具体实施方式

维生素K及衍生物是指一种或多种式1的化合物及其药学上或营养学上可接受的盐：

其中R可以是任何共价连接的有机基团，包括聚类异戊二烯残基、酯、醚和硫醇加合物，优选地，R是式2的化合物，

其中，n是1至12的整数，并且虚线表示双键的任选的存在。

如本文所用，维生素K及其衍生物特别是指叶绿醌(维生素K1)、二氢叶绿醌、包括短链甲基萘醌(特别是MK-4)和长链甲基萘醌(特别是MK-7)的甲基萘醌(维生素K2)。根据本发明可以使用的维生素K的来源包括以下：来自天然来源(诸如植物提取物、脂肪和油)的叶绿醌，合成叶绿醌，合成维生素K3(甲萘醌)，和不同形式的维生素K2：合成MK-4、MK-5、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9、MK-10、MK-11、MK12和MK-13，纳豆(由发酵大豆制备的食品，富含MK-7)，和其他发酵食品和或乳制品。

可以制造富含维生素K的食品来提供维生素K的日常需求。例如，可以将维生素K添加至食品产品，诸如代餐品、冰淇淋、巧克力、口香糖、人造奶油、酱、调料、涂抹酱、棒、糖果、零食、谷物、饮料(诸如果汁、乳制饮品、粉状饮品、运动饮品和能量饮品)，其通过如在EP 1153 548和美国专利号8,354,129中描述的方法，其全部公开通过援引并入本文。替代地，维生素K可以包括在食品补剂中，诸如复合维生素、片剂、胶囊、酏剂、咀嚼物、软糖和其他补剂形式。一种优选的营养制剂包括50μg-1.5mg维生素K；5-10μg维生素D；450-550mg钙；7-12mg锌和100-200mg镁。

用于进行该方法的维生素K的剂量不受限制，但取决于以下而变化：例如受试者的年龄和内皮功能障碍的程度、动脉僵硬化的程度、血管的钙化的程度和期望的逆转钙化的程度。目前，推荐的维生素K的日剂量为男性120μg以及女性90μg。改善内皮功能、降低动脉僵硬度、增加内皮一氧化氮产生和/或降低钙化的益处可以在高于推荐值的剂量下获得，特别是在维生素K缺乏是常见的群体，诸如绝经后的女性中，或者可能以低于推荐值的剂量获得。例如，合适的剂量可以在10至2000μg/天、任选地50-1000μg/天、任选地150-500μg维生素K/天和任选地180-360μg/天的范围内。就体重而言，日剂量可以从0.5至300μg/kg体重/天，优选1至100μg/kg，以及最优选2至40μg/kg/天变化。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是可互换的并且是指导致疾病或病症的症状的改善、逆转或修复的量。例如，改善人内皮功能的维生素K的有效量可以在约50微克/天与约50毫克/天的上限之间。在人中快速改善内皮功能、去除钙、降低或逆转血管的钙化的各种实施方式中，可以给药在约10微克与约2毫克/天之间的剂量。

可以有效给药维生素K持续小于6个月的时间段，以及优选地给药持续2至20周的时间段。如果需要，在内皮功能充分改善、降低动脉僵硬度和/或去除血管壁内预先存在的钙沉积物已经发生后，可以将剂量降低至维持剂量。

维生素D可以连同维生素K被包括在组合物中，并且维生素D可以起到支持维生素K的功能的作用。可以采用任何形式的天然或合成维生素D，包括维生素D1、维生素D2(钙化醇)、维生素D3(胆钙化醇)和维生素D类似物(例如阿法骨化醇、双氢速甾醇、骨化三醇))。维生素D的天然来源包括咸水鱼、器官肉类、鱼肝油和蛋黄。维生素D的合适剂量为2至50μg/天，优选5至20μg/天，以及最优选约7至10μg/天。

药物或营养制剂可以包含一种或多种额外的组分。这样的额外的组分优选选自：多酚、维生素C、维生素E(生育酚或三烯生育酚)、L-精氨酸、植物甾醇、降血压肽、可溶性纤维(例如瓜尔胶、果胶)、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和/或ω-9脂肪酸、肉碱、牛磺酸、辅酶Q10、肌酸、叶酸、叶酸类化合物、镁、钾、维生素B6和维生素B12。还可以将所述药物或营养制剂与选自由以下组成的组的药物同时地、单独地或顺序地给药：抗凝剂、抗血栓剂、纤溶剂、抗高血压剂、利尿剂、抗心绞痛剂、降血脂剂、β-阻滞剂、ACE抑制剂、强心苷、磷酸二酯酶抑制剂、抗心律失常剂和钙拮抗剂。

