阅读说明：本技术 噬菌体裂解酶复合粉剂及其制备方法和应用 (Phage lyase composite powder and preparation method and application thereof ) 是由 林连兵 张关令 熊燕 嵇歆彧 蔡赛波 邓先余 王峰 张棋麟 郭军 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种噬菌体裂解酶复合粉剂,其组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.15-0.2%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.15-0.2%、海藻糖0.3-0.5%、柠檬酸0.1-0.2%、甘露醇0.2-0.3%、维生素C 0.2-0.3%、硅藻土98.3-98.9%；该噬菌体裂解酶复合粉剂采用双层平板法进行体外抑菌活性检测,在常温下储存12个月且酶活保持在95%以上(酶活损失在5%以内)；该复合裂解酶制剂可用于替代抗生素抑制动物肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害病原菌的增殖,维持肠道微生态平衡。(The invention relates to a phage lyase composite powder, which comprises 0.15-0.2% of phage lyase TSPpgh, 0.15-0.2% of phage lyase MMPpgh, 0.3-0.5% of trehalose, 0.1-0.2% of citric acid, 0.2-0.3% of mannitol, 0.2-0.3% of vitamin C and 98.3-98.9% of diatomite by mass percent; the phage lyase composite powder is used for in-vitro antibacterial activity detection by adopting a double-layer plate method, and is stored for 12 months at normal temperature, and the enzyme activity is kept above 95% (the enzyme activity loss is within 5%); the compound lyase preparation can be used for replacing antibiotics to inhibit proliferation of harmful pathogenic bacteria such as escherichia coli, salmonella, staphylococcus aureus and the like in animal intestinal tracts and maintain intestinal tract microecological balance.)

噬菌体裂解酶复合粉剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种噬菌体裂解酶复合粉剂及其制备方法和应用。

背景技术

噬菌体裂解酶是一类细胞壁水解酶，可水解肽聚糖，噬菌体侵染宿主后，双链 DNA噬菌体通过穴蛋白-裂解酶裂解系统破坏细菌细胞壁结构，从而使宿主菌破裂。裂解酶一般具有两到三个结构域，参与对底物的催化和结合。作为一种新型的杀菌制剂，裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者是细菌存活的必要成分，所以细菌难以对裂解酶产生抗性，自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体，所以裂解酶的开发研究具有重要的价值。噬菌体裂解酶裂解细菌的方式有“自内裂解” ( lysis from interior ) 和“自外裂解 ”( lysis from external) 两种方式，当纯化的噬菌体裂解酶和宿主混合培养时，裂解酶通过降解细菌细胞壁肽聚糖，从而使细菌裂解死亡。噬菌体裂解酶独特的抑菌机理使其有望替代抗生素用于治疗细菌感染，并可用于清除动物肠道内特定的有害菌群，维持动物肠道健康。

长期以来用做饲料添加剂的抗菌药物有磺胺类、四环类、青霉素、氯霉素、金霉素、卡那霉素、庆大霉素等，其危害主要表现在（1）导致细菌产生抗药性；（2）造成畜禽机体免疫力下降；（3）引起畜禽内源性感染和二次感染；（4）在畜禽产品中造成残留。

抗生素的滥用还导致的食品安全和健康问题日趋严重，欧盟在2006年已经禁止在饲料中添加抗生素，中国也将在2020年全面禁止在饲料中添加抗生素；裂解酶作为一种新型杀菌剂，具有主要的3大特性；（1）特异性。裂解酶只裂解其宿主菌，对其他菌株没有杀灭作用，作为一种抗菌药，裂解酶的特异性可以有效的避免菌群失调的发生。（2）高效性。裂解酶与抗生素相比有较强的杀菌活性。裂解同等量的菌株，裂解酶的灭菌效率是抗生素的12-24倍，而且可以消除生物膜。（3）安全性。在单剂量毒性实验中，实验动物未出现任何不良反应，重要器官及组织也未见严重的炎症反应及其他病变，且裂解酶不易产生抗药性。有望取代抗生素成为动物肠道抑菌的又一途径。

噬菌体裂解酶属于蛋白酶类，在直接投喂的过程中容易受到胃酸、胆盐的干扰；此外，动物胃肠道内大量的胃蛋白酶和胰蛋白酶会把噬菌体裂解酶分解，造成其活性丧失；且噬菌体裂解酶氨基酸上的残基容易被氧化，导致活性降低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种噬菌体裂解酶复合粉剂，其组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.15-0.2%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.15-0.2%、海藻糖0.3-0.5%、柠檬酸0.1-0.2%、甘露醇0.2-0.3%、维生素C 0.2-0.3%、硅藻土98.3-98.9%。

