收集提取的mRNA经测验，，260/280基本在2.06-2.24之间，260/230在2.06-2.35之间，RNA浓度在32-178.3ng/μL之间。所得mRNA均为高质量的RNA样本，量足且质纯。

与现有技术相比，本发明根据大脑皮质不同板层神经元发育的时间特性，在特定时间和脑区上标记特定的神经元，并取发育过程中的不同时间点进行实验，以期取得发育期动态分子库构建翻译谱，为总结规律，发现特定关键因子，筛选有效基因打下坚实基础。本发明采用子宫内胚胎点转染技术和翻译核糖体亲和纯化技术相结合，构建出特定神经元的发育期翻译谱，构建方法稳定可靠，能够准确反映特定时空下发育期神经元内蛋白质翻译情况，从翻译层面揭示了小鼠大脑新皮质特定神经元发育时期基因组表达变化特点，且构建的翻译谱数据库可以作为一种筛查特定感兴趣或存在特殊意义靶点的工具，用以研究它们在发育过程中的作用及在病理情况下的表达特点，为临床一些少见病、罕见病的研究提供方向可以对特定板层的神经元完整mRNA进行提取，对细胞内蛋白的翻译情况体现的更加准确，

基于TRAP所提纯的mRNA配以微阵列芯片扫描(Microarray)以期在翻译水平上获得layerⅡ/Ⅲ的锥体投射神经元在发育过程中、不同时间点上分子库表达水平的变化规律，发现潜在的影响该层神经元发育的重要分子，为探寻一些先天性神经发育缺陷疾病的分子机制构建可供参考查询的分子数据库。

附图说明

图1是本发明的***融合蛋白的结构域并转染后的pUBC-EGFP-L10a质粒检测图；

图2是本发明IUE干预后小鼠荧光标记区域的蛋白检测图；

图3是本发明的TRAP实验各步骤样本的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的信使RNA的提取方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本实施例中采用的仪器和试剂等具体如下：

Neuro2a细胞系，购自ATCC；

CD-1小鼠，购自Charles River Laboratories，美国；

青霉素-链霉素，购自gibco；

PolyJet^TM DNA体外细胞转染试剂盒，购自SignaGen Laboratories

BCA蛋白定量试剂盒，购自Thermo Scientific；

GFP antibodies(Htz-GFP-19F7、Htz-GFP-19C8)，购自Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility。

本实施例重点研究小鼠大脑新皮层的第2/3层(layerⅡ/Ⅲ)，该层在小鼠胚胎期15.5天开始生成，因此本实施例选择胚胎期第15.5天作为干预时间点，运用子宫内胚胎电转染技术(In Utero Electroporation，IUE)特异性的标记layerⅡ/Ⅲ的神经元，具体为将标记核糖体的质粒pUBC-EGFP-L10A转入layerⅡ/Ⅲ神经元内，然后通过TRAP在预定时间点提取特定神经元的mRNA，为后续microarray的进行和翻译谱构建打下坚实基础。

一、神经细胞转染

1.1Neuro2a细胞培养

传代培养是将N2a细胞培养于底面积75cm²的Flask中，在37℃、5％CO₂的条件下将其种于高糖DMEM的完全细胞培养基中，并加入5％或10％FBS及1％的青霉素-链霉素。当细胞生长达到80％-90％时，加入0.25％的Trypsin-EDTA将细胞株打散分离，使其在培养基中悬浮，然后再以1:10到1:20的比例进行分离再接种。

1.2Neuro2a细胞化学转染

(1)将N2a细胞种植于6孔板(Bection Dickinson，353043)上，每孔加培养液1ml；

(2)当细胞生长密度达到时，开始准备行目标质粒的化学转染；

(3)转染前30分钟-1小时加入细胞新鲜预热的培养液；

(4)根据厂商说明书上指导的步骤，利用PolyJet细胞化学转染试剂盒进行细胞化学转染操作。质粒准备如下：取DMEM 50μL分别置于两个新鲜干净离心管内，标记为A和B。于A管内加入PolyJet试剂，然后加入1ug质粒(pCAG-GFP作为对照组，pUBC-EGFP-L10a作为实验组，N＝3)，充分混匀；

