阅读说明：本技术 一种基于人工模拟核酸的分子信标 (Molecular beacon based on artificial simulation nucleic acid ) 是由 葛猛 余倩 潘世让 王宏伟 于 2018-06-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于人工模拟核酸的分子信标。本发明公开的基于人工模拟核酸的分子信标为对基础分子信标进行如下A1)和A2)的改造得到的分子：A1)向基础分子信标的茎杆区引入至少一个非天然核苷酸对,非天然核苷酸对为isoC-isoG或其衍生核苷酸对iso<Sup>Me</Sup>C-isoG或者其他存在正交性的非天然核苷酸形成的非天然核苷酸对；A2)向基础分子信标的环状区引入0-10个锁核苷酸残基。本发明的基于人工模拟核酸的分子信标可以极大地降低由非特异相互作用所产生的背景信号,并使环状区长度的可控,提高了检测效率,降低了分子信标的设计和优化难度。(The invention discloses a molecular beacon based on artificial simulated nucleic acid. The molecular beacon based on the artificial mimic nucleic acid disclosed by the invention is a molecule obtained by modifying a basic molecular beacon as follows A1) and A2): A1) introducing at least one non-natural nucleotide pair into the stem region of the basic molecular beacon, wherein the non-natural nucleotide pair is isoC-isoG or a derivative nucleotide pair iso thereof Me C-isoG or other non-natural nucleotide pair formed by non-natural nucleotides with orthogonality; A2) 0-10 locked nucleotide residues are introduced into the loop region of the base molecular beacon. The molecular beacon based on the artificial simulated nucleic acid can greatly reduce the background signal generated by non-specific interaction, and the length of the annular region is controllable, thereby improving the detection efficiency and reducing the design and optimization difficulty of the molecular beacon.)

一种基于人工模拟核酸的分子信标

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种基于人工模拟核酸的分子信标。

背景技术

分子信标(Molecular Beacon)在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团(F)，3′端标记淬灭基团(Q)。常用的荧光-淬灭分子对有Fam-Dabcyl、Hex-Dabcyl、TET-Dabcyl、TAMRA-Dabcyl、TexasRed-Dabcyl等。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与猝灭基团靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和猝灭基团距离增大。根据Foerster理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后，分子信标的荧光几乎100％恢复,且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比(图1)。

分子信标具有以下几个优点：A.可进行核酸实时(Real-time)检测，在PCR体系中加入分子信标探针，可以对PCR反应过程随时进行监测并进行精确定量，与Taqman探针相比，分子信标的背景信号要低很多，因此，检测灵敏度也明显要高；B.特异性强，与线性寡核苷酸探针相比，茎环状结构的分子信标检测特异性更高，对靶序列中单个核苷酸的错配、缺失或***突变均能检测出来；C.灵敏度高，低至10拷贝的核酸也能检出；D.内标定量的线性范围比TaqMan探针宽2个数量级；E.有效消除核酸交叉污染，因为反应与检测直接在封闭中进行。

分子信标在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时定量PCR、基因突变的快速分析、病原体检测、单细胞内RNA检测、DNA/RNA杂交的动力学研究以及DNA/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。

理想状态下，分子信标只有环状区是与靶序列互补的，杂交时只有探针的环状区与靶序列结合，而茎杆部分不能与模板结合，然而茎杆部分的引入常常会导致分子信标与模板序列之间产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变(包括单核苷酸的错配、缺失或***突变)效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。简言之，就是分子信标的设计难度比较大，得到一个理想的分子信标比较困难。相对而言，Taqman探针的设计要简单得多，这也是为什么Taqman探针的应用比起分子信标而言更为广泛的原因。

近年来，人工模拟核酸(Artificial Nucleic Acid Analogues)也即非天然核苷酸技术有较快发展，是指一种通过对核苷酸的修饰或改造，人工设计合成的可以行使或模拟天然核酸功能、而又具有相对独立性的人造核酸。核苷酸都是由碱基和糖环组成，因此，针对核苷酸的修饰或改造也分为两大类：一类是针对碱基的修饰改造，异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(iso^MeC-isoG)中的碱基是这一类的代表；另一类则是针对糖环的修饰改造，锁核苷酸、肽核酸则是这一类的代表。

