阅读说明：本技术 吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用 (Application of the vomifoliol as effective component in immunosuppressor ) 是由 徐静 李钢 岑举人 邓勤 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用,本发明通过从角果木中筛选出了具有显著的钙调蛋白磷酸酶(CN)抑制活性的吐叶醇,其免疫抑制作用与临床广泛使用的免疫抑制剂环孢菌素A相当,作用机制研究显示吐叶醇为靶向CN/NFAT信号通路发挥免疫抑制活性,且对脾细胞毒性很弱,是一种高效、低毒的免疫抑制剂。(Application the invention discloses vomifoliol as effective component in immunosuppressor, the present invention from ceriops tagal by having filtered out the vomifoliol with significant Calcineurin (CN) inhibitory activity, its immunosuppressive action is suitable with clinical widely used immunosuppressor cyclosporin A, study on mechanism shows that vomifoliol is that targeting CN/NFAT signal path plays immunosuppressive activity, and it is very weak to splenocyte toxicity, it is a kind of immunosuppressor efficiently, less toxic.)

吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及吐叶醇的用途，特别涉及吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用。

背景技术

钙调蛋白磷酸酶(calcineurin，CN)是一种依赖Ca²⁺和钙调蛋白的丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶，这种酶是从酵母发酵液中提取出来的，由于其在神经组织中含量高，所以又常被人们称为钙调蛋白磷酸酶(Klee et al.,1979)。当生物化学家和神经生物学家研究这种新蛋白时，无意间新发现了的免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)，它是通过与细胞内的亲环蛋白(cytosolic protein)相结合成复合物，进而具有显著的免疫抑制效果，被广泛的应用于器官移植手术中(Borel et al.,1976；Handschumacher et al.,1984)。

蛋白质的磷酸化和脱磷酸化作用是生命活动中一种极其重要的调节机制，该调节机制几乎渗透到每一种生命活动过程中，此过程是蛋白激酶(protein kinase，PKase)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PPase)动态作用共同调节的结果。较之蛋白激酶而言，蛋白磷酸酶目前已知种类较少，而且在细胞生命活动中的调节机制的研究也知之不多。钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin，CN)作为蛋白磷酸酶家族的一员，其活性直接受细胞内第二信使Ca²⁺/CaM(calmodulin)的调节，在免疫调节、学习记忆和细胞信号转导等方面起着极其重要的作用，由于其性质、结构和功能的特殊性，引起了广大科研工作者的浓厚兴趣和高度重视，在其底物的发现、生理功能的研究和酶活力抑制剂的研究等方面进行了较为广泛的研究，其中最具突破性进展的研究成果是1990年将钙调蛋白磷酸酶确定为免疫抑制药物环孢菌素A(cyclosporin A，CsA)、FK506的专一性靶酶。但现有的钙调蛋白磷酸酶抑制剂如环孢素A和他克莫司是目前临床上常用的免疫抑制剂，但具有肾毒性、高血糖、对细胞的非特异性等多种不良反应。

本发明是以钙调蛋白磷酸酶为靶酶，通过角果木中筛选出具有体外抑制钙调蛋白磷酸酶(CN)活性的化合物，并深入的研究其机制机理，对于研究和揭示钙调蛋白磷酸酶在生命活动中的功能和作用机制具有极其重要的意义，为开发新的高效低毒免疫抑制剂提供新途径。

发明内容

鉴于此，本发明提出吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用，所述抑制剂为免疫抑制药物。

本发明通过免疫钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶，以pNPP为底物的免疫抑制活性初筛，对角果木中分离出来的单体化合物进行免疫抑制活性筛选，发现在初筛过程中吐叶醇呈现出较好的免疫抑制活性。继续对吐叶醇进行进一步研究，建立PMA/Io诱导Jurkat细胞激活模型，检测Jurkat细胞内CN活力变化、IL-2含量的变化和NFAT蛋白的表达情况，阐释了吐叶醇的作用机制。

吐叶醇在1～40μm浓度范围内对Jurkat细胞无细胞毒活性、无促进细胞增殖或抑制细胞增长的作用。

本发明在吐叶醇的对Jurkat细胞的毒性评价中，将不同浓度的吐叶醇处理Jurkat细胞48h，发现在不同的处理时间条件下，所采用的浓度范围内(1～40μM)，Jurkat细胞的存活率不存在显著性差异，且细胞存活率都在90％以上。随着该化合物浓度的继续上升，高剂量组(75、100μM)的吐叶醇对Jurkat细胞呈现出轻微的抑制作用，细胞的存活率降低到90％以下。说明吐叶醇在1～40μM浓度范围内对Jurkat细胞没有细胞毒活性且没有促进细胞增殖或者抑制细胞增长的作用。

