阅读说明：本技术 小分子NF-κB抑制剂治疗恶性血液肿瘤的应用 (Application of small molecule NF-kB inhibitor in treating malignant blood tumor ) 是由 约翰内斯·扎克热夫斯基 刘秀枝 S·吴 于 2017-12-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抑制NF-κB的化合物和组合物,其可用于恶性血液肿瘤、例如淋巴瘤和骨髓瘤的治疗。本发明也提供了抑制选自由淋巴瘤细胞及骨髓瘤细胞构成的组的细胞的生长和增殖的方法以及使用可抑制NF-κB的化合物和组合物来治疗恶性血液肿瘤的方法。(The present invention relates to compounds and compositions that inhibit NF- κ B, which are useful for the treatment of hematological malignancies, such as lymphomas and myelomas. The invention also provides methods of inhibiting the growth and proliferation of cells selected from the group consisting of lymphoma cells and myeloma cells and methods of treating hematological malignancies using compounds and compositions that inhibit NF- κ B.)

小分子NF-κB抑制剂治疗恶性血液肿瘤的应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月27日提交的美国临时申请62/439,335和2016年12月28日提交的美国临时申请62/439,841的优先权；两者的内容均在此引入作为参考。

政府资助

本发明是在国立卫生研究院授予的CA160659政府资助项下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明提供了使用能够抑制NF-κB的化合物和药物组合物来治疗恶性血液肿瘤的方法。

背景技术

NF-κB/Rel(核因子κB)是一个转录因子家族，包括p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)、p65(RelA)、c-Rel和RelB。这些分子可以同质或异质二聚化，并且通常被它们的抑制剂(IκB)隔离在细胞质中。激活时，IκB会被26s蛋白酶体降解，并且NF-κB二聚体迁移到细胞核内执行转录活性。

NF-κB(p50/p65)和c-Rel由典型的IKKα/β/γ激酶复合物途径调节，而RelB和p52(NF-kB2)则由IKKα/NIK复合物的替代途径进行调节。尽管存在这种相似性，但是每个NF-κB家族成员在组织表达模式、对受体信号的响应和靶基因特异性方面是不同的。这些差异经由个体NF-κB/Rel基因剔除小鼠表现出的非冗余表型而证明。因此，以不同NF-κB/Rel成员为靶向的治疗剂可能会具有不同的生物学效应和毒性特征。

许多受体和刺激物可以激活NF-κB/Rel，包括TCR/BCR、TNF受体超家族(例如CD40、TNFR1、TNFR2、BAFF、APRIL、RANK)、IL-1/TLR受体和Nod样受体，以及激活癌基因(例如Src、Ras、LMP-1、Tax、v-FLIP)、活性氧自由基、辐射和化学治疗剂。作为对这些刺激的响应，NF-κB/Rel会调节细胞因子、趋化因子以及在粘附、细胞周期、细胞凋亡和血管生成中起作用的分子的表达。因此，NF-κB/Rel转录因子是许多人类疾病(包括炎症、自身免疫疾病和癌症)的重要治疗靶点，并且NF-κB/Rel的小分子抑制剂可用作这些疾病的治疗剂。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及使用能够抑制NF-κB的化合物和组合物治疗恶性血液肿瘤的方法。

本发明基于抑制NF-κB的化合物的发现，其选自由以下构成的组：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

因此，在一个方面中，本发明涉及一种抑制白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞、急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、慢性髓性白血病(CML)细胞、急性髓性白血病(AML)细胞、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞生长和增殖的方法，包括使所述细胞与选自由以下构成的组的化合物相接触：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

在一种实施方式中，所述细胞为淋巴瘤细胞。在另一种实施方式中，所述细胞为骨髓瘤细胞。

因此，在一个方面中，本发明涉及一种抑制细胞生长和增殖的方法，所述细胞选自由淋巴瘤细胞和骨髓瘤细胞构成的组，包括使所述细胞与选自由以下构成的组的化合物相接触：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

在另一个相关的方面中，本发明涉及一种通过向受试者施用治疗有效量的选自由以下构成的组的化合物来治疗患有恶性肿瘤的受试者的方法，所述恶性肿瘤选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

因此，在另一个相关的方面中，本发明涉及通过向受试者施用治疗有效量的选自由以下构成的组的化合物来治疗患有淋巴瘤或骨髓瘤的受试者的方法：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

在一种实施方式中，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤；在另一种实施方式中，所述淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

在另一个相关的方面中，本发明涉及一种通过向受试者施用治疗有效量的选自由以下构成的组的化合物与硼替佐米(bortezomib)或帕比司他(panobinostat)的组合来治疗患有淋巴瘤或骨髓瘤的受试者的方法：

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐。

因此，在另一个相关的方面中，本发明涉及一种药物组合物，包括

及其结晶形式、水合物或药学上可接受的盐与硼替佐米或帕比司他的组合。

附图说明

图1示出了IT-848抑制B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞中的NF-κB活性。将人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞(HBL-1和U2932)和多发性骨髓瘤细胞(MM.1S和U266)在IT-848(2、4或6μM)或空载体存在下培养12小时。通过NF-κB途径信号转导分子IKK-β和IkB-α的蛋白质印迹来分析NF-κB活性。β肌动蛋白作为内部对照被包括在内。

图2示出了IT-848是比IT-878更有效的NF-κB抑制剂。用TNF-α刺激Jurkat/GFP/NF-κB转录报告细胞，并在空载体或1、3和6μM的IT-848或IT-878存在下孵育8和22小时。通过流式细胞术分析NF-κB转录活性(GFP平均荧光强度)。给出相对荧光强度的平均值和SEM。