上述噬菌体裂解酶复合粉剂的制备方法为：按常规方法，分别构建含有噬菌体裂解酶TSPpgh基因的基因工程菌和含有噬菌体裂解酶MMPpgh基因的基因工程菌，将构建成功的基因工程菌在35-38℃、100-300rmp/min下培养10-12h至基因工程菌的生物量OD₆₀₀=30-35，然后用乳糖进行诱导，诱导时间5-6h后，去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液重悬，在压力1000-1100 bar下进行高压匀浆破碎，离心收集上清液并用孔径为0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下将含有裂解酶TSPpgh的上清液、含有裂解酶MMPpgh的上清液与海藻糖、柠檬酸、甘露醇、维生素C、硅藻土混匀，干燥至含水量为8-10%，获得噬菌体裂解酶复合粉剂。

本发明所述噬菌体裂解酶TSPpgh和噬菌体裂解酶MMPpgh均在已公开的发明申请文献中公开过，其重组表达载体的构建方法为常规方法，其用于表达噬菌体裂解酶TSPpgh和噬菌体裂解酶MMPpgh的基因工程菌株为大肠杆菌BL21，转化方法也为常规方法。

将上述两种噬菌体裂解酶基因分别克隆到pET-28a(+)质粒上，验证成功后转化到大肠杆菌BL21中，实现噬菌体裂解酶TSPpgh和噬菌体裂解酶MMPpgh的基因工程表达。

所述两种噬菌体裂解酶通过发酵制备，种子培养基采用LB培养基，其组分为NaCl10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L 、pH=7.0-7.2，121℃灭菌20min；发酵培养基的组分为NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0 g/L、葡萄糖10 g/L，pH=7.0-7.5，115℃灭菌20min，发酵过程用2mol/L的NaOH调节pH=7.0。

所述诱导的乳糖浓度为20g/L，每升菌液添加50mL该浓度乳糖溶液，诱导温度为35-38℃，转速为120-150rmp/min。

用于吸附噬菌体裂解酶TSPpgh和MMPpgh的载体为食品级硅藻土（河南杰康环保科技有限公司），性状为白色细腻质粉末，是一种生物成因的硅质沉积岩，主要由古代硅藻及其它微小生物如放射虫、海绵骨针等遗体的硅质部分组成，硅藻含量达到90%；用硅藻土作为噬菌体裂解酶的吸附剂，能有效增加噬菌体裂解酶的负载量，并能与噬菌体裂解酶起到协同作用，添加到饲料中能均匀分散，并与饲料颗粒粘结混合，不易分离析出；畜禽食后促使消化，并能把畜禽肠胃道的细菌吸附后排出体外，增强动物体质，起到强筋健胃的作用。

海藻糖、甘露醇、维生素C作为一类提高机体免疫力和抗衰老的物质，用做酶保护剂可以提高蛋白酶的抗氧化能力和热稳定性，可以提高酶制剂产品的保存期限，柠檬酸可有效增强裂解酶的抑菌活性。

本发明另一目的是将上述噬菌体裂解酶复合粉剂应用在作为畜禽饲料添加剂中。

本发明提供的噬菌体裂解酶复合粉剂可以有效抑制大肠杆菌，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的增值，可代替饲料中的抗生素添加剂，用于清除畜禽肠道内有害菌；可以特异地杀灭裂解谱内的细菌，而对肠道内其它菌群不造成干扰，维持动物肠道微生态平衡，增强动物抵抗外界病原菌感染的能力。

本发明的两种噬菌体裂解酶是从腾冲热海分离得到了栖热菌 TC16 和亚栖热菌TG17的噬菌体中获得，其中噬菌体裂解酶TSPpgh在37℃-65℃范围内有抑菌活性，噬菌体裂解酶MMPpgh在37℃-50℃范围内有抑菌活性。

本发明噬菌体裂解酶复合粉剂能在常温下长时间保存，实验证明该噬菌体裂解酶复合粉剂在常温下保存，在12个月后使用酶活仍然保持在95%以上（酶活损失在5%以内）。

本发明噬菌体裂解酶复合粉剂可以有效降低白羽肉鸡的料重比，在清除白羽肉鸡盲肠病原微生物主要包括大肠杆菌和沙门氏菌的同时促进白羽肉鸡的日增重，能有效提高白羽肉鸡的法氏囊指数，盲肠指数等，实验证明该复合噬菌体裂解酶制剂可以有效提高白羽肉鸡的免疫力，增加抵抗外源致病菌侵染的能力。