针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(iso^MeC-isoG)中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体,它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。

除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸(LNA)。LNA泛指含有一个或多个LNA单体(锁核苷酸)的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何降低非特异相互作用所产生的背景信号，从而提高检测效率，以及，如何使得分子信标环状区的长度变得可控，从而使分子信标的设计和优化变得简单而方便。

为解决上述技术问题，本发明提供了基于人工模拟核酸的分子信标，将所述基于人工模拟核酸的分子信标命名为ANAB-MB(Artificial Nucleic Acids Based MolecularBeacon)，将所述基础分子信标命名为MB。

所述基于人工模拟核酸的分子信标为对基础分子信标进行如下A1)和A2)的改造得到的分子：

A1)向所述基础分子信标的茎杆区引入至少一个非天然核苷酸对，所述非天然核苷酸对为isoC-isoG或其衍生核苷酸对iso^MeC-isoG或者其他存在正交性的非天然核苷酸形成的非天然核苷酸对；所述isoC-isoG为异胞嘧啶脱氧核苷酸残基与异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基形成的核苷酸对；所述iso^MeC-isoG为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基与异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基形成的核苷酸对；

A2)向所述基础分子信标的环状区引入0-10个锁核苷酸残基。

所述正交性是指非天然核苷酸的相应核苷酸之间可以配对但非天然核苷酸与天然核苷酸不能配对的特性。

所述基础分子信标为由荧光基团和淬灭基团标记的单链DNA，在自由状态时的空间结构呈发卡型，根据其发卡型结构可将其分为茎杆区和环状区(图1)。所述茎杆区由茎杆区1和茎杆区2组成，所述茎杆区1和所述茎杆区2的序列反向互补且分别连接于所述环状区的两端。所述自由状态为所述基础分子信标的环状区未与靶序列结合时的状态。所述荧光基团和所述淬灭基团位于所述基础分子信标的5′末端和3′末端，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。

天然核苷酸对C-G和所述iso^MeC-isoG中的碱基配对方式如图2所示。

所述锁核苷酸为脱氧核苷酸的戊糖环的2′-O和4′-C之间形成一个亚甲基桥后得到的分子(位于单链DNA中的锁核苷酸残基的结构如图3所示)。

所述锁核苷酸具体可为A、T、C或G的锁核苷酸，可分别用+A、+T、+C或+G表示。

A1)所述向所述基础分子信标的茎杆区引入至少一个非天然核苷酸对可通过化学合成的方式直接合成含有非天然核苷酸isoC或iso^MeC以及isoG的ANAB-MB，使得在自由状态时ANAB-MB的茎杆区含有非天然核苷酸对isoC-isoG或iso^MeC-isoG。

A2)所述向所述基础分子信标的环状区引入锁核苷酸残基，可通过化学合成的方式直接合成含有锁核苷酸残基的ANAB-MB。

上述基于人工模拟核酸的分子信标中，所述环状区的长度可为6-40nt。所述环状区的长度可为10-30nt。进一步，所述环状区的长度可为6-25nt。

上述基于人工模拟核酸的分子信标中，所述茎杆区的长度可为3-10nt。所述茎杆区的长度进一步可为6nt。所述茎杆区的长度是指所述茎杆区1或所述茎杆区2的长度。所述茎杆区1的长度与所述茎杆区2的长度相等，且反向互补。

上述基于人工模拟核酸的分子信标中所述茎杆区中非天然核苷酸对的个数可为1-10，具体可为1、2、3或4个。所述基于人工模拟核酸的分子信标中所述环状区中锁核苷酸残基的个数可为1-10，具体可为1、2、3或4个。

本发明的ANAB-MB中的所述非天然核苷酸对可以提高ANAB-MB的特异性；本发明的ANAB-MB中的所述锁核苷酸残基可以提高ANAB-MB与靶标序列结合的亲和力。