(5)将A管混合物一次性倒入B管中，充分混匀后置于室温下孵育约15分钟；

(6)将混匀后的质粒试剂混合物加入培养板各孔中，轻柔充分混匀，不能太过剧烈，每孔细胞每种质粒给予1ug；

(7)5-12小时后，更换新鲜培养液；

(8)48-72小时后，提取细胞蛋白用于后续实验备用。

利用neuro2a细胞系测试pUBC-EGFP-L10a质粒。以pCAG-GFP为对照组，转染neuro2a细胞48小时后提取细胞蛋白行western blot，如图1所示，L：EGFP-L10a；G：GFP，抗体选用anti-GFP(abcam-ab290，浓度1:10000)，可见转染pUBC-EGFP-L10a质粒组中，有单一EGFP-L10a融合蛋白稳定表达(分子量约51kd)；而对照组中，仅表达GFP蛋白(分子量约26kd)。目标质粒在神经元细胞中可以稳定表达出EGFP-L10a融合蛋白，为下一阶段动物实验提供证据支持。

1.3提取细胞蛋白

提取1.2步骤(8)中的细胞蛋白，具体包括如下步骤：

(s1)将细胞置于冰上，弃培养液，并用冰1×PBS清洗细胞，每孔各3次；

(s2)清洗完毕后，每孔细胞加入300μl裂解液(lysis buffer)，轻微震荡摇匀，充***解细胞；

(s3)充***解后，将细胞裂解物转入新鲜1.5ml离心管中，并置于混匀仪上4℃下震荡10分钟；

(s4)随后将离心管转移至低温离心机，于4℃下，16000g，离心20分钟；

(s5)保留离心后上清液并转移至新的干净离心管中，立即行BCA蛋白测定或储存于-80℃低温冰箱内备用。

二、小鼠子宫内胚胎电转染(IUE)

准备质粒溶液，包括对照组GFP和实验组EGFP-L10a，对照组和实验组均为1.5μg/μl的质粒溶液。由于单独转染EGFP-L10a质粒时，荧光强度较弱，无法在解剖荧光显微镜下检验活体内转染建模成功与否，因此我们选取pCAG-tdTomato质粒(表达红色荧光)进行共转染，tdTomato荧光强易于检验并可标记区域，还能为荧光下显微解剖特定脑区提供范围标记。而且经前期检验，两种质粒共转染其效率可达90％以上。另外为能直接观察到质粒溶液被准确顺利的注入小鼠胚胎大脑的侧脑室内，我们将fast green一并加入质粒混合溶液内，其呈蓝色，无毒害及副作用，并可在数小时内消散干净。具体的手术过程为：

2.1小鼠处理

使用孕期为E15.5.5的CD-1怀孕小鼠以异氟烷(诱导时浓度2.8％，手术开始时2.5％)持续吸入麻醉小鼠，以针刺脚趾评估麻醉满意情况；待麻醉满意后将小鼠腹部剃毛并仰卧固定在保温操作台上。眼药膏涂抹眼镜防止麻醉手术期间角膜干燥损伤眼镜；常规消毒铺无菌纱布，做腹部正中切口(皮肤切开1.5-2厘米，肌肉腹膜切开1-1.5cm)，分层切开皮肤及腹膜，见小鼠子宫及成串胚胎；用圈钳将子宫轻柔钩出腹腔，暴露小鼠胚胎，并用无菌0.9％的生理盐水保持湿润。

2.2质粒溶液注射及电转染

A.将术前备好的质粒以玻璃毛细管针缓慢注入胚胎大脑侧脑室内；

B.为将质粒转染进神经元祖细胞，随后应用电转仪(BTX)，以合适的角度将电极头端夹住小鼠胚胎脑部两侧，并给予5次电脉冲刺激，每次持续50ms，强度40V，每次之间间隔950ms。