吐叶醇用于抑制PMA/Io刺激增殖分化的Jurkat细胞的活力。

本发明运用了钙调蛋白磷酸酶活性检测方法，以pNPP为底物，对角果木内活性成分进行活性筛选，发现吐叶醇对CN具有强烈的抑制作用。并进一步通过Jurkat细胞对其作用机制进行进一步分析。由PMA/Io刺激Jurkat细胞增殖分化，模拟了T细胞接受外界抗原刺激后的的生理环境。Jurkat细胞先经PMA/Io刺激增殖分化，再经不同浓度的吐叶醇共培养。结果显示，吐叶醇对PMA/Io刺激增殖分化的Jurkat细胞具有一定的抑制作用。说明吐叶醇能在一定程度上，抑制细胞的免疫活性。

吐叶醇用于抑制对钙调蛋白磷酸酶的活力。

吐叶醇作为抑制细胞内磷酸化的NFAT蛋白去磷酸化的免疫抑制剂。

吐叶醇用于抑制Jurkat细胞的细胞白介素-2(IL-2)的产生。

钙调蛋白磷酸酶(CN)是一种和NFAT活化息息相关的酶，一般正常情况下，细胞内NFAT蛋白仅存在于细胞质中，当细胞受外界刺激激活时，细胞内CN会结合NFAT蛋白，使其去磷酸化，从而进入细胞核，结合下游的转录因子产生相应的免疫分子(如细胞白介素-2)。本发明不仅仅从细胞外的钙调蛋白磷酸酶(CN)抑制实验对化合物进行筛选，初步确认了吐叶醇的免疫抑制活性，还建立了PMA/Io诱导Jurakat细胞增殖分化模型，对经活化的细胞经吐叶醇处理，分别检测了其细胞内钙调蛋白磷酸酶(CN)活性、细胞内IL-2含量并对通过western blot实验对细胞通路水平进行了研究。结果发现，未经吐叶醇处理的细胞，明显活化，细胞内白介素-2(IL-2)含量增多，细胞内钙调蛋白磷酸酶(CN)活力上升。由WB结果可知，经吐叶醇处理过的Jurkat细胞中NFAT程度明显降低。说明吐叶醇通过抑制了细胞内钙调蛋白磷酸酶(CN)的活性，从而降低了NFAT的去磷酸化程度，减少了NFAT进入细胞核中结合下游蛋白，进而IL-2水平降低。因此，本发明成功揭示了吐叶醇的作用机制，为吐叶醇开发成为新型的高效低毒的免疫抑制剂提供了理论依据。

吐叶醇是由角果木中分离提纯所得的化合物。

所述吐叶醇的分子式为C₁₃H₂₀O₃：结构式为：

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过从角果木中筛选出了具有显著的钙调蛋白磷酸酶(CN)抑制活性的吐叶醇，并深入的研究其机制机理，其免疫抑制作用与临床广泛使用的免疫抑制剂环孢菌素A相当，作用机制研究显示吐叶醇为靶向CN/NFAT信号通路发挥免疫抑制活性，且对脾细胞毒性很弱，将吐叶醇作为有效成分在免疫抑制剂中的应用，为开发新型的高效、低毒的免疫抑制剂提供新途径。