图3示出了IT-848和IT-878是NF-κB转录活性的特异性抑制剂。用PMA/离子霉素刺激Jurkat/GFP/NF-κB转录报告细胞，并用叔丁基氢醌处理HepG2/荧光素酶/Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)转录报告细胞。将各细胞系在空载体或1、3、6和10μM的IT-848或IT-878存在下孵育12小时。通过流式细胞术分析NF-κB转录活性，通过荧光测量分析NFAT和Nrf2转录活性。给出相对荧光或发光强度的平均值和SEM。

图4示出了用IT-848和IT-878对健康细胞的处理涉及中等毒性。将小鼠脾细胞和人外周血单核细胞(PBMC)在空载体或1、3、6和10μM的IT-848或IT-878存在下孵育24小时。通过流式细胞术分析生存力(DAPI阴性细胞的百分比)，并通过MTS测定分析代谢活性。给出相对生存力或代谢活性的平均值和SEM。

图5A示出了IT-848抑制MM.1S多发性骨髓瘤细胞的生长。将MM.1S人多发性骨髓瘤细胞在空载体或2、4和6μM的IT-848、IT-878、PS-1145或依鲁替尼的存在下孵育48小时，在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出平均值和SEM或相对细胞生长。

图5B示出了IT-848抑制U266多发性骨髓瘤细胞的生长。将U266人多发性骨髓瘤细胞在空载体或2、4和6μM的IT-848、IT-878、PS-1145或依鲁替尼存在下孵育48小时，在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出平均值和SEM或相对细胞生长。

图5C示出了IT-848抑制TMD8B细胞淋巴瘤细胞的生长。将TMD8人DLBCL细胞在空载体或2、4和6μM的IT-848、IT-878、PS-1145或依鲁替尼存在下孵育48小时，在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出平均值和SEM或相对细胞生长。

图5D示出了IT-848抑制SUDHL4B细胞淋巴瘤细胞的生长。将SUDHL4人DLBCL细胞在空载体或2、4和6μM的IT-848、IT-878、PS-1145或依鲁替尼存在下孵育48小时，在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出平均值和SEM或相对细胞生长。

图6示出了IT-848调节多发性骨髓瘤细胞的氧化还原状态。在空载体或IT-848的一系列稀释液存在下培养MM.1S细胞、U266细胞或小鼠脾细胞。在4小时和24小时后通过DCFDA测定来量化ROS水平。

图7示出了IT-848的药代动力学。全身给药后，IT-848被缓慢地清除。

图8A和8B示出了IT-848增强硼替佐米在多发性骨髓瘤的异种移植模型中的功效。NSG小鼠静脉内接受2.5×10⁶个荧光素酶表达的MM.1S细胞。10天后，确认植入并将小鼠分成4组：空载体i.p.M/W/F×4周；硼替佐米0.5mg/kg i.p.M/T×4周；IT-848 10mg/kgi.p.M/W/F×4周；硼替佐米M/T+IT-848M/W/F×4周。A.通过体内生物发光成像分析肿瘤生长。B.给出了生物发光强度的平均值和SEM。N＝7-10曲线下面积(AUC)用于总结每个受试者的生物发光强度，并且进行置换检验以确定组之间的AUC是否存在差异。P值如下：第1组对第2组：0.008；第2组对第3组：0.032；第1组对第3组：<0.001；第2组对第4组：<0.001；第1组对第4组：<0.001；第3组对第4组：0.029。

图9将小鼠分成三个治疗组(IT-848单一药剂、硼替佐米单一药剂、IT-848和硼替佐米的组合)和对照组(空载体)。在所有三个治疗组中，后腿***发作(该模型中的疾病进展的临床终点)均被延迟(图9)。包括纵向BLI数据(图8B)的统计分析的体内BLI(图8A)显示IT-848和硼替佐米都是有效的，但组合治疗是最佳的。

图10示出了IT-848抑制Nf-kB靶基因白细胞介素6(IL-6)的表达。将TMD8、HBL1和U266细胞在空载体或IT-848(4和6μM)存在下孵育24小时。在12和24小时后通过ELISA分析培养基中的IL-6浓度。给出相对IL-6水平(载体的百分比)的平均值和SEM。

图11示出了IT-848抑制Nf-kB靶基因白细胞介素10(IL-10)的表达。将TMD8、HBL1和U266细胞在空载体或IT-848(4和6μM)存在下孵育24小时。在12和24小时后通过ELISA分析培养基中的IL-10浓度。给出相对IL-10水平(载体的百分比)的平均值和SEM。

图12示出了IT-848增强组蛋白脱乙酰基酶抑制剂帕比司他对TMD8细胞的活性。将TMD8和DLBCL细胞在空载体、IT-848(4μM)、帕比司他(0.1μM)或IT-848和帕比司他的组合的存在下孵育48小时。在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出相对细胞生长的平均值和SEM。

图13示出了IT-848增强蛋白酶体抑制剂硼替佐米对HBL1细胞的活性。将HBL1人DLBCL细胞在空载体、IT-848(4μM)、硼替佐米(0.02μM)或IT-848和硼替佐米的组合的存在下孵育48小时。在24和48小时后通过MTS测定分析细胞增殖。给出相对细胞生长的平均值和SEM。

具体实施方式

所有专利，公开的申请和其它出版物以及参考文献通过引用整体并入本发明。

这里使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不是限制性的。如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。