维生素K的优选的给药途径是肠内，特别是口服，但也可以使用肠胃外或局部途径。如本文所用，“口服给药”包括口服、口腔、肠内或胃内给药。如本文所用，术语“肠胃外给药”包括任何形式的给药，其中维生素K在不涉及经过肠的吸收的情况下被吸收到血流中。用于本发明的示例性肠胃外给药包括但不限于肌内、静脉内、腹腔内、眼内、皮下或关节内给药。如果需要局部给药，可以使用物理或化学药物递送系统来增强皮肤渗透。

维生素K常规地以片剂或胶囊的形式即以药物或膳食补剂形式提供。对于药物制剂或膳食补剂，可以将维生素K以丸剂、片剂(包衣或未包衣的)、硬胶囊或软胶囊、糖衣丸、锭剂、口服溶液、混悬剂和分散剂、糖浆剂或无菌肠胃外制剂的形式与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合。合适的赋形剂包括：惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙、磷酸钠；制粒和崩解剂，诸如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉明胶或阿拉伯树胶；泡腾剂；以及润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

还可以在强化食品或饮料产品中递送或给药维生素K(任选地连同维生素D)。优选的营养产品形式包括：果汁饮品、乳制饮品、粉状饮品、运动饮品、矿泉水、大豆饮料、热巧克力、麦芽饮品、饼干、面包、薄脆饼干、甜食、巧克力、口香糖、人造奶油、涂抹酱、酸奶、早餐谷物、小吃棒、膳食替代物、蛋白粉、甜点、医学营养管饲料和营养补剂。

常规添加剂可以包括在本发明的组合物中，包括选自以下的那些的任一种：防腐剂、螯合剂、泡腾剂、天然或人造甜味剂、调味剂、着色剂、掩味剂、酸化剂、乳化剂、增稠剂、助悬剂、分散剂或润湿剂、抗氧化剂等。

可以以包含治疗剂量和维持剂量的试剂盒的形式提供维生素K。治疗剂量是在小于6个月内，有效诱导内皮功能快速改善、动脉僵硬度快速降低和/或快速去除血管壁内预先存在的钙沉积物的剂量。

维持剂量旨在用于完成治疗时间段后的长期给药。优选地，剂量是以片剂或胶囊的形式，并且治疗剂量是以足够治疗2-20周的量提供，以及维持剂量是以足够1-36个月的量提供。

在各种实施方式中，向以下给药维生素K：哺乳动物，包括人，以及宠物动物诸如狗和猫，实验室动物诸如大鼠和小鼠，以及农场动物诸如绵羊、马和牛。将受益于改善内皮功能、降低动脉僵硬度和逆转血管的钙化的患者，包括但不限于处于心血管疾患风险或已经患有病症诸如心绞痛、高血压、卒中史和其他脑血管疾患的任一者。具体目标人群体是：绝经后女性、糖尿病者、肥胖个体、吸烟者、酗酒者、久坐不动和不活跃的人、老年人、血液透析患者、超过40岁的男性、患有慢性应激的人以及那些食用不健康饮食易导致内皮功能障碍、动脉僵硬度和血管的钙化的人。将受益于改善内皮功能的患者包括患有高胆固醇血症的那些患者，包括患有家族性高胆固醇血症的患者。如本文所用，“高胆固醇血症”是指以在不存在或存在动脉粥样硬化斑块的情况下血液中胆固醇水平高为特征的病症。

在本发明的各种实施方式中，通过迅速改善内皮功能、降低动脉僵硬化并逆转钙化，可以将维生素K用于处理高血压、左心室肥大、充血性心力衰竭、心肌梗死、卒中和冠心病。

如本文所用，“血压升高”或“高血压”是指血压持续超过140/90mmHg(收缩/舒张)。与病理性钙化相关的疾病/病症包括但不限于软骨钙化(骨关节炎)、炎症诱导的钙化(例如别赫捷列夫氏病)、肿瘤诱导的钙化(常见于乳腺癌)、甲状旁腺功能亢进症、高磷血症、皮肤钙化诸如弹性假黄色瘤(PXE)和终末期肾病中的calcifylaxis。

动脉硬化的非药物/营养治疗方式涉及基于导管的程序，诸如血管成形术，其使用插入动脉的导管以将斑块压在动脉壁上以增加血液流动的空间。支架植入，通常在血管成形术后进行，使用放置在受损动脉中的金属丝网管来支撑动脉壁，并用于保持血管打开。