附图说明

图1为本发明的钙调蛋白磷酸酶(CN)活性初筛原理图；

图2为本发明的实施例酶活力测试管的示意图

图3为本发明的实施例吐叶醇对Jurkat细胞的毒性的柱状分析图；

图4为本发明的实施例吐叶醇抑制PMA/Io刺激Jurkat细胞增殖作用的柱状分析图；

图5为本发明的实施例吐叶醇对钙调蛋白磷酸酶(CN)活力的抑制作用的柱状分析图；

图6为本发明的实施例吐叶醇对Jurkat细胞内IL-2的抑制作用的柱状分析图；

图7为本发明的实施例吐叶醇对NFAT的影响的电泳条带图；

图8为本发明的实施例吐叶醇对NFAT的影响的柱状分析图；

图9为本发明的实施例由角果木中分离提纯所得化合物HZ-2的氢谱图；

图10为本发明的实施例由角果木中分离提纯所得化合物HZ-2的碳谱图；

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、实验材料与仪器

1.细胞来源

本实验所用Jurkat细胞株，购于中国科学院干细胞库，经传代、冻存于本实验室液氮罐中。

2.材料与试剂吐叶醇(vomifoliol，简称Vom)，纯度≥90％。

表1主要试剂

Table1 Main reagents

3.主要仪器设备

表2主要实验仪器

Table 2Main experimental instruments

二、实验方法及结果分析

实施例1-以pNPP为底物的钙调蛋白磷酸酶靶酶活性初筛

本实验中CN的表达、提取纯化是由北京师范大学魏群教授课题组完成。并参考其酶活力测定的方法，利用现代分子生物学技术建立以CN为靶酶的药物筛选分子反应模型。为了降低药物筛选的劳动强度，提高药物筛选的安全性和可靠性，结合CN学特点及药物与靶酶结合的相关性质，通过对比多次的p-NPP和RII的测活结果，发现直接作用于CN的小分子物质，以p-NPP为底物测得的结果和以RII为底物测得的结果在作用趋势上是相符合的，确定以p-NPP为底物，进行药物筛选，其设计思路见图1所示。

从图1中我们可以知道，该分子模型主要是通过测定CN对底物水解的产物的量以达到考察CN活力的变化而评价药物对靶酶的作用效果的，因此酶活力的测定的准确程度成为该分子模型的关键，尽管已有实验显示直接作用于CN的小分子物质，以p-NPP为底物测得的结果和以RII为底物测得的结果在作用趋势上是相符合的。所以本实验选用钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶p-NPP为底物的初筛。

(1)用DDMSO将单体化合物配成20mg/mL的母液备用。

(2)配制测活所需溶液

终止液：0.5M Na₂CO₃

20mL EDTA

(3)测试方法

将CNA稀释成合适的酶溶液备用，取5ml试管若干置于冰上，如图2所示，分别依次加入10μL药和10μL酶液于冰上孵育5min，加180μL测活液于30℃水浴反应20min，加入1800μL终止液终止反应，720型分光光度计上测定OD410值。

空白对照：10μL酶稀释液+10μL Buffer

酶：10μL酶+10μL Buffer

对照组：10μL酶稀释液+10μL药

酶+药：10μL酶+10μL药

注：Buffer为溶解药所用的溶液

按以下公式计算药物对CNA的相对抑制率：

相对抑制率(％)＝[1-(OD药+酶-OD药对照)/OD酶]×100％

(OD药+酶表示酶和药作用后所得溶液在410nm处扽的吸光值；OD药表示药物对照在410nm处的吸光值；)

(4)钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶的免疫抑制活性单体筛选

对本实验将角果木中分离提纯所得化合物样品进行钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶的免疫抑制活性初筛，以实验室编号命名化合物，得到以下结果，见下表。

表3角果木中化合物初筛结果

Table3 PreliminaryscreeningresultsofcompoundisolatedfromC.tagal

由上表3可知：在角果木中分离得到的15个中，对钙调蛋白磷酸酶(CN)抑制率超过50％的由两个化合物，分别为HZ-2和J9-a15-3，它们的抑制率分别为87.30％和65.23％。选取初筛活性最好的化合物既HZ-2进行后续的研究。对比HZ-2的结构可知为吐叶醇(vomifoliol)。

化合物HZ-2的结构式为：

白色针状晶体(氯仿)，熔点108-110℃，阳离子ESI-MS m/z 224.1[M+H]⁺(calcdfor C₂₁H₃₃O₃,225.1412)。因此该化合物分子式为C₁₃H₂₀O₃，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 5.90(1H,s,H-4),5.84(1H,dd,J＝15.60,5.27Hz,H-8),5.78(1H,d,J＝15.73Hz,H-7),4.40(1H,m,H-9),2.44(2H,d,J＝17.06Hz,H-2),2.25,2.21(each 1H,brs,OH),1.89(3H,d,J＝0.83Hz,H-13),1.29(3H,d,J＝6.41Hz,H-10),1.24(3H,s,H-13),1.07,1.00(each 3H,s,H-12,11or H-11,12)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 198.9(C-3),163.9(C-5),136.4(C-8),129.6(C-4),127.5(C-7),79.7(C-6),68.7(C-9),50.3(C-2),41.8(C-1),24.7(C-10),24.4,23.6(C-11,12or C-12,11),19.7(C-13)。经波谱数据分析与文献报道的数据比较(zhang et al.,2000)，鉴定化合物为vomifoliol。如图9和10所示化合物的氢谱和碳谱图。