为了描述本文的数值范围，明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0被明确考虑。

术语“约”通常表示指示值的±0.5％、1％、2％、5％或多达±10％。例如，“约10wt％”的量在其最广泛的意义上通常表示10wt％±10％，其表示9.0-11.0wt％。术语“约”可以替代地表示一个组的物理特征的变化或平均值。

可用于实施本发明方法的化合物包括如下：选自由以下构成的组的化合物：

及其结晶形式、水合物或其药学上可接受的盐。

如在本文中所使用的，术语“化合物”是指通过一个或多个化学键连接的两个或更多个原子。在本发明中，“化学键”和“键”是可互换的，包括但不限于共价键、离子键、氢键和范德华力。本发明的共价键包括单键、双键和三键。本发明的化合物包括但不限于有机分子。如果它们通过本发明的化学键连接，则包含本发明化合物的原子“被连接”。

本发明的有机化合物包括具有或不具有官能团的直链、支链和环状烃。当与化学基团(chemical moiety)，例如烷基、烯基、炔基或烷氧基，联合使用时，术语“C_x-y”意指包括链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“C_x-y烷基”是指取代的或未取代的饱和烃基，包括链中含有x至y个碳的直链烷基和支链烷基，包括卤代烷基，例如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。术语“C_x-y烯基”和“C_x-y炔基”是指取代或未取代的不饱和脂族基团，其长度与上述烷基类似并且可能取代上述烷基，但分别含有至少一个双键或三键。

术语“独立选择的”及其语法变体意指在本发明的化学结构中(例如，式I)，如果结构中多于一个原子可以从一系列元素中选择，那么所述原子可以是也可以不是同一种元素。类似地，如果结构中不只一个化学基团可以从一系列化学基团中选择，那么所述基团可以相同或不同。

在本发明中，能够抑制NF-κB的化合物可以作为直接或间接的NF-κB抑制剂起作用。直接的NF-κB抑制剂是直接与NF-κB家族成员结合或相互作用并抑制其DNA结合和转录功能的化合物。间接的NF-κB抑制剂是与NF-κB家族成员以外的化合物结合或相互作用，从而对NF-κB活性产生下游抑制作用的化合物。

如在本文中所使用的，术语“接触”是指使本发明的化合物极为贴近本发明的细胞。这可以使用向哺乳动物给药的常规技术来实现，包括但不限于尾静脉注射、静脉内注射、经过口服或通过将该化合物添加到本发明的细胞位于其中的培养基中。

本发明的另一种实施方式涉及一种用本文公开的任何化合物和/或其药学上可接受的制剂来抑制淋巴瘤或骨髓瘤细胞的方法。

在本发明中，术语“结晶形式”是指化合物的晶体结构。化合物可以以一种或多种结晶形式存在，其可以具有不同的结构、物理、药理学或化学特征。利用成核、生长动力学、附聚和断裂的变化，可以获得不同的结晶形式。

当相变能垒被克服时会导致成核，从而允许颗粒由过饱和溶液形成。晶体生长是由化合物沉积在晶体的现有表面上引起的晶体颗粒的增大。成核和生长的相对速率决定了形成的晶体的尺寸分布。成核和生长的热力学驱动力均是过饱和度，其被定义为与热力学平衡的偏差。附聚是通过两个或多个粘附在一起并形成更大晶体结构的颗粒(例如晶体)来形成更大的颗粒。

如在本文中所使用的，术语“水合物”是指分子络合物中含有水的化合物的固体或半固体形式。相对于化合物，水通常为化学计量。

如在本文中所使用的，“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的衍生物，其中，化合物通过制备成其酸盐或碱盐来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱式盐或有机盐；等等。例如，这些盐包括来自氨、L-精氨酸、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、氢氧化钙、胆碱、二乙醇胺(2,2’-亚氨基双(乙醇)、二乙胺、2-(二乙氨基)乙醇、2-氨基乙醇、乙二胺、N-乙基-葡萄糖胺、海巴明(ydrabamine)、1H-咪唑、赖氨酸、氢氧化镁、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、1-(2-羟基-乙基)-吡咯烷、氢氧化钠、三乙醇胺(2,2',2“-次氮基三(乙醇))、氨丁三醇、氢氧化锌、乙酸、2.2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、(+)-樟脑酸、(+)-樟脑-10-磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己基氨基磺酸、癸酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙二胺四乙酸、甲酸、富马酸、芥子酸(galacaric acid)、龙胆酸、D-葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、谷氨酸、2-氨基戊二酸(glutantic acid)、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、甘氨酸、乙醇酸、己酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸异丁酸、DL-乳酸、乳糖酸、月桂酸、赖氨酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、DL-扁桃酸、甲磺酸、半乳糖二酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、辛酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(亚甲基双羟萘酸)、磷酸、丙酸、(-)-L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸和十一碳烯酸的盐。其它药学上可接受的盐可以与例如铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌等金属的阳离子形成。(Pharmaceutical salts,Berge,S.M.etal.,J.Pharm.Sci.,(1977),66,1-19)。

本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由本文公开的化合物合成，所述化合物含有碱性或酸性基团。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与足量的适当的碱或酸在水中或在有机稀释剂如***、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈或者其混合物中进行反应来制备。

本发明的组合物包含一种或多种活性成分与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体以及任选的一种或多种其它化合物、药物、成分和/或材料的混合物。无论选择何种给药途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的制剂/化合物配制成药学上可接受的剂型。例如参见Remington,The Science and Practice of Pharmacy)(第21版,Lippincott Williams and Wilkins,费城,美国宾夕法尼亚州)。