可以进行粥样斑块切除术(Atherectomy)，其中经由导管插入的器械用于切除和去除斑块，使得血液可以更容易地流动。必要时，给药根据本发明的维生素K可以降低或避免对动脉粥样硬化的基于导管或手术治疗的需要，而无需延迟基于导管或手术治疗持续延长的时间段。

内皮功能障碍是与受损的血管舒张(松弛和收缩因子之间的不平衡)以及促炎状态和促凝血形成(prothrombic)特性的变化相关的病理性病症。内皮功能可以通过任何合适的方法测量，包括但不限于：内皮依赖性血管舒张剂(例如乙酰胆碱)的冠状动脉内输注和定量冠状动脉造影(QCA)或血管内超声(IVUS)；给药增加浓度的内皮依赖性血管舒张剂并确定冠状血流量(CBF)的变化；在给药血管活性物质之前和之后，通过静脉体积描记术测量前臂血流量的变化；流量介导的臂动脉血管舒张(FMD)；和外周动脉张力测定法(PAT)。

如本文所用，术语“逆转钙化”包括去除沉积在血管中和/或血管上的预先存在的钙。钙化可以通过任何合适的方法检测，包括但不限于：铊应力测试、X射线摄影、冠状动脉钙化扫描、X射线透视、CT、血管成形术、MRI成像、超声检查、活检、通过组织化学等。

如本文所用，术语“动脉僵硬度”是指动脉的机械特性，包括动脉的弹性(或顺应性)。动脉僵硬度可以通过任何合适的方法测量，包括但不限于：脉搏压、脉搏波速度、脉搏波形分析和血管力学的局部评估。

如本文所用，术语“增加内皮一氧化氮产生”包括积极影响内皮产生的一氧化氮，使得与在处理之前观察到的内皮一氧化氮产生相比，受试者的内皮在处理期间和/或之后产生更多的一氧化氮。根据一些方面，增加的内皮一氧化氮产生可能对应于受试者中增加的亚硝酸根血浆浓度，这可能是内皮功能的可靠标志物。

提供以下实施例作为优选实施方式的代表并且不旨在限制本发明的范围。

实施例1

研究维生素K2补充在肾移植患者中对动脉僵硬度、动脉壁的硬度的功效和安全性的临床研究。

进行了临床研究。在t＝0和t＝8周进行动脉壁特性测量，并且示出动脉壁柔性的显著改善。这很好地支持了以下结论：即使在这个短的时间段内摄入维生素K，也是改善内皮功能、降低动脉僵硬度和降低钙化的有效方法。这与先前的研究(EP 1 728 507)形成鲜明对比，先前的研究示出仅在摄入3年后动脉僵硬度显著降低。这是令人惊讶和出乎意料的，因为钙化是缓慢的渐进过程，并且认为逆转此过程也将是缓慢和渐进的。此实施例示出，逆转钙化的优选处理时间段可以短至2周。

参与者参加了一项临床试验，其中确定了维生素K2对最近经历肾移植的患者的作用。在研究开始时，患者接受了无创脉搏波速度测量，以测量动脉僵硬度/柔性，以及血液分析。然后指导研究参与者接受MenaQ7维生素K2甲基萘醌-7的特定日剂量(360ug/天)，持续总计8周。在8周结束时，再次用随访检查、无创脉搏波速度测量和血液分析检查患者，并停止药物处理。

作为血液分析的部分，测量羧基化基质gla蛋白(MGP)作为维生素K2活性的直接量度。羧基化的MGP抑制血管的钙化，以及维生素K2刺激MGP的羧基化。经历透析的患者表现出维生素K2的缺乏，这可损害钙化抑制剂基质gla蛋白(MGP)的羧基化。

在处理8周后，测量的脉搏波速度的平均降低为30％。处理8周后，未羧基化的MGP水平的平均降低为55％。

实施例2

低剂量(0.03mg/kg b.w./天)以及高剂量(10mg/kg b.w./天)维生素K2(MK-7)对具有预先建立的动脉粥样硬化的小鼠中的内皮功能的作用进行评估。用K2(MK-7)处理小鼠持续两个月，并基于功能研究(NO依赖性血管舒张的基于MRI的评估)以及通过生化分析(血浆硝酸根和亚硝酸根浓度)分析体内内皮功能。另外，进行了K2(MK-7)对血管壁结构和动脉粥样硬化斑块组成的作用的全面定性和定量组织学分析。