实施例2-人白血病T淋巴细胞(Jurkat)的培养

Jurkat细胞和HepG2细胞最大的区别在于Jurkat细胞是悬浮细胞而HepG2细胞是贴壁细胞，故其所用培养基和培养方式略有不同，具体如下：

(1)Jurkat细胞的复苏

细胞复苏方法：用镊子从液氮罐中将盛有细胞的的冻存管小心取出，放入37℃恒温水浴锅中，用镊子夹住冻存管盖子部分在水中轻轻摇动，待冻存管内的的固体尽快恰好融化完全，遵循“慢冻速溶”原则，防止细胞内水结晶，对细胞造成损伤。向冻存管喷洒75％乙醇进行消毒后放入超净工作台中，用移液枪将细胞悬浮液取出，加入到盛有9mL含10％胎牛血清的完全RPMI 1640培养基(预热至37℃)的离心管中，1000rpm离心5min。

(2)Jurkat细胞的传代

采用“半换液法”对Jurkat细胞进行传代处理。将T25培养瓶从细胞培养箱中取出，用移液枪吹打细胞，使细胞分布均匀，用移液枪吸弃2.5mL培养瓶中的旧RPMI1640培养基，然后加入2mL新鲜RPMI1640培养基清和0.5mL的胎牛血清，总体积为5mL用移液枪将细胞吹打成单细胞悬液，随后将细胞培养瓶放入到CO₂培养箱中继续培养。细胞传代时间根据细胞生长情况来判断，当细胞长满培养瓶底部80％的面积时，进行细胞传代。

(3)Jurkat细胞的冻存

此步骤的目的是将富余的Jurkat细胞长期保存起来，便于日后所需使用。选择生长状态良好、且处于生长对数期的细胞进行冻存实验。按上述实验步骤，将细胞制成细胞悬液后，进行细胞计数，将细胞用RPMI1640培养基稀释成5×10⁶个/mL，取0.85mL稀释后的细胞悬液于细胞冻存管中，随后加入0.1mL的胎牛血清以及0.05mL的DMSO溶液。将冻存管上做好标签，记录冻存操作人、冻存时间、冻存细胞种类等信息，随后放入程序降温盒中，将程序降温盒置于-80℃超低温冰箱中24h，然后迅速取出冻存管放入液氮罐中保存。定期向液氮罐中补充液氮，防止因液氮流失造成细胞损伤。

实施例3-吐叶醇(vomifoliol)对Jurkat细胞的毒性作用

(1)取96孔细胞培养板，每孔接种Jurkat细胞悬浮液90μL、浓度为2*10⁶个/mL，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4h。

(2)每孔加入不同浓度的吐叶醇溶液每孔10μL，使得吐叶醇的终浓度分别为1、5、10、15、30、40、50、75、100μM，空白对照加培养基10μL。每组设置3个复孔。(若药物自身有颜色会对吸光度造成影响，则设置背景对照)

(3)将培养板置于培养箱中培育44h。

(4)取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，后置于96孔板离心机中2500rpm离心5min，用移液枪吸弃上清液，每孔加入新鲜培养基100μL，加入MTT工作液20μL，终浓度为0.5g/L。

(5)继续避光孵育4h,2500rpm离心5min,用移液枪小心弃培养基,加入200μLDMSO，避光条件下静止30min，使其充分溶解蓝色甲瓒，用酶标仪于570nm处记录溶液吸光值(OD)。

(6)计算细胞存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图。每组实验重复三次。

细胞存活率＝实验组OD平均值/空白对照组OD平均值*100％

将不同浓度的吐叶醇处理Jurkat细胞48h。由图3可知，在不同的处理时间条件下，该实验所采用的浓度范围内(1～40μM)，Jurkat细胞的存活率不存在显著性差异，且细胞存活率都在90％以上。随着该化合物浓度的继续上升，高剂量组(75、100μM)的吐叶醇对Jurkat细胞呈现出轻微的抑制作用，细胞的存活率降低到90％以下。这说明吐叶醇在1～40μM浓度范围内对Jurkat细胞没有细胞毒活性且没有促进细胞增殖或者抑制细胞增长的作用。此结果可以排除实验中非特异性因素的干扰。