ANAB-MB中的所述非天然核苷酸对与所述锁核苷酸残基的个数可根据具体需要确定。

上述基于人工模拟核酸的分子信标中，所述基础分子信标的两端可标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团发出的荧光可被所述猝灭基团吸收。所述荧光基团具体可为但不限于FAM、Hex、TET、Cy3、JOE；所述淬灭基团具体可为但不限于Dabcyl、TAMRA。

本发明还提供了所述基于人工模拟核酸的分子信标的制备方法，所述方法包括：通过化学合成向基础分子信标中引入非天然核苷酸，得到所述基于人工模拟核酸的分子信标；

所述非天然核苷酸为下述M1和/或M2：

M1：下述M11和M12：

M11：iso^MeC(5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸)；

M12：isoG(异鸟嘌呤脱氧核苷酸)；

M2：锁核苷酸。

M11与M12在所述基于人工模拟核酸的分子信标中的位置能够满足在所述基于人工模拟核酸的分子信标处于自由状态时能形成非天然核苷酸对。

本发明还提供了所述基于人工模拟核酸的分子信标的下述任一应用：

X1、在作为分子信标中的应用；

X2、在检测基因突变中的应用；

X3、在检测微生物中的应用；

X4、在检测病原体中的应用；

X5、在实时定量PCR中的应用；

X6、在检测单细胞内RNA中的应用；

X7、在检测DNA与RNA杂交中的应用；

X8、在检测DNA和蛋白质相互作用中的应用。

所述微生物具体可为细菌、病毒、酵母、藻或真菌。

本发明创造性的将非天然核苷酸引入到分子信标中，开发出一种新型的基于人工模拟核酸的分子信标ANAB-MB(Artificial Nucleic Acid Based Molecular Beacon)。通过将非天然核苷酸对isoC-isoG或其衍生核苷酸对iso^MeC-isoG或者其他与天然核苷酸对之间存在正交性的人工核苷酸对引入到分子信标的茎杆区，极大地降低了由非特异相互作用所产生的背景信号，显著提高了检测效率；通过将LNA引入到分子信标的环状区，使得环状区的长度变得可控，从而显著提高了分子信标在用于基因突变检测时的效率。而非特异相互作用的降低以及环状区长度的可控性一起大大降低了分子信标的设计难度，使得分子信标的设计和优化变得简单而方便。

附图说明

图1为分子信标工作原理。

图2为不同核苷酸对中碱基对的配对方式。其中，R均表示脱氧核苷酸的非碱基部分。

图3为锁核苷酸残基的结构。其中，Base表示碱基。

图4为iso^MeC-isoG对ANAB-MB茎杆区非特异性相互作用的影响。

图5为实施例2的新型分子信标isoMB-25-2和引物对A1的灵敏度的检测结果。1-6分别为30000、3000、300、30、3拷贝/μL以及NTC的结果。

图6为实施例2的普通分子信标control-MB1和引物对A1的检测结果。1-6分别为30000、3000、300、30、3拷贝/μL以及NTC的结果。

图7为实施例4的新型分子信标LNA-13-3和引物对A2的特异性检测结果。

图8为实施例4的普通分子信标control-25和引物对A2的特异性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Tm值为DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高。

本发明所提供的基于人工模拟核酸的分子信标(Artificial Nucleic AcidBased Molecular Beacon,ANAB-MB)，为对基础分子信标进行如下A1)和/或A2)的改造得到的分子：

A1)向基础分子信标的茎杆区引入至少一个非天然核苷酸对，非天然核苷酸对为isoC-isoG或其衍生核苷酸对iso^MeC-isoG或者其他与天然核苷酸对之间存在正交性的人工核苷酸对；在本实施例中非天然核苷酸对为iso^MeC-isoG；iso^MeC-isoG为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基与异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基形成的核苷酸对；

