具体实施方式

本发明提供了对苯醌和/或对苯醌衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。

本发明还提供了对苯醌和/或对苯醌衍生物在制备抑制新型冠状病毒增殖药物中的应用。

本发明还提供了对苯醌和/或对苯醌衍生物在制备新型冠状病毒酶抑制剂中的应用。

本发明还提供了对苯醌和/或对苯醌衍生物在制备新型冠状病毒的3C样蛋白酶和/或木瓜样半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

在本发明中，所述对苯醌的衍生物的化学结构式优选的如式I所示：

其中，所述R₁地选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-12烷基、C1-12烷氧基、苯基、卤代C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、C3-6环烷基、单取代苯基或多取代苯基；所述R₂选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-12烷基、C1-12烷氧基、苯基、卤代C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、C3-6环烷基、单取代苯基或多取代苯基；所述R₃选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-12烷基、C1-12烷氧基、苯基、卤代C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、C3-6环烷基、单取代苯基或多取代苯基；所述R₄选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、C1-12烷基、C1-12烷氧基、苯基、卤代C1-6烷基、卤代C1-6烷氧基、C3-6环烷基、单取代苯基或多取代苯基。

在本发明中，所述对苯醌衍生物优选的包括2-甲基-1,4-对苯醌、2-叔丁基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2,5-二苯基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)中的一种或几种；更优选的，所述对苯醌衍生物包括2-甲基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌中的一种或几种；最优选的，所述对苯醌衍生物包括2-甲基-1,4-对苯醌和/或2-苯基-1,4-对苯醌。

本发明对所述对苯醌(1,4-对苯醌)、2-甲基-1,4-对苯醌、2-叔丁基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2,5-二苯基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的来源没有特殊限制，来源于常规市售。

多聚蛋白(polyproteins，PP)pp1a和pp1b对于维持冠状病毒RNA的合成至关重要，而多聚蛋白的成熟需要经历一系列裂解过程，才能生成多亚基蛋白质复合物(被称为“病毒复制转录酶”)。多亚基蛋白质复合物的主要蛋白酶(mainprotease，Mpro)为3C样蛋白酶(3C-like protease，3CLP)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteine protease，PLP)，3CLP和PLP高度协调催化多聚蛋白的裂解，3CLP和PLP活性缺失会导致冠状病毒生命周期停止。

在本发明中，所述对苯醌和/或对苯醌衍生物能够抑制新型冠状病毒的3CLP和PLP的活性，从而抑制新型冠状病毒的活性和增殖，缓解感染的宿主细胞内免疫失衡。在本发明中，对3CLP和PLP发挥抑制的活性的苯醌衍生物依赖于其1,4-对苯醌母核。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、新型冠状病毒3CLPro蛋白的表达与纯化

1.1引物设计

根据新型冠状病毒3CLPro的基因(ORF1ab的蛋白残基3264-3569，GenBank检索号：MN908947.3)为模板设计基因特异性引物(3CL-F：gtgccgcgcggcagccatatgtcggcagtgctgcaaagcggtttccgtaagatg，SEQ ID NO：1；3CL-R：gtggtggtggtggtgctcgaggggcccttgaaaggtcacaccgctgc，SEQ ID NO：2)，其中3CLPro-F引物序列带有NdeI酶切位点，3CLPro-R引物序列带有XhoI酶切位点。在蛋白N端加入SAVLQ 5个氨基酸，构建3CLPro自身酶切位点；在蛋白C端的VTFQ氨基酸后加入GP两个氨基酸，构建Precission蛋白酶酶切位点，促进目的基因与His标签融合表达。

1.2新型冠状病毒3CLPro基因扩增

首先由通用生物合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的新型冠状病毒3CLPro基因。以合成的新型冠状病毒3CLPro的基因作为模板，扩增总体系为100μL。PCR反应体系包括：cDNA模板1μL、3CL-R 4μL、3CL-F 4μL、2×Phanta MasterMix 50μL和ddH₂O 41μL。反应程序具体为：94℃3min的预变性，30次扩增反应(94℃15s，65℃30s，72℃30s)及72℃充分延伸5min。PCR产物取9μL，加入1μL 6×Gel Loading Dye Purple混合均匀后上样，其中第一个胶孔中加入2μL DNAMarker，以供样品分离出的条带进行对照(电压150V，40min)。在紫外灯下观察PCR结果，并用切胶刀从凝胶上切下PCR正确片段的条带，放入1.5mL EP管中，称重并记录。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，使用Nano Drop测定回收的目的基因浓度与纯度。