实施例4-吐叶醇(vomifoliol)对Jurkat细胞的抑制作用(PMA/Io诱导增值)

取96孔细胞培养板，每孔接种Jurkat细胞悬液100μL、浓度为2*10⁶个/mL。加入50μLPMA/Io(Phorbol 12-myristate 13-acetate/Ionomycin，佛波酯/钙离子霉素)混合溶液，使得PMA和Io的终浓度分别为25ng/ml和1μg/ml，刺激4h。然后加入不同终浓度的吐叶醇(5、10、15、30、40μM)和环孢菌素A溶液(15μM)，空白对照加入50μL空白培养基。将培养板置于培养箱中培育44h。取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，后置于96孔板离心机中2500rpm离心5min，用移液枪吸弃上清液，每孔加入新鲜培养基100μL，加入MTT工作液20μL，终浓度为0.5g/L。继续避光孵育4h，2500rpm离心5min，用移液枪小心弃培养基，加入200μLDMSO，避光条件下静止30min，使其充分溶解蓝色甲瓒，用酶标仪于570nm处记录溶液吸光值(OD)。计算细胞存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图。每组实验重复三次。

细胞存活率＝实验组OD平均值/空白对照组OD平均值*100％

由图4可知，吐叶醇对PMA/Io共刺激的Jurkat细胞具有一定的抑制作用，浓度越高，细胞存活率越小，呈现浓度依赖性。在浓度同为15μM时吐叶醇与阳性对照环孢菌素A(CsA)对Jurkat细胞的抑制作用程度相当，在一定程度上，可以说明吐叶醇的免疫抑制活性与CsA相当。吐叶醇对PMA/Io共刺激的Jurkat细胞半抑制浓度为IC50＝20.167±0.09μM。

实施例5-Jurkat细胞内钙调蛋白磷酸酶(CN)活性测定

(1)配制所需试剂

a.用于孔雀绿测活得细胞裂解液

b.2×Ca²⁺测活溶液

c.2×EGTA测活溶液

d.细胞实验使用得溶液

e.蛋白酶体测活细胞裂解液

10mMHEPESBuffer：HEPES 2.383g

用5M NaOH调pH至7.6，定容到500mL。

(2)待测细胞的培养

取6孔细胞培养板，每孔接种Jurkat细胞悬液1mL、浓度为2*10⁶个/mL。加入50μLPMA/Io(Phorbol 12-myristate 13-acetate/Ionomycin，佛波酯/钙离子霉素)混合溶液，使得PMA和Io的终浓度分别为25ng/ml和1μg/ml，刺激4h。然后加入不同终浓度的吐叶醇(5、10、15、30、40μM)和环孢菌素A溶液(15μM)，空白对照加入等体积空白培养基。将培养板置于培养箱中培育44h。

将处理后的Jurkat细胞用无菌EP管收集，在1000rpm条件下离心5min。弃去上清，用新鲜的细胞培养基重悬细胞，并计数，用低温离心机在4℃条件下1000rpm离心5min。用TBSbuffer按上述步骤洗涤细胞两遍，然后每1×10⁶个细胞加入100μL提前配制好的细胞裂解液，冰上裂解10min，用低温离心机在4℃条件下12000rpm离心15min，将离心后上清转移至新的无菌EP管中，备用。

(3)P6-DG细胞脱磷柱的预处理

经过上述步骤获得的细胞裂解液中，含有大量的细胞内自身的游离的磷酸根离子，如果不经过脱磷处理，在后续的实验中，细胞自身的磷酸根离子含量会影响检测结果的准确性。因此细胞裂解液经P6-DG细胞脱磷柱预处理后，便可排除细胞自身磷酸根离子的干扰。其具体操作步骤如下：

a.将P6-DG脱磷树脂放入50mL离心管中，加入20mLdd水，涡旋混匀。常温放置4h或者4℃静置过夜。

b.小心除ddH2O，然后按照1：1比例，重新放入新的ddH2O，水化脱磷树脂。

c.将5mL水化后得脱磷树脂放入脱磷柱内，去掉脱磷柱塞子，重力除去介质内的ddH2O。

d.向P6-DG细胞脱磷柱内加入8ml的裂解液(未加入酶抑制剂)，平衡P6-DG细胞脱磷柱。

e.将P6-DG细胞脱磷柱套入到15ml的离心管内，在4℃的低温离心机内800g离心3min，去除介质内的缓冲液。

f.将除盐柱放入一个新的15ml离心管内，将高速离心获得的350μL上清液样本加入到除盐柱内。

g.在4℃的低温离心机内800g离心3min，保存管内离心所得样本。该样本可用于下一步CN的活力测定(如不能立即检测，需将样品置于-70℃超低温冰箱内进行保存)。