药学上可接受的稀释剂或载体是本领域熟知的(例如参见Remington,TheScience and Practice of Pharmacy)(第21版,Lippincott Williams and Wilkins,费城,宾夕法尼亚州)和国家处方集(The National Formulary)(美国制药协会，华盛顿特区)(American Pharmaceutical Association,Washington,D.C.)，并且包括糖类(如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇)、淀粉、纤维素制剂、磷酸钙(如磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液)、醇类(如乙醇、丙醇和苯甲醇)、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯(如油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(如聚乳酸-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、芝麻、棉籽和花生)、可可脂、蜡(例如栓剂蜡)、石蜡、硅酮、滑石粉、硅酸盐等。在本发明药物组合物中使用的每种药学上可接受的稀释剂或载体必须是在与制剂的其它成分相容并且对受试者无害的意义上“可接受的”。适用于所选剂型和预期给药途径的稀释剂或载体是本领域熟知的，并且用于所选剂型和给药方法的可接受的稀释剂或载体可以使用本领域公知技术来确定。

任选地，本发明的组合物可含有通常用于药物组合物中的其它成分和/或材料。这些成分和材料是本领域公知的，包括(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和***胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和十二烷基硫酸钠；(10)悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12)赋形剂，如乳糖、乳糖(milk sugar)、聚乙二醇、动植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石粉、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末；(13)惰性稀释剂，如水或其它溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控制释放或吸收延迟剂，例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)乳浊剂；(19)佐剂；(20)润湿剂；(21)乳化和悬浮剂；(22)增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯；(23)推进剂，如氯氟烃和挥发性未取代的烃，如丁烷和丙烷；(24)抗氧化剂；(25)使制剂与预期接受者的血液等渗的药剂，如糖和氯化钠；(26)增稠剂；(27)包衣材料，如卵磷脂；(28)甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。在与制剂的其它成分相容并且对受试者无害的意义上，每种这样的成分或材料必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期给药途径的成分和材料是本领域熟知的，并且用于所选剂型和给药方法的可接受成分和材料可以使用本领域公知技术来确定。

适合于口服给药的本发明的组合物可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、颗粒、溶液或水性或非水性液体中的悬浮液、水包油或油包水液体乳液、酏剂或糖浆、锭剂、大丸剂、药糖剂或糊剂的形式。这些制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如，通过常规的锅包衣、混合、制粒或冻干工艺。

用于口服给药的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)可以通过例如将活性成分与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体，以及任选的一种或多种填料、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂和/或着色剂混合来制备。使用合适的赋形剂，可以将相似类型的固体组合物用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂可以通过压缩或模塑制成，任选地含有一种或多种辅助成分。可以使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制来制备。片剂和其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒，可任选地用包衣和外壳刻痕(score)或制备，例如肠溶包衣和药物制剂领域熟知的其它包衣。它们也可以配制成在其中提供活性成分的缓慢或控制释放。它们可以通过例如细菌截留过滤器过滤来灭菌。这些组合物还可以任选地含有乳浊剂，并且可以是这样的组合物，使得它们任选以延迟的方式仅在或优先在胃肠道的某一部分释放活性成分。活性成分也可以是微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液，微乳液，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。液体剂型可含有本领域常用的合适的惰性稀释剂。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。悬浮液可能含有悬浮剂。

用于直肠或***给药的本发明的组合物可以作为栓剂提供，其可以通过将一种或多种活性成分与一种或多种合适的非刺激性稀释剂或载体混合来制备，所述稀释剂或载体在室温下为固体，但是在体温下是液体，因此，它会在直肠或***腔内融化并释放出活性化合物。适用于***给药的本发明的药物组合物还包括含有本领域已知的适当的药学上可接受的稀释剂或载体的***栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。

用于局部或透皮给药的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。活性剂/化合物可以在无菌条件下与合适的药学上可接受的稀释剂或载体混合。软膏、糊剂、乳膏和凝胶可含有赋形剂。粉末和喷雾剂可含有赋形剂和推进剂。

适用于肠胃外给药的本发明的组合物可包含一种或多种试剂剂/化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液、或者可以仅在使用前将其重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，其可以含有合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。例如，通过使用包衣材料，通过在分散的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。这些药物组合物还可含有合适的佐剂，如润湿剂、乳化剂和分散剂。还可能需要包含等渗剂。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂来延长可注射药物形式的吸收。

在一些情况下，为了延长药物(例如药物制剂)的效果，期望减缓其从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。

活性剂/药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，可以通过将活性剂/药物溶解或悬浮在油性载体中来实现胃肠外给药的药剂/药物的延迟吸收。可通过在可生物降解的聚合物中形成活性成分的微囊基质来制备可注射的药性持久的形式。根据活性成分与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制活性成分释放的速率。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备药性持久的可注射制剂。可注射材料可以灭菌，例如通过细菌截留过滤器过滤来灭菌。

本发明的任何制剂可以以单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)提供，并且可以在冻干条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体稀释剂或载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

用作NF-κB转录活性的抑制剂

氧化应激和NF-κB在健康和患病细胞中发挥不同的作用。细胞氧化还原平衡的操纵在癌症环境下具有治疗上可利用的潜力。NF-κB家族成员如c-Rel的固有活性与肿瘤发生和化疗耐药性有关，使得NF-κB成为多种癌症(包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤)的合理治疗靶点。活性氧和活性氮(ROS/RNS)和NF-κB通路之间存在多种相互作用：NF-κB是氧化应激反应的重要部分，同时已知ROS能够通过DNA结合域的硫醇修饰来抑制NF-κB的活性。在本发明中，公开了将NF-κB DNA结合的抑制与调节癌细胞的氧化还原平衡的能力相结合的化合物，其导致有效的免疫调节性质和抗肿瘤活性。