2.3电转后及手术后处理

回纳胚胎，严密分层缝合腹膜、皮肤，并局部消毒，苏醒后予以带布洛芬的饮用水镇痛。

2.4小鼠出生后检验

建模手术完成后，约在胚胎期E19-20天的时候，母鼠能生出小鼠，出生当天在荧光显微镜下检查建模成功与否及建模的质量。一窝子代小鼠全部出生完毕后立即在解剖荧光显微镜下检测建模是否成功，及建模质量。因为刚出生小鼠颅骨还未发育完毕，透光性好，荧光易于呈现。质粒被电转入侧脑室周边的放射状胶质细胞内，并向皮质的预定板层(layer Ⅱ/Ⅲ)移行。子代小鼠出生后，解剖荧光显微镜检验建模结果，可见红色荧光位于左侧大脑皮质，由于荧光标记细胞移行并定位于皮质上层，距离脑表面较近，因此荧光显色较强，随后在解剖荧光显微镜下，显微解剖并取出带荧光的区域皮层脑组织，并提取组织蛋白，随后进行Western Blot检测。如图2所示，IUE电转染pUBC-EGFP-L10a组中可见稳定表达的EGFP-L10a融合蛋白，分子量约51kd，而对照组(GFP)中，无此融合蛋白表达。此结果证明目标质粒及共转染在活体内表达稳定有效，为下一阶段TRAP实验的进行打下基础。

选取三个时间点分别入组，进入下一步实验：即出生后当天(P0)，出生后第7天(P7)和出生后第14天(P14)。小鼠P0期相当于新生状态，类似于人类胚胎的胚胎期后期，其神经元的迁移并未完全结束，皮质上层没有规整形成；小鼠出生后7天(P7)，神经元迁移基本结束，神经元到达预定的固定位置，并开始成熟，树突发育增多，形态变复杂，并开始与周围及远处建立连接，发挥功能，类似于人类的新生儿期；随后神经元继续发育成熟，树突继续发育增大，分支变多，复杂性增强，纤维网络继续扩展，树突棘及突触开始大量形成并迅速增加，到P14时树突基本发育完毕，此时树突棘开始发育，大量产生并形成突触，与周围建立连接，类似于人类的青少年期。

2.5脑组织的固定、切片及结果验证

(b1)将建模成功后的子代小鼠麻醉后牺牲掉，以含4％PFA的1×PBS溶液灌注不同时间点的建模成功的子代小鼠；

(b2)应用显微解剖迅速取下大脑，注意保护大脑皮质完整，放入含有4％PFA的1×PBS中固定过夜，次日更换成1×PBS过夜；

(b3)固定完成满意后，将大脑置于2-3％的琼脂糖凝胶中保护固定；

(b4)应用震动切片机行小鼠大脑冠状切片，每层厚度100um；

(b5)完成后，进行装片，将脑片平铺于载玻片上，擦去多余PBS后使用可以染核的Prolong Gold with DAPI(Invitrogen)覆盖脑组织切片保护荧光，并加盖玻片完整覆盖，应用指甲油封闭盖玻片四周，晾干备用；

(b6)应用FV1000共聚焦荧光显微镜(Olympus)激光扫描拍摄图片。观察皮层结构及细胞变化。E15.5时进行IUE后，P0开始标记细胞基本位于upper layer上层皮质(layerⅡ/Ⅲ)内，随着小鼠年龄的增加，P7时layerⅡ/Ⅲ明显增厚，细胞变成熟，变复杂，P14时神经元继续成熟，整个细胞板层规整度增强，纤维联系增加。EGFP-L10a呈绿色，表达于P0-P14大脑皮质layerⅡ/Ⅲ的锥体细胞神经元中。共转染标记荧光用的pCAG-tdTomato，所在位置与绿色基本重叠，可以说明共转染效率极高，被转染细胞共同拥有td-Tomato和EGFP-L10a。DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，可透过完整细胞膜，快速进入活细胞内并与DNA强力结合，在荧光显微镜下呈蓝色，可用于活细胞核染，皮质板层核染后可清晰分辨新皮质各层基本结构情况。由于GFP、tomato和DAPI激发光波长不同，激发后发散光颜色也各不相同，因此可在此单一样品上行多重荧光染色检测验证。

2.6组织蛋白的提取

(e1)将60mm培养盘放置于冰上，放入预冷的1×PBS并固定在解剖显微镜或荧光解剖显微镜下；

(e2)异氟烷麻醉小鼠；

(e3)麻醉满意后，断头，迅速于预冷的PBS中取出小鼠大脑，并在显微镜下显微解剖出小鼠的目标皮层区域或在荧光显微镜下解剖出小鼠大脑皮层IUE建模所标记的荧光区域，放入1.5ml冻存管内，速冻于液氮中，储存于-80℃备用；或直接放入预冷的lysisbuffer中直接进入裂解提取蛋白步骤；