A2)向基础分子信标的环状区引入至少一个锁核苷酸残基。

本发明的基于人工模拟核酸的分子信标可用于检测基因突变和病原体，下面以检测幽门螺旋杆菌的分子信标为例，具体阐述本发明的ANAB-MB的影响因素、优势及用途。

下述实施例中所用到的幽门螺旋杆菌(Helicobaeter pylori，Hp)特异性基因UreA DNA片段为：

ACCTGATGATGTGATGGATGGCGTGGCAAGCATGATCCATGAAGTGGGTATTGAAGCGATGTTTCCTGATGGGACCAAACTCGTAACCGTGCATACCCCTATTGAG(序列1)。

下述实施例中所用到的幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G DNA片段为：

GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGC(序列2)。

实施例1、iso^MeC-isoG对ANAB-MB茎秆区的影响

合成基于幽门螺旋杆菌UreA基因的DNA序列、茎杆区含有非天然核苷酸对iso^MeC-isoG的5种ANAB-MB(isoMB-25-1、isoMB-25-2、isoMB-25-2S、isoMB-25-3和isoMB-25-4)和1种不含非天然核苷酸的分子信标(control MB)，具体如下：

i soMB-25-1：

i soMB-25-2：

i soMB-25-2S：

i soMB-25-3：

isoMB-25-4：

control MB1：

control MB1的序列为序列表中序列3。

其中，FAM为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团；方框部分为茎杆区序列，将FAM端茎杆区序列记为茎杆区1，将Dabcyl端茎杆区序列记为茎杆区2；下划线部分为环状区，可以识别靶序列；*G表示非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基(isoG)，*C表示非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，自由状态时，ANAB-MB中的iso^MeC和isoG形成非天然核苷酸对iso^MeC-isoG，iso^MeC-isoG如图2所示。图2中R表示非碱基部分。

1、iso^MeC-isoG对ANAB-MB茎杆区的Tm值的影响

通过熔解曲线法测定了上述五种分子信标茎杆区的Tm值,实验在RocheLightCycler 480上进行。

结果显示，isoMB-25-1、isoMB-25-2、isoMB-25-2S和isoMB-25-3此4种ANAB-MB茎杆区的Tm值与Control MB茎杆区的Tm值基本一致，表明当将ANAB-MB茎杆区的1对或多对C-G核苷酸对替换成iso^MeC-isoG之后，分子信标茎杆区本身的Tm值基本不发生改变；isoMB-25-4此种ANAB-MB茎杆区的Tm值明显高于isoMB-25-3茎杆区的Tm值,表明当将ANAB-MB茎杆区的1对或多对A-T核苷酸对替换成iso^MeC-isoG之后，分子信标茎杆区的Tm值升高。因此,非天然核苷酸对iso^MeC-isoG替换C-G核苷酸对，不影响分子信标茎杆区的Tm值，可以通将茎秆区的A-T核苷酸对替换成iso^MeC-isoG核苷酸对来改变分子信标茎杆区的Tm值。

表1：各分子信标茎秆区Tm值比较

2、iso^MeC-isoG对ANAB-MB茎杆区非特异性相互作用的影响

人工合成靶标DNA片段，其序列如下：

6bp靶标DNA片段:

8bp靶标DNA片段:

10bp靶标DNA片段:

12bp靶标DNA片段:

环状区靶标DNA片段:5'-TCCCATCAGGAAACATCGCTTCAAT-3'。

其中，方框部分的序列与各分子信标的茎杆区1的序列反向互补。

环状区靶标DNA片段，与control MB1的环状区域序列反向互补。

将浓度均为50nM的isoMB-25-1、isoMB-25-2、isoMB-25-2S、isoMB-25-3和controlMB1溶液(溶剂均为去离子水，溶质为相应的分子信标)均分别与浓度为500nM的上述各靶标DNA片段的溶液(溶剂均为去离子水，溶质为相应的各靶标DNA片段)94℃1min变性后，退火，并在60℃测定荧光信号，并进行信号归一化，利用去离子水替换靶标DNA片段的溶液作为阴性对照，其荧光信号归一化为0；将环状区靶标DNA片段的溶液与分子信标孵育后的荧光信号归一化为1。结果如图4所示。