1.3新型冠状病毒3CLPro表达载体的构建

使用NdeI和XhoI限制性内切酶对pET28a(+)进行酶切，然后胶回收目的质粒片段用于重组连接。具体连接体系包括：pET28a(+)质粒片段20μg、3CLPro目的基因40μg、5×CEⅡBuffer 5μL、ExnaseⅡ2μL，并用水补足50μL。

1.4新型冠状病毒3CLPro的诱导表达

将转化成功的大肠杆菌菌种在37℃下按1％(v/v)接种量接种于25mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中预培养过夜，然后将培养物按1％(v/v)接种量接种于1L含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养。当OD600达到0.8时，添加0.5mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃下诱导12h，使3CLPro蛋白表达。

1.5新型冠状病毒3CLPro的纯化

1)取1L菌液在5000×g条件下离心10min，弃去上清液。

2)将沉淀重悬于40mL Lysis Buffer中(所有缓冲液的pH在4℃下调节)，然后通过高压均质仪裂解3～5min。

3)使用冷冻低温离心机将裂解液在4℃下超速离心(15000×g)30min，取上清再次超速离心(15000×g)30min。

4)使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化前，先用Lysis Buffer平衡Ni-NTA柱。

5)将已离心2～3次的裂解液上清分批次加入至Ni-NTA柱流穿，流穿结束后，为除去非特异性结合蛋白，加入100mL左右的Lysis Buffer洗涤Ni-NTA柱，洗涤结束后使用25mLWash Buffer及35mL Elution Buffer洗脱收集3CLPro。

6)将裂解液、流穿液、洗涤液、WashBuffer及Elution Buffer各收集20μL。

7)每个样品加入5μL 5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer吹打混匀，在95℃条件下加热10min使蛋白样品变性，每管样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，其中第一个胶孔中加入2μLPrestained Protein Ladder，以供样品分离出的条带进行对照(电压220V，45min)。

8)根据SDS-PAGE电泳结果浓缩洗脱液至2mL，使用替换液A(20mM HEPES，400mMNaCl，pH 7.5)替换洗脱液3次，最终得到4mL 3CLPro浓缩液，使用Nano Drop测定蛋白浓度。在浓缩液中加入13mg/mL Precission蛋白酶(PPE)100μL酶切过夜。

9)使用GFC Buffer(100mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.5)平衡凝胶过滤分子筛层析柱(HiLoad 16/600Superdex 200pg)。

10)将4mL酶切处理后的3CLPro浓缩液均分至3个1.5mL EP管中，4℃下超速离心12000×g，10min。

11)去除沉淀后，使用螺旋注射器将蛋白样品推入5mL上样环中，通过AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。

12)浓缩从凝胶过滤分子筛层析柱洗脱下来的含有高纯度3CLPro部分，浓缩液依次使用替换液B(20mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.5)和替换液C(20mM HEPES，100mM NaCl，pH7.5)替换3次，使用Nano Drop测定蛋白浓度。将3CLPro蛋白按50μL/管进行分装，液氮速冻后放入-80℃保存。

2、新型冠状病毒PLpro的表达纯化

2.1引物设计

根据新型冠状病毒PLPro的基因序列为模板设计基因特异性引物(PLP-F：GTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCGGCAGTGCTGCAA，SEQ ID NO：3；PLP-R：GTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCGGCAGTGCTGCAAGCGGTTCGTACCATCAAG，SEQ ID NO：4)，其中PLP-F引物序列带有NdeI酶切位点，PLP-R引物序列带有EcoR I酶切位点。同样，在蛋白N端加入SAVLQ 5个氨基酸，构建3CLPro自身酶切位点；在蛋白C端的加入终止密码子以备后期终止翻译。

2.2新型冠状病毒PLPro基因扩增

首先由通用生物合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的新型冠状病毒PLPro基因。以合成的新型冠状病毒PLPro的基因作为模板，扩增总体系为100μL。PCR反应体系包括：cDNA模板1μL、3CL-R 4μL、3CL-F 4μL、2×Phanta Master Mix 50μL和ddH₂O 41μL。反应程序具体为：94℃3min的预变性，30次扩增反应(94℃15s，65℃30s，72℃30s)及72℃充分延伸5min。PCR产物取9μL，加入1μL 6×Gel Loading Dye Purple混合均匀后上样，其中第一个胶孔中加入2μL DNA Marker，以供样品分离出的条带进行对照(电压150V，40min)。在紫外灯下观察PCR结果，并用切胶刀从凝胶上切下PCR正确片段的条带，放入1.5mL EP管中，称重并记录。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，使用Nano Drop测定回收的目的基因浓度与纯度。