图1示出了蛋白质印迹，其证实本发明化合物IT-848在人B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞中对NF-κB途径活性的剂量依赖性抑制。使用NF-κB-GFP报告细胞系抑制两个分子的NF-κB活性，在孵育8和22小时后检测IT-848和IT-878(图2)。IT-848比IT-878更有效，并且其在6微摩尔浓度下导致NF-kB活性的完全抑制。

为了证实IT-848的效力，我们分析了使用IT-848处理的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中B细胞恶性肿瘤(NF-kB靶基因IL-6和IL-10)中和多发性骨髓瘤(MM)细胞系中的NF-kB活性的替代标志物的表达(图10+11)。我们发现在TMD8细胞(DLBCL)、HBL1细胞(DLBCL)和U266细胞(MM)中处理12和24小时后两种细胞因子的分泌均降低。我们还对IT-848联合目前临床用于治疗B细胞恶性肿瘤的药物进行了功效研究。TMD8和HBL1细胞中的MTS测定显示IT-848可以增强硼替佐米或帕比司他的功效(图12+13)。

接下来，评估了IT-848和IT-878的特异性。转录活性的抑制对NF-κB具有特异性，但不受NFAT和Nrf2的影响(图3)。为了确定可能的非特异性毒性，在IT-848和IT-878的连续稀释液存在下培养健康小鼠脾细胞或人外周血源性的单核细胞(PBMC)(图4)，显示出健康细胞的活力和代谢活性可接受的妥协水平。我们接下来分析了IT-848在DLBCL和MM细胞的MTS测定中的抗癌特性(图5)。包括两种化合物(IT-848、IT-878)和具有NF-κB抑制活性的已知生物活性试剂(PS-1145、依鲁替尼)作为参考药物。IT-848表现出强烈的抗淋巴瘤和抗骨髓瘤活性。鉴于IT-848具有氧化还原性质，我们评估了其对MM细胞氧化还原状态的影响(图6)。MM.1S和U266细胞在基线时具有高水平的活性氧(ROS)，并且用IT-848处理4小时后导致水平不变或增加，处理24小时后导致水平降低。小鼠脾细胞的ROS水平比MM细胞低50至100倍，IT-848处理4小时后没有改变水平，并在24小时后导致小幅增加。导致ROS水平4小时后增加、然后24小时后ROS水平降低的癌细胞氧化还原状态的调节与功效相关。

接下来，我们通过分析口服(PO)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)给药后的IT-848的全血或血浆水平来研究IT-848的药代动力学(PK)(图7)。结果表明IT-848的清除缓慢，特别是在腹膜内或口服给药后，表明每24小时给药或甚至更长的给药间隔应足以实现所需的生物学效应。最后，在MM异种移植模型中进行体内功效研究。免疫缺陷小鼠静脉内接受生物发光的MM.1S细胞，并在10天后通过体内生物发光成像(BLI)证实骨髓植入。将小鼠分配至三个治疗组(IT-848单一药剂、硼替佐米单一药剂、IT-848和硼替佐米的组合)和对照组(空载体)。在所有三个治疗组中，后腿***发作(该模型中的进行性疾病的临床终点)均被延迟(图9)。包括纵向BLI数据(图8B)的统计分析的体内BLI(图8A)显示IT-848和硼替佐米都是有效的，但组合治疗是最佳的。

提供以下实施例以进一步说明本发明的方法。这些实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。实施例

实施例1：通用合成方案

本发明的NF-κB抑制剂可以通过本领域已知的任何合适的或如下文进一步描述的方法合成。

方案1.2

方案1.3

方案1.4

方案1.5

方案2.1

方案2.2

方案2.3

实施例2：特定化合物合成方案

IT-848的制备

步骤1：2-氯-3-(己氧基)苯酚的制备

500mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器、回流冷凝器和温度计。将18-冠-6(3.17g，12mmol)、NaI(26.98g，180mmol)、K₂CO₃(33.17g，240mmol)、2-氯间苯二酚(29.91g，200mmol)、丙酮(116mL)和1-溴己烷(29.17g，180mmol)按照该顺序依次加入反应器中。将混合物用油浴加热。油浴温度设定为72℃。反应器内的温度在稳定的反应状态下达到60℃。混合物变得越来越稠。在反应开始5小时后，再向混合物中加入29mL丙酮。9小时后停止反应并冷却至室温。一旦反应混合物达到室温，依次向反应器中加入150mL去离子水和150mL乙酸乙酯。分离有机层，使用1MNaOH水溶液、然后用0.5MNaOH水溶液、最后用卤水洗涤。过滤有机层(使用卤水冲洗之后)。通过Rotovap浓缩滤液，以除去最大量的乙酸乙酯，并获得固体糊状残余物。向固体糊状残余物中加入80mL己烷和50mL的5MNaOH。分离己烷相并再次用50mL的1MNaOH洗涤。将己烷相经MgSO₄干燥，并浓缩至干，得到副产物2-氯-1,3-双(己氧基)苯(13.35g，42.8mmol，12.4％)。将合并的水相用12M HCl水溶液酸化至pH＝3，然后用70mL乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯相经MgSO₄干燥并浓缩至干，得到所需产物2-氯-3-(己氧基)苯酚(20.88g，91.6mmol，45.8％)。