(e4)根据皮层组织量，加入适量的(300-500μl)组织裂解液于离心管中，在冰上充分捣碎，使组织完全溶解形成混悬液；

(e5)将离心管置于混匀振荡器上4℃下充分震荡10分钟；

(e6)将离心管放入高速离心机中，4℃，16000g，离心10分钟；

(e7)将上清蛋白提取液转移至新鲜干净的冻存管内，并立即行BCA蛋白测定或储存于-80℃低温冰箱内备用。

三、翻译核糖体亲和纯化(TRAP)

建模成功后的子代小鼠分为3组(P0，P7，P14)，雌雄各半，每组实验重复三次。所述TRAP技术采用改良后的步骤，按操作步骤提前一天配好工作液，在使用前加入特定的试剂。全部组织均取新鲜标本，不要进行冷冻。操作要迅速，取下组织将血液清洗干净，并立即放入特制裂解液中，减少解剖取样时间及在空气中暴露的时间，以尽量防止减少整个过程中各步骤时RNase对RNA的降解，影响产量和质量。按操作步骤完成实验后，获得的最终TRAPmRNA产物，立即保存入-80℃冰箱，待下一步分析。

3.1工作液制备

解剖缓冲液(dissection buffer)(50mL)：1×HBSS 5ml；2.5mM HEPES-KOH 125μL，35mM glucose 700μL，4mM NaCO₃ 224μL；RNase-free water 43.901ml；临用前加入100ug/ml cycloheximide 50μL。

组织裂解液(Tissue-lysis buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.4)200μL，150mM KCl 750μL，10mM MgCl₂ 100μL，RNase-free water 8.735ml；临用前加入EDTA-freeprotease inhibitors 1tablet；0.5mM DTT 5μL；100ug/ml cycloheximide 10μL；10μL/mlrRNasin 100μL；Superasin 100μL。

低盐溶液(Low-salt buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.3)200μL，150mM KCl750μL，10mM MgCl₂ 100μL，1％(vol/vol)NP-40 1ml，RNase-free water 6.935ml；临用前加入EDTA-free protease inhibitors tablet，0.5mM DTT 5μL，100ug/ml cycloheximide10μL。

高盐溶液(High-salt buffer)(10ml)：20mM HEPES-KOH(pH 7.3)200μL，350mMKCl 1.75μL；10mM MgCl₂ 100μL，1％(vol/vol)NP-40 1ml，RNase-free water 6.935ml；临用前加入0.5mM DTT 5μL，100ug/ml cycloheximide 10μL。

3.2制备亲和基质

轻柔将Streptavidin MyOne T1Dynabeads混匀成均匀悬液；每次纯化中使用的beads为300μL，biotinylated protein L为120μL，GFP antibody(19C8或19F7)为50μL。根据实验组别选择不同的抗体并计算出beads总量，移液器取出转移至新鲜干净的离心管中，并在磁性操作板上分离磁性beads，并用1×PBS清洗一次；磁性操作台上收集beads并溶于适当量的1×PBS中，随后加入Protein L，目标浓度1ug/μL，室温下孵育35分钟；在磁性操作台上收集Protein L-beads复合物，并用含3％IgG和protease-free BSA的1×PBS清洗5次；清洗完毕，收集beads后，加入low-salt buffer，并按比例加入GFP抗体，室温下孵育1小时；孵育完毕后，用low-salt buffer清洗抗体beads复合物3次，随后加入适当量的low-saltbuffer以备后续免疫共沉淀反应使用。