抗生素的大量使用已经使耐药菌出现，并且严重威胁着人类的健康；噬菌体裂解酶是一类特殊的细菌细胞壁水解酶，它能特异地杀灭细菌，不会对其它有益菌群造成损害，可以有效控制致病菌的感染和增值而不易产生耐药性；噬菌体裂解酶制剂有望替代抗生素成为抵抗细菌性疾病新产品。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；下述实施例中，种子培养基采用LB培养基，其组分为NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、pH=7.0-7.2，121℃灭菌20min；发酵培养基的组分为NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0 g/L、葡萄糖10 g/L，pH=7.0-7.5，115℃灭菌20min，发酵过程用2mol/L的NaOH调节pH=7.0。

磷酸缓冲盐溶液（PBS）：K₂PHO₄ 0.27g、NaHPO₄ 1.42g、NaCl 8g、KCl 0.2g，加去离子水搅拌溶解，调节pH为7.4，定容至1L，121℃灭菌20min。

实施例1：本噬菌体裂解酶复合粉剂的组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.15%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.2%、海藻糖0.5%、柠檬酸0.1%、甘露醇0.2%、维生素C0.2%、硅藻土98.65%。

上述噬菌体裂解酶复合粉剂制备方法如下：将噬菌体裂解酶TSPpgh基因和噬菌体裂解酶MMPpgh基因分别被克隆到pET-28a(+)质粒上，验证成功后转化到大肠杆菌BL21中，获得含有噬菌体裂解酶TSPpgh基因的基因工程菌和含有噬菌体裂解酶MMPpgh基因的基因工程菌，将2个菌株分别接种到300mL的种子培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=2.0，然后按2%的接种量接种到发酵培养基（用20L自动发酵罐（上海百仑生物科技有限公司））中，在37℃、200rmp/min下培养10h至基因工程菌的生物量OD₆₀₀=35；

然后用乳糖进行诱导，诱导的乳糖浓度为20g/L，每升菌液添加50mL乳糖溶液，表达噬菌体裂解酶TSPpgh的宿主诱导温度为37℃，转速为150rmp/min，诱导时间为5h；表达噬菌体裂解酶MMPpgh的宿主诱导温度为37℃，转速为120rmp/min，诱导时间为5h；离心去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液重悬，用于高压匀浆破碎的宿主浓度为生物量为OD₆₀₀=15，在压力1000 bar下进行高压匀浆破碎，13000r/min离心后，收集上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下将含有裂解酶TSPpgh的上清液、含有裂解酶MMPpgh的上清液与海藻糖、柠檬酸、甘露醇、维生素C、硅藻土混匀，采用沸腾式干燥，进风温度为37℃，出风温度为30℃，干燥至含水量为8%，获得噬菌体裂解酶复合粉剂。

实施例2：本实施例噬菌体裂解酶复合粉剂的组成物及质量百分比为噬菌体裂解酶TSPpgh 0.2%、噬菌体裂解酶MMPpgh 0.15%、海藻糖0.3%、柠檬酸0.2%、甘露醇0.3%、维生素C 0.3%、硅藻土98.55%。

上述噬菌体裂解酶复合粉剂制备方法如下：将噬菌体裂解酶TSPpgh基因和噬菌体裂解酶MMPpgh基因分别被克隆到pET-28a(+)质粒上，验证成功后转化到大肠杆菌BL21中，获得含有噬菌体裂解酶TSPpgh基因的基因工程菌和含有噬菌体裂解酶MMPpgh基因的基因工程菌，将2个菌株分别接种到300mL的种子培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=1.5，然后按1.5%的接种量接种到发酵培养基（用20L自动发酵罐（上海百仑生物科技有限公司））中，在37℃、150rmp/min下培养12h至基因工程菌的生物量OD₆₀₀=30；

然后用乳糖进行诱导，诱导的乳糖浓度为20g/L，每升菌液添加50mL乳糖溶液，表达噬菌体裂解酶TSPpgh的宿主诱导温度为37℃，转速为120rmp/min，诱导时间为6h；表达噬菌体裂解酶MMPpgh的宿主诱导温度为37℃，转速为150rmp/min，诱导时间为6h；离心去除培养基，用磷酸缓冲盐溶液重悬，用于高压匀浆破碎的宿主浓度为生物量为OD₆₀₀=20，在压力1100 bar下进行高压匀浆破碎，13000r/min离心后，收集上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下将含有裂解酶TSPpgh的上清液、含有裂解酶MMPpgh的上清液与海藻糖、柠檬酸、甘露醇、维生素C、硅藻土混匀，采用沸腾式干燥，进风温度为37℃，出风温度为30℃，干燥至含水量为9%，获得噬菌体裂解酶复合粉剂。