步骤2：3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛的制备

250mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器、克莱森(Claisen)连接器、回流冷凝器和温度计。将2-氯-3-(己氧基)苯酚(20.58g，90mmol)、MgCl₂(10.28g，108mmol)和多聚甲醛(6.75g，225mmol)依次加入反应器中。将反应器置于氮气下。将乙腈(82mL)和三乙胺(16.28mL，117mmol)依次加载到反应器中。该反应是放热的。内部反应温度达到49℃。用油浴加热反应器，使内部温度达到60℃。反应混合物从浅棕色变为黄色。将反应混合物加热总共3小时。将混合物冷却至室温。将反应混合物转移至500mL锥形瓶(Erlenmeyer)中。将90mL的1M HCl水溶液小心并缓慢地加入到(放热的)锥形瓶中，然后再加入300mL去离子水和300mL乙酸乙酯。将混合物搅拌1小时。随后将有机物与水层分离，用1M HCl水溶液、然后用卤水洗涤。将有机层用MgSO₄干燥。将有机层浓缩至最大值。将残余物静置过夜，使目标产物结晶。过滤晶体，得到目标产物3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛(7.82g，30.4mmol，33.8％)。对母液进行色谱分离，得到额外的目标产物(7.21g，28.1mmol，31.2％)。总产率为65％。

步骤3：5-(3-氯-4-(己氧基)-2-羟基亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮的制备

500mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器和温度计。将3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛(6.42g，25mmol)和乙醇(100mL)装入反应器中。加热混合物，使3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛溶解在乙醇中。将混合物冷却至室温。向混合物中加入固体巴比妥酸(3.52g，27.5mmol)。加入巴比妥酸后，混合物变黄。加入巴比妥酸后，向反应混合物中加入100mL水。将反应混合物在室温下搅拌36小时。将黄色固体过滤并用真空干燥，得到目标产物(9.12g，24.8mmol，99％)。

制备5-(3-氯-4-(己氧基)-2-羟基亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮的替代方法

500mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器和温度计。将3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛(8.98g，35mmol)和异丙醇(55mL)装入反应器中。加热混合物，使3-氯-4-(己氧基)-2-羟基苯甲醛溶解在乙醇中。将混合物冷却至室温。向混合物中加入固体巴比妥酸(4.93g，38.5mmol)。加入巴比妥酸后，混合物变黄。加入巴比妥酸后，向反应混合物中加入55mL水。将反应混合物在室温下搅拌26小时。向反应混合物中加入150mL水。加入水后，将混合物搅拌30分钟。将黄色固体过滤并用真空干燥，得到目标产物(12.70g，34.6mmol，99％)。

步骤4：制备9-氯-8-(己氧基)-2H-苯并吡喃并[2,3-d]嘧啶-2,4(3H)-二酮，IT-848

250mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器、回流冷凝器和温度计。将反应器置于氮气下。将5-(3-氯-4-(己氧基)-2-羟基亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮(20.17g，55mmol)，乙酸(132.11g，2.2mol)和乙酸酐(22.46g，0.22mol)依次加入反应器中。用设定在80℃至100℃的油浴加热反应器以保持缓慢的回流冷凝。反应混合物的内部温度达到78℃。5小时后反应完成。通过Rotovap从反应混合物中部分除去乙酸和乙酸酐，直到残余物变成稠糊状物。将残余物重新悬浮在异丙醇(20mL)和乙酸(20mL)的混合物中。过滤黄色固体。将滤饼用异丙醇(5mL)和乙酸(5mL)的混合物冲洗，然后用温去离子水冲洗。将黄色滤饼真空干燥，得到目标产物IT-848(17.20g，49mmol，90％)。

制备IT-878

步骤1：2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛的制备

250mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器、回流冷凝器和温度计。将18-冠-6(2.64g，10mmol)、K₂CO₃(20.01g，145mmol)、2,4-二羟基苯甲醛(17.96g，130mmol)、丙酮(130mL)和1-溴-4-甲氧基丁烷(24.96g，149.5mmol)按该顺序依次加入反应器中。将反应器用油浴加热，回流15小时。将反应混合物冷却至室温。通过Rotovap从反应混合物中蒸发丙酮。加入150mL己烷以重悬浮去除丙酮后得到的残余物。通过过滤分离含有二烷基化和单烷基化产物但不含原料的己烷相。过滤后得到的固体用1M NaOH水溶液(150mL)溶解。用己烷(100mL)萃取混合物。将来自过滤和萃取的己烷相合并。将合并的己烷相用1M NaOH水溶液(20mL)洗涤，以将单烷基化目标产物和原料迁移至水层并将二烷基化产物保留在有机层中。将合并的水层用50％HCl酸化至pH＝8，并用乙酸乙酯萃取。用MgSO₄干燥乙酸乙酯相，浓缩并进行色谱分离，得到2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛(14.14g，63.1mmol，48.5％)。

步骤2：3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛的制备

250mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器和温度计。将2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛(13.4g，60mmol)和去离子水(20mL)加入反应器中。用冰浴冷却反应器。将45％(w/w)的KOH水溶液缓慢加入至混合物中。溶液变黄。在15分钟内，将8.25％(w/w)的NaOCl水溶液(108.4g，120mmol)加入到反应器中。将反应混合物温热至室温并静置2小时。原料完全消耗。将反应混合物用50％(v/v)的HCl水溶液酸化至pH＝1。将混合物用乙酸乙酯(150mL)萃取两次。将合并的有机层用MgSO₄干燥，浓缩并进行色谱分离，得到目标产物3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛(8.25g，32mmol，53％)。