注意：P6-DG细胞脱磷树脂可以反复使用。在新的样本使用时，使用4-5倍除磷的ddH2O清洗介质，然后向P6-DG细胞脱磷柱内加入8ml的裂解液进行介质的平衡。向P6-DG细胞脱磷柱可以用于4-5个样本的除盐操作。

(4)经P6-DG细胞脱磷柱脱磷后的细胞提取液中游离磷酸根离子的检测

a.分别取1μLddH2O和1μL过脱磷柱后的细胞裂解液，加入到96孔板中。

b.分别加入100μL孔雀绿试剂。

c.在室温条件下避光反应30min。

d.用酶标仪记录反应后的溶液在630nm处的波长。

(5)磷酸标准曲线测定

将500μL的2×Ca²⁺测活溶液稀释成1×Ca²⁺测活溶液。80μM的磷酸标准物用倍数稀释法进行稀释，制成相应的浓度梯度。对应的40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μM的磷酸标准溶液中对应磷酸根含量为2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031nmol。

A	2nmol PO<sub>4</sub>
		B	1nmol PO<sub>4</sub>
C	0.5nmol PO<sub>4</sub>
		D	0.25nmol PO<sub>4</sub>
E	0.125nmol PO<sub>4</sub>
		F	0.063nmol PO<sub>4</sub>
G	0.031nmol PO<sub>4</sub>
		H	0nmol PO<sub>4</sub>

向A中加入50μl的2×Ca²⁺测活buffer，向B-H中加入50μl的1×Ca²⁺测活buffer。然后向A加入50μl 80μM的磷酸标准物，反复吹打混匀。从A中取50μl混合液加入B中，反复吹打混匀。从B中取50μl混合液加入C中，反复吹打混匀。直到将G中的溶液混合均匀后将G中取出的50μl混合液弃去。H不进行操作。然后向每孔中加入100μl孔雀绿试剂，室温静置30min，测定630nm处的吸光值。以PO₄为横坐标，以OD₆₃₀数值为纵坐标，绘制标准曲线。得到脱磷酸公式。

(6)孔雀绿测定Jurkat细胞内CN的活性

细胞内CN活性的测定采用Ca²⁺-EGTA的方式。在实验中将设定4个实验组，分别为：Ca²⁺、EGTA、Ca²⁺+OA以及EGTA+OA组。另外设定空白对照组用来对仪器校零，实验对照组(background)用于实验分析。各孔加入的试剂及具体操作如下表3：

表4细胞内钙调蛋白磷酸酶(CN)活力测试方法

Table4 ProcedurefortestingintracellularCNenzymeactivity

(7)CN活性计算

在pH＝7.4和37℃条件下，以每毫克酶在一分钟内所催化反应的底物的物质的量(pmol/min/mg)为CN活性

CN相对活力计算公式(OD₆₃₀表示：)

公式一：CN＝Ca²+buffer－EGTAbuffer

公式二：CN＝(Ca²++OA)buffer－(EGTA+OA)buffer

将OD₆₃₀值换算为磷酸释放的物质的量：

Phosphatereleased(nmol)＝(OD₆₃₀－Yint)/Slope

计算CN的比活力：

CN的活力(pmol/min/mg)＝CN释放的磷酸的量/(每孔蛋白含量×酶活反应时间)

(8)吐叶醇对钙调蛋白磷酸酶(CN)的抑制作用

以pNPP为底物，检测单体化合物吐叶醇对CN活力的影响，由图5可知：吐叶醇的浓度越高，对CN的抑制率越高，呈现浓度依赖性，半抑制浓度为IC50＝9.66±0.150μM。

实施例6-Jurkat细胞内细胞白介素-2含量测定

(1)取6孔细胞培养板，每孔接种Jurkat细胞悬液1mL、浓度为2*10⁶个/mL。加入50μLPMA/Io(Phorbol 12-myristate 13-acetate/Ionomycin，佛波酯/钙离子霉素)混合溶液，使得PMA和Io的终浓度分别为25ng/ml和1μg/ml，刺激4h。然后加入不同终浓度的吐叶醇(5、10、15、30、40μM)和环孢菌素A溶液(15μM)，空白对照加入等体积空白培养基。将培养板置于培养箱中培育44h。