结果显示，对于6bp和8bp的靶标DNA片段，isoMB-25-1、isoMB-25-2、isoMB-25-2S、isoMB-25-3及control MB1有相似的反应结果，即均有极少量的分子信标的茎杆区序列与靶标DNA片段杂交；然而，对于10bp和12bp的靶标DNA片段与Control-MB1杂交后，分别有38％和56％的茎杆发夹结构被打开。与此同时，与isoMB-25-1、isoMB-25-2、isoMB-25-2S、isoMB-25-3杂交后，随着非天然核苷酸对的增多，荧光信号均依次降低，即茎杆发夹结构较难被打开，探针越稳定，非特异性背景信号影响越小。

因此，由于ANAB-MB茎杆区非天然核苷酸对的引入抑制了外源非特异性片段的干扰，大大增加了分子信标的特异性。另外，引入的非天然核苷酸对数量越多，探针特异性越强，非特异性背景信号影响越小。

实施例2、新型分子信标的灵敏度实验

将序列1所示的幽门螺旋杆菌UreA基因连接至质粒pUC57(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中后进行倍比稀释，分别得到浓度分别为30000、3000、300、30、3拷贝/μL的重组质粒溶液。

将上述各重组质粒溶液中的重组质粒作为模板，将实施例1中新型分子信标isoMB-25-2与普通分子信标control-MB1进行对比。每个反应体系一种浓度的重组质粒溶液，每种反应体系设置三个重复，以无核酸酶水替换重组质粒溶液作为阴性对照(NTC)。

设计并合成能扩增幽门螺旋杆菌UreA基因DNA片段的特异性引物对，将该引物对命名为引物对A1，引物对A1由A1-F和A1-R组成，其序列如下：

A1-F：5'-ACCTGATGATGTGATGGATGG-3'；

A1-R：5'-CTCAATAGGGGTATGCACGG-3'。

定量PCR检测试剂EX Taq DNA聚合酶、dNTPs与反应缓冲液均为TAKARA公司产品，具体实验操作参照其产品说明书。

结果(图5)显示，新型分子信标isoMB-25-2扩增曲线基线平稳，且可以检出低至3拷贝的模板；对照普通分子信标control-MB1扩增曲线基线倾斜，导致定量检测结果不可靠(图6)。表明，实施例2中新型分子信标isoMB-25-2的灵敏度为3拷贝/μL,明显优于普通分子信标control-MB1。与此同时,新型分子信标isoMB-25-2可以降低基线背景干扰，有利于对结果进行准确判读。

实施例3、锁核苷酸对ANAB-MB环状区的Tm值影响

合成基于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G的环状区含有不同锁核苷酸残基个数的ANAB-MB(LNA-25-1、LNA-25-2、LNA-21-1、LNA-17-2和LNA-13-3)，将不含有锁核苷酸残基的ANAB-MB control-25作为对照，各分子信标的具体信息如下：

control-25:

LNA-25-1:

LNA-25-2:

LNA-21-1:

LNA-17-2:

LNA-13-3:

其中，FAM为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团；方框部分为茎杆区序列，将FAM端茎杆区序列记为茎杆区1，将Dabcyl端茎杆区序列记为茎杆区2；下划线部分为环状区，可以识别靶序列；*G表示非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基(isoG)，*C表示非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，自由状态时，ANAB-MB中的iso^MeC和isoG形成非天然核苷酸对iso^MeC-isoG；+G和+C均为锁核苷酸残基，其非碱基部分均如图3所示。

合成ANAB-MB control-25环状区对应的幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药位点23SrRNA A2143G序列DNA片段，以下简称靶标1，靶标1DNA片段:5'-AGGTCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-3'

合成靶标1对应的野生型幽门螺旋杆菌23S rRNA序列DNA片段，以下简称靶标2，靶标2DNA片段:5'-AGGTCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-3'。

靶标2与ANAB-MB control-25环状区不完全互补，存在1bp的错配，将ANAB-MBcontrol-25环状区互补序列靶标1及不完全互补序列靶标2分别与各分子信标变性后一同退火，再通过熔解曲线法测定了上述各分子信标环状区的Tm值；实验在Roche LightCycler480上进行，结果见表2。