3.3目标组织裂解物制备(所有操作均在冰上进行)：

i.异氟烷麻醉子代小鼠后断头，于冰dissection buffer中迅速解剖出大脑；

ii.荧光显微镜下根据荧光范围显微解剖出所需目标区域的大脑皮层，清洗掉残留血液；

iii.随后立即将获得的目标组织放入lysis buffer中，充分捣碎消化后，将裂解物加入新鲜干净的1.5ml离心管中；

iv.于4℃下，2000g，离心10分钟；

v.将上清液取出转移至新的离心管内，加入1/9上清液量的10％的NP-40，轻柔翻转冻存管使充分混合；

vi.加入现存液体量1/9的300mM DHPC并迅速而轻柔的反转离心管，使充分混合，并置入冰上孵育5分钟；

vii.随后将混悬液置入离心机，在4℃下，20,000g，离心10分钟；

viii.取出上清液置于新的离心管中；(另外留取50μL上清作为Input，加入等量sample buffer后，煮沸5分钟，用以后面验证用)。

3.4mRNA亲和纯化

h1)将预先准备好的抗体-Protein L-Dynabeads复合物混合加入步骤(viii)最终所获得的上清液中行免疫共沉淀反应，在4℃条件下孵化过夜；

h2)次日，孵育完成后将混悬液置于冰上，并用磁性装置分离，用high saltbuffer清洗4遍；第4次清洗完成后，去掉所有清洗液，并将磁性装置分离出的Bead-mRNA混合物放在室温下复温，随后使用Stratagene Absolutely RNA Nanoprep kit试剂盒，按操作说明，将含0.7μLβ-ME的100μL Nanoprep lysis buffer加入Beads-mRNA复合物放入中，并充分混匀后，在室温下孵育10分钟，使得mRNA从Beads上分离；

h3)随后用磁性装置将Beads与含有mRNA的lysis buffer分离，将lysis Buffer取出放入新的离心管内；(剩下的磁性颗粒材料，加入50μL sample buffer后，直接煮沸5分钟，分离后取上清，备验证用)

h4)按试剂盒厂家指导步骤进行RNA纯化操作，纯化完成后，将最终产物mRNA转移至新的干净的冻存管内，储存于-80℃低温冰箱备用；

h5)留取1-2μL样品进行RNA质量检测以达到下一步microarray实验对样品的要求。我们利用Nanodrop 1000分光光度计测算样本的260/230值、260/280值及mRNA浓度。检测结果如表1所示：

表1

表1所示为经Nanodrop所测得的RNA质量数据，260/280基本在2.06-2.24之间，260/230在2.06-2.35之间，RNA浓度在32-178.3ng/μL之间。均为高质量的RNA样本，除了P7标本2的260/230值稍低，但其260/280数值佳，纯度及浓度正常，因此并不会影响下游分析的整体变化趋势，对结果不会产生影响。通常通过测定RNA溶液的吸光度来判断RNA纯度，主要检测三个指标，260/280、260/230及样本的mRNA浓度，以达到微阵列芯片扫描分析所需的样本质量要求。样品在280nm代表了核酸的吸光度，260nm代表蛋白等有机物的吸光度，而230nm则代表了盐浓度。260/280和260/230可以很准确地反应RNA纯度，高纯度高质量的RNA通常A260/A280在2左右，A260/A230一般也在2左右。综上，本实施例中所获TRAP mRNA纯净、足量。

3.5TRAP流程验证

取各阶段的样本运用anti-GFP进行Western Blot，如图3所示，Input为加入抗GFP磁珠之前的全细胞组织裂解液上清，IP为完成TRAP全过程后，从磁珠上裂解下来的蛋白。Input内实验组(EGFP-L10a)内可见EGFP-L10a融合蛋白，而对照组(GFP)中仅能探测到GFP表达。经过免疫共沉淀反应后，裂解液上清中的融合蛋白被磁珠通过抗原抗体反应结合，反应结束后，我们把mRNA-核糖体(EGFP-L10a融合蛋白表达)-抗GFP磁珠复合物经磁铁分离出来，利用试剂盒将mRNA从核糖体上分离开，纯化并保存终产物mRNA。随后将EGFP-L10a-抗GFP磁珠复合物解离，并通过Western Blot实验进行检验。在反应后产物的验证中(anti-GFP)，实验组中可以明显检测到EGFP-L10a融合蛋白的存在，而对照组中只存在GFP条带，无融合蛋白表达(如图3所示)，而行IP后的裂解液残液中(IgG)并无GFP或EGFP-L10a表达。说明该抗GFP磁珠，可以特异性结合核糖体蛋白，将翻译核糖体-mRNA复合物有效分离，实验过程高效特异可靠。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。