一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统及其制备方法和检测方法
阅读说明：本技术 一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统及其制备方法和检测方法 (Paper-based detection system for quantitative analysis of microRNA, and preparation method and detection method thereof ) 是由 李勇 吴云华 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医学分析领域,尤其涉及一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统及其制备方法和检测方法,所述纸基检测系统整合了靶标microRNA分子的特异性识别、滚环扩增和生物发光共振能量转移传感过程,仅利用智能手机就可在滤纸上实现microRNA的高灵敏度定量分析。此外,本发明所提供的纸基检测系统可在室温条件下长期保存,且所有检测反应可在滤纸上完成,无需繁琐的溶液配制和昂贵的专业化大型仪器。因此,具有易于运输、便携化程度高、使用简便、成本低廉、可直接向医疗条件落后地区或基层医疗单位推广的优点。(The invention relates to the field of biomedical analysis, in particular to a paper-based detection system for quantitative analysis of microRNA, a preparation method and a detection method thereof. In addition, the paper-based detection system provided by the invention can be stored for a long time at room temperature, and all detection reactions can be completed on filter paper without complicated solution preparation and expensive specialized large-scale instruments. Therefore, the portable medical device has the advantages of easy transportation, high portability, simple and convenient use, low cost and capability of being directly popularized to regions with laggard medical conditions or basic medical units.)
技术领域
本发明涉及生物医学分析领域，尤其涉及一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统及其制备方法和检测方法。
背景技术
人体中非正常表达的microRNA不仅直接参与了肿瘤等重大疾病的产生和发展过程，同时也是疾病早期诊断、临床治疗方案选择和药物疗效评价的重要标志物。因此，实现microRNA的精准定量分析对于疾病的发病机理研究和临床治疗均具有重要意义。
目前，市场上应用于microRNA检测的主要技术包括：实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、基因芯片、RNA测序、纳米分析、分子信标、以及等温扩增等。虽然上述技术可以较好地实现microRNA的定量分析，但是仍然存在检测试剂需低温保存和运输、实验操作繁琐、必须配套大型分析仪器设备和专业技术人员等问题。以上问题导致相应方法成本高昂，且严重制约了基于microRNA的诊断方法在医疗条件落后地区或基层医疗单位的普及。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统，该系统集成了靶标microRNA分子的滚环扩增和生物发光共振能量转移传感过程，仅利用智能手机就可在滤纸上实现microRNA的高灵敏度定量分析；此外，本发明所提供的纸基检测系统可在室温条件下长期保存，且所有检测反应可在滤纸上完成，无需繁琐的溶液配制和昂贵的专业化大型仪器。因此具有易于运输、便携化程度高、使用简便、成本低廉、可直接向医疗条件落后地区或基层医疗单位推广的优点。
本发明提供的技术方案为一种microRNA定量分析的纸基检测系统，所述系统至少包括滚环扩增滤纸片部分和生物发光共振能量转移传感滤纸片部分，该系统用于实现靶标分子的特异性识别、滚环扩增和生物发光共振能量转移传感过程。
一种用于纸基检测系统的制备方法，所述纸基检测系统的制备方法包括以下步骤：
(1)滤纸片的制作及封闭：将滤纸剪裁成直径为6mm的圆形纸片，使用50～100mg/mL牛血清白蛋白和0.2～1％(v/v)吐温20溶液对上述纸片进行封闭；
(2)滚环扩增滤纸片的制备：配制滚环扩增反应溶液，所述反应溶液包括以下组分：20～100mM pH为7.0～8.0的Tris-醋酸，10～20单位phi29DNA聚合酶，0.1～0.5mMdNTPs，10～100nM环状DNA探针，1～5mM二硫苏糖醇，10～20mM醋酸镁、50～100mM醋酸钾、20～60单位RNA酶抑制剂；将上述溶液滴加到经过封闭的滤纸片上，迅速用液氮冷却，置于冷冻干燥机中冻干，即制得滚环扩增滤纸片；