结果显示，而向环状区引入锁核苷酸后，在分子信标环区长度不变的情况下，随着环状区锁核苷酸数目的增加，分子信标环状区的Tm值逐渐增加；在分子信标环区Tm值无明显变化的情况下，随着环状区锁核苷酸数目的增加，分子环区长度可逐渐减小；分子信标环状区靶序列与错配序列的ΔTm值随着环状区锁核苷酸的引入而增大，在环状区序列长度缩短的情况下ΔTm值增大尤其显著，见表2。

表2：各分子信标环状区Tm值比较

因此：1、可通过增加分子信标环状区的锁核苷酸个数来提高分子信标的Tm值,即其与靶标序列结合的亲和力；2、在保持分子信标的Tm值不变时，可通过向分子信标的环状区引入锁核苷酸以缩短分子信标环状区的长度；3、向分子信标的环状区引入锁核苷酸可以增大与错配序列的ΔTm值，在环状区缩短后ΔTm值增大尤其明显，ΔTm值的增大可以提升分子信标的特异性，进而增强分型效果，同时降低分子信标的设计难度。

实施例4、新型分子信标的特异性实验

待测样本：含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G的突变型幽门螺旋杆菌、不含克拉霉素耐药位点的野生型幽门螺旋杆菌、Brevibacterium casei、及Klebsiellapneumonia。其中，含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G的突变型幽门螺旋杆菌为BNCC细胞库产品(ATCC 700392)、不含克拉霉素耐药位点的野生型幽门螺旋杆菌为BNCC细胞库产品(BNCC105772)、Brevibacterium casei为BNCC细胞库产品(BNCC198452)、Klebsiellapneumonia为BNCC细胞库产品(BNCC194471)。

设计并合成能扩增幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G的特异性引物对，将该引物对命名为引物对A2，引物对A2由A2-F和A2-R组成，其序列如下：

A2-F：5'-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTAC-3'

A2-R：5'-GCATGATATTCCCATTAGCAGTG-3'

提取各菌株的基因组DNA，按照1:100的比例稀释到正常人类细胞的全基因组DNA去，已成功建立了标准检测样本可以模拟临床检测样本。以各标准检测样本作为模板，开展荧光定量PCR,将新型分子信标LNA-13-3与普通分子信标control-25进行对比。定量PCR检测试剂EX Taq DNA聚合酶、dNTPs与反应缓冲液均为TAKARA公司产品，具体实验操作参照其产品说明书。

结果(图7)显示，新型分子信标LNA-13-3对于含克拉霉素耐药位点23S rRNAA2143G突变型幽门螺旋杆菌，检测管有扩增S型曲线，表明检测结果阳性，待测菌株为克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌，与实际情况一致；对于不含克拉霉素耐药位点的野生型幽门螺旋杆菌、Brevibacterium casei、及Klebsiella pneumonia，均无S型扩增曲线，表明检测结果阴性，与实际情况一致。

结果(图8)显示，普通分子信标control-25对于含克拉霉素耐药位点23S rRNAA2143G突变型幽门螺旋杆菌，检测管有扩增S型曲线，表明检测结果阳性，待测菌株为克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌，与实际情况一致；但是对于不含克拉霉素耐药位点的野生型幽门螺旋杆菌，扩增曲线起干扰峰，导致检测结果不可靠。

说明，新型分子信标LNA-13-3在检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌或是否为克拉霉素耐药幽门螺旋杆菌时具有很好的特异性。

<110> 北京福安华生物科技有限公司、葛猛

<120> 一种基于人工模拟核酸的分子信标

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 106

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 1

acctgatgat gtgatggatg gcgtggcaag catgatccat gaagtgggta ttgaagcgat 60

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<210> 2

<211> 91

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 2

gtggaggtga aaattcctcc tacccgcggc aagacggaga gaccccgtgg acctttacta 60

caacttagca ctgctaatgg gaatatcatg c 91

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ccatcgattg aagcgatgtt tcctgatggg acgatgg 37