2.3新型冠状病毒PLPro表达载体的构建

使用NdeI和EcoR I限制性内切酶对pET28a(+)进行酶切，然后胶回收目的质粒片段用于重组连接。具体连接体系包括：pET28a(+)质粒片段20μg、PLPro目的基因40μg、5×CEⅡBuffer 5μL、ExnaseⅡ2μL，并用水补足50μL。

2.4新型冠状病毒PLPro的诱导表达

将构建成功的大肠杆菌转接到装有100mL LB液体培养基锥形瓶中，按照0.1％培养基体积加入菌体对应的50mg/mL氨苄青霉素抗生素，放入37℃摇床中恒温培养，2～3h左右，待菌液OD600值达到0.8时，添加1μM ZnCl2，按0.5mM终浓度加入诱导剂IPTG，25℃过夜诱导，使蛋白表达。

2.5新型冠状病毒PLPro的纯化

(1)取菌液于4000×g条件下离心15min，弃去上清液。将沉淀以1L菌20mL LysisBuffer的比例进行重悬(Lysis Buffer中含终浓度为5mMβ-巯基乙醇)。然后通过高压均质仪在70～80MPa条件下裂解10min。使用冷冻低温离心机将裂解液在4℃下超速离心(18000×g)30min，重复该操作。

(2)使用Lysis Buffer平衡Ni-NTA柱后，将两次离心的裂解液上清经膜过滤后，加入至Ni-NTA柱流穿，后加入Lysis Buffer洗涤Ni-NTA柱以除去非特异性结合的蛋白，洗涤结束后使用Elution Buffer洗脱收集PLpro。收集上述实验中的裂解液、流穿液、高盐洗脱液、洗涤液及Elution Buffer 20μL，并各自加入5μL 5×SDS-PAGE ProteinLoadingBuffer。取10μL样品进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为220V，45min，电泳结束后对蛋白胶进行染色、脱色，检测蛋白是否表达。

(3)根据从镍柱洗脱的蛋白浓度，对蛋白进行浓缩。使用GFC Buffer(20mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.5)替换洗脱液3次，最终获得PLpro浓缩液，使用Nano Drop测定蛋白浓度。在浓缩液中加入1M的TCEP 5μL和51mg/mL 3CLpro蛋白酶3μL酶切过夜。

(4)使用GFC Buffer平衡凝胶过滤分子筛层析柱(HiLoad 16/600Superdex200pg)。将经酶切处理后的PLpro浓缩液超速离心(12000×g)10min。使用螺旋注射器将蛋白样品加入上样环中，注意不要吸入沉淀。使用AKTA对蛋白进行二次纯化。浓缩从凝胶过滤分子筛层析柱洗脱下来的含有高纯度PLpro的部分。使用Nano Drop测定蛋白浓度。将PLpro按后续实验需求进行分装，分装后使用液氮速冻，放入-80℃保存。

3、活性测试

化合物：1,4-对苯醌、2-甲基-1,4-对苯醌、2-叔丁基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2,6-二叔丁基-1,4-对苯醌、2,5-二苯基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、艾地苯醌和四甲基-1,4-对苯醌；上述所述化合物购自于成都吉安特医药科技有限公司。

在本发明中，所述对苯醌(1,4-对苯醌)、2-甲基-1,4-对苯醌、2-叔丁基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2,6-二叔丁基-1,4-对苯醌、2,5-二苯基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌、艾地苯醌和四甲基-1,4-对苯醌的化学结构式如表1所示。

表1对苯醌和对苯醌的衍生物的结构式

1)化合物对新型冠状病毒3CLPro的抑制活性测试

(1)通过荧光共振能量转移技术(FRET)测定新型冠状病毒3CLPro活性及化合物对新型冠状病毒3CLPro的抑制活性。测定试验中使用带有新型冠状病毒3CLPro切割位点(箭头所示)的荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH₂)和Tris-HCl缓冲液(50mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 7.3)。

(2)化合物由100％DMSO溶解。取上述10μL化合物分别与40μL新型冠状病毒3CLPro(终浓度0.1μM)在Tris-HCl缓冲液中孵育1h，通过添加50μL荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH₂、终浓度为20μM)引发反应。使用放射共振能量转移荧光分光光度计检测由于3CLPro催化的底物裂解而产生的Dabcyl荧光信号(340nm(激发)/490nm(发射))，通过3min内荧光信号的变化，从而判定化合物是否具有抑制活性。