将处理后的细胞转移至2mlEP管中，2000rpm离心5min收集细胞，并用PBS溶液清洗一遍。2000rpm离心5min收集细胞，吸弃上清液，加入150-200μL含PMSF的裂解液，然后吹匀，涡旋30s，置于冰上静置15min(每隔5min，涡旋样品30s)。4℃下12000rpm离心5min，小心将细胞裂解后的上清液转到新的1.5mLEP管中，取一定量上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，其余备用。

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡均匀，37℃避光显色15min。每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，450nm波长依序测定各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

(2)吐叶醇对细胞白介素-2(IL-2)的作用

Jurkat细胞经PMA/Io共诱导后，细胞迅速活化，IL-2含量急剧升高，加入不同浓度的吐叶醇和阳性对照(环孢菌素A)处理细胞，结果显示，吐叶醇可以明显降低细胞白介素-2含量，浓度越大，抑制作用越强，呈现出浓度依赖型。当浓度为15μM时，Vom与CsA呈现出相当的抑制活性，当吐叶醇浓度为40μM时，细胞内IL-2含量接近于未刺激时的IL-2浓度。吐叶醇可以抑制Jurkat细胞IL-2的产生，从而具有良好的免疫抑制活性。

实施例7-WB实验检测细胞内NFAT蛋白的表达量

(1)电泳：细胞的给药孵育，收集，裂解方法按前述“细胞白介素-2含量测定”制备，得到细胞总蛋白。细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳。

(2)转膜：在电泳缓冲液中，250mA冰浴转膜1.5h，将蛋白转移到PVDF膜上。

(3)封闭：将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液配制的封闭液封闭液中，室温封闭4h或4℃过夜。

(4)洗涤：用PBS加0.1％Tween-20洗涤3次×10min。

(5)一抗结合：用含5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗(称1.0g脱脂奶粉，加入20mLTBST混匀)，稀释比例为1:1000，即1μL一抗加入到1000μL5％脱脂奶粉中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配制好的一抗转移至封口膜上，注意不要产生气泡，PVDF膜覆盖在稀释的抗体上。

(6)二抗结合：在室温条件下，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；用含5％脱脂奶粉的TBST稀释二抗(1:5000)，即0.1μL二抗加入到1000μL5％脱脂奶粉的TBST中，将封口膜用水固定在桌面上，揭开封口膜，用移液枪将配置好的二抗吸在封口膜中央，不要产生气泡，PVDF膜正面朝下盖在稀释的抗体上，用盒子盖住，并用水封住盆口边缘，室温下孵育1h，之后回收二抗。

(7)显色：在相应大小的塑料盒或培养皿中放入滤膜(沥掉多余的液体)，加入化学发光液于PVDF膜上，轻轻摇动，反应3-5min。用保鲜膜将PVDF膜包裹起来，在滤纸上挤掉多余的发光液。

(8)显影定影：在暗室中将印有蛋白的PVDF膜表面朝向X光片进行曝光。曝光完成后，取出X光片，将曝光好的胶片放入显影液中显影，待胶片出现条带后，转移至定影液中，定影完全后，取出胶片，用自来水冲洗并晾干，拍照留存(扫描)，用ImageJ对结果进行定量分析。

(9)吐叶醇对细胞NFAT蛋白去磷酸化的抑制作用

NFAT是一类在T细胞活化过程中调控IL-2以及其它T细胞早期分化的细胞因子基因表达的核转录蛋白，活化的CN可以使NFAT脱磷酸化，从而使这些NFAT活化，入核后与其它转录因子共同作用，结合到免疫因子基因的启动子DNA上，起始转录这些基因。由条带图6可以看出，Jurkat细胞经PMA/Io诱导后，脱磷酸化程度明显上升。加入不同浓度的吐叶醇和阳性对照(环孢菌素A)处理后，脱磷酸化程度降低，且随着药物浓度增大，Jurkat细胞脱磷酸化程度越低。由图7可知，NFAT活化的过程可以被Vom所抑制。因此，Vom是一种潜在的能抑制细胞内磷酸化的NFAT蛋白去磷酸化的免疫抑制剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。