(3)生物发光共振能量转移传感滤纸片的制备：配制包含20～50mM pH为7.0～8.0的Tris-Cl，50～150mM NaCl，1～5mM MgCl2，0.05～0.2mM ZnCl2，10～100nM供体蛋白，50～500nM受体蛋白，0.1～1mg/mL BSA，0.5～2mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，0.1～0.5μM单链DNA片段，1～5％(w/v)甘露醇；将上述溶液滴加到经过封闭的滤纸片上，干燥，即制得生物发光共振能量转移传感滤纸片。
而且，所述能量供体蛋白和能量受体蛋白可对靶标microRNA的滚环扩增产物进行特异性识别，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA片段序列可与microRNA的滚环扩增产物进行特异性杂交，其序列如SEQ ID NO.3所示。
而且，所述环状DNA探针为根据let-7a的序列设计环状DNA探针，并通过化学合成技术制备上述探针；所述探针序列如SEQ ID NO.4所示。
而且，所述纸基检测系统的保存方法为：将滚环扩增滤纸片和生物发光共振能量转移传感滤纸片分别置于细胞培养板中，并于表面覆盖一层纸巾，置于含有干燥剂的密闭容器中，于室温下避光保存。
一种用于microRNA定量分析的纸基检测方法，包括如下步骤：
(1)纸基滚环扩增：将microRNA样本滴加到滚环扩增滤纸片上，于30～37℃孵育2～4h得到第一反应体系；
(2)纸基生物发光共振能量转移传感：向第一反应体系中加入生物发光共振能量转移传感滤纸，继续于室温孵育10～30min得到第二反应体系；
(3)信号读取：向第二反应体系中加入萤光素酶底物后得到检测体系，将检测体系放入暗盒，最终通过智能设备终端对检测结果进行读取。
而且，所述通过智能设备终端对检测结果进行读取为利用智能设备终端对检测结果进行拍摄，并通过图像处理软件分析照片中各样品的生物发光共振能量转移信号，从而实现对检测结果进行读取。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明所述纸基检测系统经室温条件下保存3个月后，分析性能不会产生明显衰减，因此无需低温保存，显著降低了储存和运输的难度和成本；(2)所述检测过程仅通过向滤纸片上滴加microRNA样品就可完成，无需繁琐的溶液配制和苛刻的实验条件控制，所得结果可通过智能手机读取，因此具有便携化程度高、易于操作、不受人员和实验仪器限制的优势。
附图说明
图1为本发明提供的纸基检测系统的检测原理示意图；
图2为本发明实施例1中制备的能量供体蛋白和能量受体蛋白的电泳结果图；
图3为本发明实施例2中生物发光共振能量转移信号对let-7a浓度变化的线性响应图；
图4为本发明实施例3中生物发光共振能量转移信号对let-7a浓度变化的线性响应图。
具体实施方式
本发明旨在保护一种用于microRNA定量分析的纸基检测方法、检测系统及检测系统的制备方法。
一种用于microRNA定量分析检测方法的纸基检测系统，所述系统至少包括滚环扩增滤纸片部分和生物发光共振能量转移传感滤纸片部分，该系统用于实现靶标分子的特异性识别、滚环扩增和生物发光共振能量转移传感过程。
一种用于纸基检测系统的制备方法，所述纸基检测系统的制备方法包括以下步骤：
(1)滤纸片的制作及封闭：将滤纸剪裁成直径为6mm的圆形纸片，使用50～100
mg/mLBSA和0.2～1％(v/v)吐温20溶液对上述纸片进行封闭；
(2)滚环扩增滤纸片的制备：配制滚环扩增反应溶液，所述反应溶液包括以下组分：20～100mM Tris-醋酸(pH＝7.0～8.0)，10～20单位phi29DNA聚合酶，0.1～0.5mMdNTPs，10～100nM环状DNA探针，1～5mM二硫苏糖醇，10～20mM醋酸镁、50～100mM醋酸钾、20～60单位RNA酶抑制剂；将上述溶液滴加到经过封闭的滤纸片上，迅速用液氮冷却，置于冷冻干燥机中冻干，即制得滚环扩增滤纸片；
(3)生物发光共振能量转移传感滤纸片的制备：配制包含20～50mM Tris-Cl(pH＝7.0～8.0)，50～150mM NaCl，1～5mM MgCl2，0.05～0.2mM ZnCl2，10～100nM供体蛋白，50～500nM受体蛋白，0.1～1mg/mL BSA，0.5～2mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，0.1～0.5μM单链DNA片段，1～5％(w/v)甘露醇的反应溶液；将上述溶液滴加到经过封闭的滤纸片上，干燥，即制得生物发光共振能量转移传感滤纸片；所述能量供体蛋白和能量受体蛋白可对靶标microRNA的滚环扩增产物进行特异性识别，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA片段序列可与microRNA的滚环扩增产物进行特异性杂交，其序列如SEQ IDNO.3所示。
一种用于microRNA定量分析的纸基检测方法，包括如下步骤：
(1)纸基滚环扩增：将microRNA样本滴加到滚环扩增滤纸片上，于30～37℃孵育2～4h得到第一反应体系；
(2)纸基生物发光共振能量转移传感：向第一反应体系中加入生物发光共振能量转移传感滤纸，继续于室温孵育10～30min得到第二反应体系；
(3)信号读取：向第二反应体系中加入萤光素酶底物后得到检测体系，将检测体系放入暗盒，最终通过智能设备终端对检测结果进行读取。