步骤3：5-(3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮的制备

500mL容量的三颈圆底闪蒸(反应器)配备有磁力搅拌器和温度计。在反应器中，将巴比妥酸(4.51g，35.2mmol)悬浮在去离子水(100mL)中。将3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛(8.25g，32mmol)的乙醇(50mL)和异丙醇(50mL)混合溶液加入到反应器中。将反应混合物搅拌7小时。向反应混合物中加入150mL。过滤黄色固体。LCMS表明黄色固体含有94％(面积)的目标产物和6％(面积)的3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)苯甲醛。在室温下将黄色固体重新悬浮在甲醇中，然后过滤，得到目标产物5-(3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮(9.81g，26.6mmol，83％)。

步骤4：制备9-氯-8-(4-甲氧基丁氧基)-2H-苯并吡喃并[2,3-d]嘧啶-2,4(3H)-二酮，IT-878

在闪烁瓶中加入5-(3-氯-2-羟基-4-(4-甲氧基丁氧基)亚苄基)嘧啶-2,4,6(1H，3H，5H)-三酮(1.84g，5mmol)、乙酸酐(1.53g，15mmol)和乙酸(12g，200mmol)。将所述瓶密封并加热54小时。将反应冷却至室温并静置过夜。过滤黄色固体。将黄色滤饼用大量温水洗涤并真空干燥，得到IT-878(1.43g，4mmol，80％)。

用TNF-α刺激Jurkat/GFP/NF-κB转录报告细胞，用PMA/离子霉素刺激Jurkat/荧光素酶/NFAT转录报告细胞，并用叔丁基对苯二酚处理HepG2/荧光素酶/Nrf2-抗氧化剂反应元件(ARE)转录报告细胞。将各细胞系在空载体或1、3、6和10μM的IT-848或IT-878存在下孵育12小时。通过流式细胞术分析NF-κB的转录活性，通过荧光测量分析NFAT和Nrf2的转录活性。结果显示在图3中。给出相对荧光或发光强度的平均值和SEM。

实施例4：小鼠、细胞系和原代细胞

细胞系和原代细胞

根据公认的方案从供体血液中纯化人外周血单核细胞(PBMC)。使用本领域技术人员已知的方法从小鼠脾脏中纯化小鼠脾细胞。

人DLBCL衍生细胞系SU-DHL4和U2932获自德国国家菌种保藏中心，人类和动物细胞培养系(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，Department ofHuman and Animal Cell Cultures)(布伦瑞克，德国)；MM.1S和U266细胞获自ATCC；HBL1细胞由R.E.戴维斯博士(休斯顿，德克萨斯州)友情提供，并由MD安德森特征细胞系核心实验室(MD Anderson Characterized Cell Lines Core Facility)认证。逆转录病毒转导MM.1S细胞以表达由增强的绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶组成的融合蛋白。将细胞系在补充有10-20％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中，在5％CO₂的潮湿环境中于37℃培养。

NF-κB/Jurkat/GFP转录报告细胞系购自System Biosciences。NFAT/Jurkat/Luciferase转录报告细胞在纪念斯隆-凯特琳癌症中心产生。HepG2/ARE/荧光素酶Nrf2转录报告细胞购自BPS biosciences。

源自患者的肺癌、卵巢癌和乳腺癌细胞购自Cell Biologics(芝加哥，伊利诺伊州)。

小鼠

雌性NOD/scid/IL2Rγ(空白)(NSG)小鼠购自MSKCC的小鼠遗传核心实验室(mouseGenetics Core Facility)。

实施例5：分析

检测活性氧

用IT-848(式I化合物)、IT-878(式II化合物)或载体溶液在体外处理细胞。使用细胞活性氧检测试剂盒(Abcam，坎布里奇，马萨诸塞州城市)通过用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)细胞标记来分析活性氧物质(ROS)水平。通过使用流式细胞术(LSR II，BDBioscience，圣何塞，加利福尼亚州)定量荧光标记物DCFDA来分析ROS水平。

药代动力学

在腹膜内、静脉内或口服给药5-10mg/kg的IT-848后的几个时间点分析血浆或全血样品。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析样品。结果如图7所示。全身给药后IT-848缓慢清除。

体外抗肿瘤测定

将TDM8、Ly19、L363、SUDHL4、MM.1S或U266细胞在空载体、IT-化合物(2、4、6μM)、PS-1145(2、4和6μM)或依鲁替尼(2、4和6μM)存在下各自孵育长达48小时。根据制造商的说明书，通过CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验(CellTiter 96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)在24和48小时后间接测量细胞生长。简而言之，四唑化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS]被加入至培养基中，通过490nm吸光度的量测量MTS向甲瓒(formazon)的转化。活细胞数与490nm处的吸光度相关。结果显示在图5A-D中。给出相对细胞生长的平均值和SEM。

实施例6：化合物对健康细胞的抑制

将小鼠脾细胞和人外周血单核细胞(PBMC)在空载体或1、3、6和10μM的IT-848或IT-878存在下孵育24小时。通过流式细胞术分析活力(DAPI阴性细胞的百分比)，并通过MTS测定分析代谢活性。给出相对生存力或代谢活性的平均值和SEM。

实施例7：异种移植小鼠模型中的体内功效

小鼠

雌性NOD/scid/IL2Rγ(空白)(NSG)小鼠购自MSKCC的小鼠遗传核心实验室。

体内生物发光信号强度(BLI)