(3)新型冠状病毒3CLPro动力学常数通过将数据拟合到MichaelisMenten方程中得出。通过初筛筛选出高抑制活性化合物(选择终浓度为50μM时抑制率大于0.9的化合物)，加入紫草素(已知高活性抑制剂)作为阳性对照，对比抑制率。筛选结果参见表2。由表2可以看出化合物：1,4-对苯醌、2-甲基-1,4-对苯醌、2-叔丁基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌以及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌对新型冠状病毒3CLPro的酶抑制活性优于阳性对照药紫草素。

(4)对通过初筛筛选出的高抑制活性化合物进行IC50的测定。使用Tris-HCl缓冲液将化合物稀释至梯度浓度(1.5625-100μM和0.15625-10μM)，并使用上述相同终浓度的新型冠状病毒3CLPro和荧光底物体系进行测定。化合物的IC50值由GraphPad Prism 8.0软件计算。每次实验三个平行，最终结果用平均值±标准差(SD)表示。测定结果参见表3。由表3可以看出，化合物：1,4-对苯醌、2-甲基-1,4-对苯醌、2-苯基-1,4-对苯醌、2-氯-1,4-对苯醌、2-溴-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2-氯-5-甲基-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四溴-1,4-对苯醌以及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌对新型冠状病毒3CLPro的IC50值低于1.0μM，显示出对新型冠状病毒3CLPro的优异抑制活性。

2)化合物对新型冠状病毒PLpro的抑制活性测试

(1)使用荧光共振能量转移技术(FRET)测定新型冠状病毒PLpro活性及化合物对新型冠状病毒PLpro的抑制活性。测定试验使用带有蛋白特异性切割位点(箭头所示)的荧光底物(CBE-RLRGG↓AMC)以启动反应。蛋白及荧光底物由PLpro缓冲液(150mM NaCl、40mMTris-HCl、5mM DTT，pH 8.0)进行稀释。

(2)化合物由100％DMSO溶解。取上述10μL化合物分别与40μL新型冠状病毒PLpro(终浓度0.3μM)在PLpro缓冲液中孵育10min，通过添加50μL荧光底物(终浓度为20μM)引发反应。PLpro将底物裂解产生AMC荧光信号(340nm(激发)/490nm(发射))，通过3min内荧光信号的变化，从而判定化合物是否具有抑制活性。

(3)新型冠状病毒PLpro动力学常数通过将数据拟合到MichaelisMenten方程中得出。通过初筛筛选出高抑制活性化合物(选择终浓度为50μM时抑制率大于0.9的化合物)，加入紫草素(已知高活性抑制剂)作为阳性对照，对比抑制率。筛选结果参见表2。由表2可以看出化合物：2-甲基-1,4-对苯醌、百里醌、2,5-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲基-1,4-对苯醌、2,6-二甲氧基-1,4-对苯醌、2,5-二苯基-1,4-对苯醌、2,5-二氯-1,4-对苯醌、2,6-二氯-1,4-对苯醌、四氟-1,4-对苯醌、四氯-1,4-对苯醌以及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌对新型冠状病毒PLPro的酶抑制活性优于阳性对照药紫草素。但是2,6-二叔丁基-1,4-对苯醌、艾地苯醌和四甲基-1,4-对苯醌对新型冠状病毒PLPro的酶活性为促进作用。

(4)对通过初筛筛选出的高抑制活性化合物进行IC50的测定。使用PLpro缓冲液将化合物稀释至梯度浓度，并使用上述相同终浓度的SARS-CoV-2 PLpro和荧光底物体系进行测定。

化合物的IC50值由GraphPad Prism 8.0软件计算。每次实验三个平行，最终结果用平均值±标准差(SD)表示。测定结果参见表3。由表3可以看出，化合物2-甲基-1,4-对苯醌以及2-苯基-1,4-对苯醌对新型冠状病毒PLPro的IC50值低于1.0μM，显示出对新型冠状病毒PLPro的优异抑制活性。

表2对苯醌或对苯醌的衍生物抗新冠活性50μm初筛抑制率

表3对苯醌或对苯醌的衍生物抗新冠活性IC50测定结果

注：“—”表示表2中初筛活性相对较低的化合物，没有进行IC50测定；“*”表示差异大，不可求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东达因海洋生物制药股份有限公司

北京达因高科儿童药物研究院有限公司

<120> 对苯醌和/或对苯醌衍生物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgccgcgcg gcagccatat gtcggcagtg ctgcaaagcg gtttccgtaa gatg 54

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggtggtgg tggtgctcga ggggcccttg aaaggtcaca ccgctgc 47

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgccgcgcg gcagccatat gtcggcagtg ctgcaa 36

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgccgcgcg gcagccatat gtcggcagtg ctgcaagcgg ttcgtaccat caag 54