实施例3：噬菌体裂解酶复合粉剂的体外抑菌活性检测

1、取上述实施例制得的噬菌体裂解酶复合粉剂1g于4 mL EP管中，取灭菌硅藻土1g于4mL EP管中作为对照；

2、实验组和对照组分别加入3 mL PBS；

3、在实验组和对照组中分别加入稀释至10^-5的待检测菌液200μL；

4、充分震荡后，于37℃水浴中温育30min，每隔5min震荡一次；

5、温育后取300μL用双层培养基进行检测，37℃倒置培养12h进行菌落计数；

下层固体培养基组分为：NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0 g/L、琼脂粉15.0 g/L；

上层半固体培养基组分为：NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉：5.0 g/L、琼脂粉：5.6g/L；

用于检测的大肠埃希氏菌，菌种编号：CMC(B)44102；副伤寒沙门氏菌，菌种编号：CMCC（B）50094；金黄色葡萄球菌，菌种编号：ATCC6538，由昆明理工大学生命科学与技术学院提供；使用时OD₆₀₀=1.2-1.5。

抑菌率计算公式如下：

抑菌率（K₁）=对照组菌落数-实验组菌落数/对照组菌落数×100%；

实验结果显示噬菌体裂解酶复合粉剂对宿主大肠埃希氏菌（CMC(B)44102）的抑菌率为66.23%，对副伤寒沙门氏菌（CMCC（B）50094）的抑菌率为78.3%，对金黄色葡萄球菌（ATCC6538）的抑菌率为85.2%。

实施例4：作为饲料添加剂的实验

选取315只0日龄白羽肉鸡，随机分为3个组，分别是空白对照组、阳性对照组、噬菌体裂解酶实验组，每组设3个重复；空白对照组饲喂基础日粮，阳性对照组按50ppm/kg在基础日粮中添加金霉素，噬菌体裂解酶实验组按50ppm/kg在基础日粮中添加实施例1所述的噬菌体裂解酶复合粉；实验周期为28天，实验过程中每天记录采食量和体重，于第28天早饲前进行称重，在每组中随机选择3只进行解剖并对免疫器官称重；最终计算得出平均日采食量（ADFI），平均日增重（ADG），料重比（F/G）和免疫器官指数（mg/g），计算公式如下：

平均日采食量（ADFI）=采食量/实验天数

平均日增重（ADG）=（末重—始重）/ 实验天数

料重比（F/G）=平均日采食量/平均日增重

免疫器官指数（mg/g）=免疫器官重/体重

实验结果如下所示：

	平均日采食量（ADFI）	平均日增重（ADG）	料重比（F/G）	法氏囊指数（mg/g）	脾脏指数（mg/g）
						空白对照组	25.404	10.344	0.347	1.169	1.164
阳性对照组	28.826	16.131	0.256	1.272	1.852
						噬菌体裂解酶实验组	28.331	14.656	0.280	1.091	0.894

实验结果显示，料重比（F/G）：空白对照组＞噬菌体裂解酶实验组＞阳性对照组，且阳性对照组和噬菌体裂解酶实验组料重比（F/G）差距不大，说明本发明噬菌体裂解酶复合粉用做饲料添加剂可以有效降低肉鸡料重比（F/G），接近于金霉素的作用效果。

免疫器官指数：阳性对照组＞空白对照组＞噬菌体裂解酶实验组，且噬菌体裂解酶实验组和空白对照组的免疫器官指数差距不大，说明本发明噬菌体裂解酶复合粉并没有对肉鸡的免疫水平造成影响。

实施例5：噬菌体裂解酶复合粉剂储藏活性跟踪实验

定义刚制备完成的噬菌体裂解酶复合粉剂活性为100%，分别在储藏7天、15天、30天、90天、180天、360天取样进行抑菌活性检测，检测方法参照实施例3，并通过以下公式计算噬菌体裂解酶复合粉剂酶活率。

抑菌率（Kn）=对照组菌落数-实验组菌落数/对照组菌落数×100%，其中n为0d、7d、15d、30d、90d、180d、360d；

酶活率=抑菌率（Kn）/ 抑菌率（K_0d）×100%；

结果见下表：

时间	0d	7d	15d	30d	90d	180d	360d
								酶活率	100%	98%	98%	97.5%	97%	96%	95.5%

对酶活性进行跟踪检测结果显示，在常温下储存360天，酶活的损失在5%以内，对成品特性不造成影响。