在肿瘤异种移植实验中，每周测定荷瘤小鼠的生物发光信号强度(BLI)。如图8A所示，显示生物发光信号强度的全身分布的伪彩色图像叠加在灰度照片上，并确定各个小鼠的总通量(光子s^-1)。基于后腿***存在确定死亡原因(肿瘤对毒性)。在没有后腿***情况下死亡归因于毒性。由于麻痹导致活动性显著受损的动物被安乐死。如图9所示，IT-848延迟了在多发性骨髓瘤的异种移植模型中瘫痪的发作。

使用蛋白质印迹和转录报告测定，我们先前证明IT-848和IT-878是有效的NF-κB抑制剂，并且基于额外的体外和体内功效研究，选择IT-848(式I)作为候选药物。为了证实弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中B细胞恶性肿瘤(NF-κB靶基因IL-6和IL-10)中NF-κB活性的替代标志物IT-848表达的效力，分析了使用IT-848处理的多发性骨髓瘤(MM)细胞系(图10和11)。在TMD8细胞(DLBCL)、HBL1细胞(DLBCL)和U266细胞(MM)中处理12和24小时后，两种细胞因子的分泌均降低。

还进行了IT-848与目前临床上用于治疗B细胞恶性肿瘤的药物组合的功效研究。TMD8和HBL1细胞中的MTS测定显示IT-848可以增强硼替佐米或帕比司他的功效(图12和13)。此外，IT-848在MM的异种移植模型中是有效的(图14、15A和15B)，并且增强了硼替佐米的功效(图15A和15B)。免疫缺陷小鼠静脉内接受生物发光的MM.1S细胞，并在10天后通过体内生物发光成像(BLI)证实骨髓植入。将小鼠分成三个治疗组(IT-848单一药剂、硼替佐米单一药剂、IT-848和硼替佐米的组合)和对照组(空载体IP)。在所有三个治疗组中，后腿***发作(该模型中的进行性疾病的临床终点)均被延迟(图9)。包括纵向BLI数据(图8B)的统计分析的体内BLI(图8A)显示IT-848和硼替佐米都是有效的，但组合治疗是最佳的。

参考文献

1.Gorrini,C.,Harris,I.S.&Mak,T.W.Modulation of oxidative stress as ananticancer strategy.Nature reviews.Drug discovery12,931-947(2013).

2.Trachootham,D.,Alexandre,J.&Huang,P.Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms:a radical therapeutic approach？Nature reviews.Drugdiscovery8,579-591(2009).

3.Hass,C.,Belz,K.&Fulda,S.Sensitization of acute lymphoblasticleukemia cells for LCL161-induced cell death by targeting redoxhomeostasis.Biochemical pharmacology(2016).

4.Irwin,M.E.,Rivera-Del Valle,N.&Chandra,J.Redox control of leukemia:from molecular mechanisms to therapeutic opportunities.Antioxidants&redoxsignaling18,1349-1383(2013).

5.Schoeneberger,H.,Belz,K.,Schenk,B.&Fulda,S.Impairment ofantioxidant defense via glutathione depletion sensitizes acute lymphoblasticleukemia cells for Smac mimetic-induced cell death.Oncogene34,4032-4043(2015).

6.Hsieh,M.Y.&Van Etten,R.A.IKK-dependent activation of NF-kappaBcontributes to myeloid and lymphoid leukemogenesis by BCR-ABL1.Blood123,2401-2411(2014).

7.Kordes,U.,Krappmann,D.,Heissmeyer,V.,Ludwig,W.D.&Scheidereit,C.Transcription factor NF-kappaB is constitutively activated in acutelymphoblastic leukemia cells.Leukemia14,399-402(2000).

8.Lavorgna,A.&Harhaj,E.W.EBV LMP1:New and shared pathways to NF-kappaB activation.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America109,2188-2189(2012).

9.Kaye,K.M.,Izumi,K.M.&Kieff,E.Epstein-Barr virus latent membraneprotein 1is essential for B-lymphocyte growth transformation.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America90,9150-9154(1993).

10.Shair,K.H.,et al.EBV latent membrane protein 1activates Akt,NFkappaB,and Stat3in B cell lymphomas.PLoS pathogens3,e166(2007).

11.Gasparini,C.,Celeghini,C.,Monasta,L.&Zauli,G.NF-kappaB pathways inhematological malignancies.Cellular and molecular life sciences:CMLS71,2083-2102(2014).

12.Shumilla,J.A.,Wetterhahn,K.E.&Barchowsky,A.Inhibition of NF-kappaB binding to DNA by chromium,cadmium,mercury,zinc,and arsenite in vitro:evidence of a thiol mechanism.Archives of biochemistry and biophysics349,356-362(1998).

13.Morgan,M.J.&Liu,Z.G.Crosstalk of reactive oxygen species and NF-kappaB signaling.Cell research21,103-115(2011).

14.Mihm,S.,Galter,D.&Droge,W.Modulation of transcription factor NFkappa B activity by intracellular glutathione levels and by variations of theextracellular cysteine supply.FASEB journal:official publication of theFederation of American Societies for Experimental Biology9,246-252(1995).

15.Shono,Y.,et al.A small-molecule c-Rel inhibitor reducesalloactivation of T cells without compromising antitumor activity.Cancerdiscovery4,578-591(2014).

16.Shono,Y.,et al.Characterization of a c-Rel inhibitor that mediatesanticancer properties in hematologic malignancies by blocking NF-kappaB-controlled oxidative stress responses.Cancer research76,377-389(2016).

17.Na,I.K.,et al.Concurrent visualization of trafficking,expansion,and activation of T lymphocytes and T-cell precursors in vivo.Blood116,e18-e25(2010).