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1：本实施例中以let-7a序列作为检测对象，检测原理如图1所示。本实施例中首先制备用于let-7a定量分析的纸基检测系统，方法如下：
(1)滤纸片的制作及封闭：用打孔器将滤纸剪裁成圆形纸片(直径6mm)；向上述纸片滴加10μL封闭缓冲液(100mg/mL的BSA，0.5(v/v)吐温20)后，于37℃干燥过夜；
(2)环状DNA探针的设计与合成：根据let-7a的序列设计环状DNA探针，并通过化学合成技术制备上述探针；所述探针序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)滚环扩增滤纸片的制备：向经过封闭的滤纸片上滴加20μL扩增反应溶液(50mMTris-醋酸，10单位phi29DNA聚合酶，0.2mM dNTPs，50nM环状DNA探针，2mM二硫苏糖醇，10mM醋酸镁、60mM醋酸钾、40单位RNA酶抑制剂，pH＝7.9)；所得滤纸片迅速用液氮冷冻后，置于冷冻干燥机中于-80℃冻干6hrs；
(4)能量供体蛋白和能量受体蛋白表达载体的构建：所述能量供体蛋白和能量受体蛋白的基因编码序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；上述基因编码序列通过全基因合成技术制备获得，经内切酶NdeI和SalI酶切3hrs后，分别与经过相同酶处理的pET-26b(+)载体按照摩尔比5:1混合，通过T4DNA连接酶于22℃连接4hrs；所得克隆载体经测序正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中用于后续实验；
(5)能量供体蛋白和能量受体蛋白的表达与纯化：挑取含有克隆载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌落至100mL LB培养基(10mg/mL蛋白胨，5mg/mL酵母提取物，10mg/mLNaCl，30μg/mL卡那霉素)中，于30℃震荡培养4hrs，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续震荡培养8hrs，离心收集大肠杆菌细胞(12,000g，10min)，用10mL细菌裂解缓冲液(10mM Tris-Cl，500mMNaCl，pH＝7.0)重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪裂解上述菌体，超声条件为：80W，超声3s，停2s，共计重复40次，裂解液上清液中所含目的蛋白通过镍亲和层析试剂盒(康为世纪公司)进行纯化，具体操作步骤按照说明书进行，图2为所得供体蛋白和受体蛋白的电泳结果示意图，其中M泳道：蛋白质marker；1号泳道：能量供体蛋白；2号泳道：能量受体蛋白；
(6)生物发光共振能量转移传感滤纸片的制备：向经过封闭的滤纸片上滴加12.5μL生物发光共振能量转移检测溶液(20mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50nM供体蛋白，250nM受体蛋白，0.1mg/mL BSA，1mM TCEP，0.2μM单链DNA片段，2％(w/v)甘露醇，pH＝7.4)；所得滤纸片置于37℃干燥过夜；
(7)纸基检测系统的保存：将干燥后的滚环扩增滤纸片和生物发光共振能量转移传感滤纸片分别置于白色和透明96孔板(或其它具有相同作用的细胞培养板)中，用一层白色纸巾包裹装有纸片的96孔板；将上述96孔板置于密闭容器中，并在容器中添加500g变色硅胶或其它具有相同作用的干燥剂，于室温下避光保存。
实施例2：纸基检测系统在let-7a定量分析中的应用，方法如下：
(1)纸基滚环扩增：向白色96孔板中的滚环扩增滤纸片上滴加20μL不同浓度的待测let-7a样本，于30℃孵育2hrs；
(2)纸基生物发光共振能量转移传感：用尖头镊子向步骤(1)制备的反应体系中加入一张生物发光共振能量转移传感滤纸片，在室温下孵育30min；
(3)基于智能手机的信号读取：向第(2)步反应体系中加入萤光素酶底物，将96孔板放入暗盒，利用智能手机等设备终端对检测结果进行拍摄；通过Image J软件或其它具有相同功能的图像处理软件，分析照片中各样品的生物发光共振能量转移信号，具体方法为：File>Open>选取照片中待分析位置>Plugins>Analyze>RGB measure>计算绿色发光强度与蓝色发光强度的比值；结果可显示生物发光共振能量转移信号对不同浓度let-7a的线性响应关系，结果如图3所示，let-7a的最低检测限可达1.7fM；所述智能手机型号为Oppo K1。
实施例3：纸基检测系统的稳定性测试，方法如下：
使用经过3个月室温保存的纸基检测系统进行let-7a的定量分析，检测方法与实施例2相同，检测结果可显示生物发光共振能量转移信号对不同浓度let-7a的线性响应关系，结果如图4所示，let-7a的最低检测限可达2.6fM。
由此可见本发明所述纸基检测系统经室温条件下保存3个月后，分析性能不会产生明显衰减，因此无需低温保存，显著降低了储存和运输的难度和成本；所述检测过程仅通过向滤纸片上滴加microRNA样品就可完成，无需繁琐的溶液配制和苛刻的实验条件控制，所得结果可通过智能手机读取，因此具有便携化程度高、易于操作、不受人员和实验仪器限制的优势。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一种用于microRNA定量分析的纸基检测系统及其制备方法和检测方法
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