实施例2(a)：材料和方法

动物：4月龄的ApoE/LDLR-/-小鼠(n＝76)，用维生素K2-MK-7(甲基萘醌-7；剂量：0.03和10mg/kg b.w./天)处理持续两个月时间段。

终点测定：乙酰胆碱(Ach)给药后头臂动脉(BCA)和左颈总动脉(LCA)中一氧化氮(NO)依赖性血管舒张的基于磁共振成像(MRI)的评估——通过MRI 9.4T扫描仪，总测量时间：114h(每只动物1.5h)，乙酰胆碱(Ach,16.6mg/kg b.w.)。

血浆中亚硝酸根(NO₂-)和硝酸根(NO₃-)浓度——基于HPLC的ENO-20

BCA中的斑块大小和组成以及血管壁面积(VWA)——组织学评估，截面法，BCA截面：总计13000个载玻片，拍照：1214个载玻片。

人贡献6名人员参与进行实验和数据分析。

对4月龄的雌性ApoE/LDLR-/-小鼠进行研究，该模型最初由Ishibashi S,Herz J,Maeda N,Goldstein J,Brown M.The two-receptor model of lipoprotein clearance:tests of the hypothesis in“knockout”mice lacking the low density lipoproteinreceptor,apolipoprotein E,or both proteins.Proc Natl Acad Sci U SA 1994；10:4431–5描述，并在先前的研究中被广泛表征，[参见Kostogrys RB,Franczyk-Zarow M,Gasior-Glogowska M,Kus E,Jasztal A,Wrobel TP,et al.Anti-atheroscleroticeffects of pravastatin in brachiocephalic artery in comparison with en faceaorta and aortic roots in ApoE/LDLR-/-mice.Pharmacol Reports 2017；69:112–8.Doi:10.1016/j.pharep.2016.09.014；Tyrankiewicz U,Skorka T,Orzylowska A,Jablonska M,Jasinski K,Jasztal A,et al.

Comprehensive MRI for the detection of subtle alterations indiastolic cardiac function in apoE/LDLR-/-mice with advancedatherosclerosis.NMR Biomed 2016；29:833–40.Doi:10.1002/nbm.3524；Mateuszuk L,Jasztal A,Maslak E,Gasior-Glogowska M,Baranska M,Sitek B,etal.Antiatherosclerotic Effects of 1-Methylnicotinamide in Apolipoprotein E/Low-Density Lipoprotein Receptor-Deficient Mice:A Comparison with NicotinicAcid.J Pharmacol Exp Ther 2016；356:514–24.Doi:10.1124/jpet.115.228643；WrobelTP,Marzec KM,Chlopicki S,E,Jasztal A,M,et al.,Effectsof Low Carbohydrate High Protein(LCHP)diet on atherosclerotic plaquephenotype in ApoE/LDLR-/-mice:FT-IR and Raman imaging.Sci Rep 2015；5:14002.doi:10.1038/srep14002；Kostogrys RB,M,E,Gajda M,Mateuszuk L,Jackson CL,et al.,Low carbohydrate,high protein diet promotesatherosclerosis in apolipoprotein E/low-density lipoprotein receptor doubleknockout mice(apoE/LDLR(-/-)).Atherosclerosis 2012；223:327–31.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2012.05.024；G,Gajda M,Franczyk-Zarow M,Kostogrys R,P,Mateuszuk L,et al.Functional alterations in endothelial NO,PGI2 andEDHF pathways in aorta in ApoE/LDLR-/-mice.Prostaglandins Other Lipid Mediat2012；98:107–15.doi:10.1016/j.prostaglandins.2012.02.002.)。将小鼠随机分配到三个实验组：对照——未处理组和用低剂量或高剂量甲基萘醌-7(MK-7,分别为0.03和10mg/kg b.w./天，与食品一起给予,MK-7由华沙药物研究所(Pharmaceutical ResearchInstitute,Warszawa)提供，经由Maresz博士赠送]处理持续两个月的两个组。为了评估体内内皮依赖性血管响应，使用如先前所述的基于MRI的方法对6月龄的小鼠进行成像[参见Bar A,Skorka T,Jasinski K,Sternak M,BartelTyrankiewicz U,etal.Retrospectively-gated MRI for in vivo assessment of endothelium-dependentvasodilatation and endothelial permeability in murine models of endothelialdysfunction.NMR Biomed2016；29(8):1088；Bar A,Skorka T,Jasinski K,ChlopickiS.MRI-based assessment of endothelial function in mice in vivo.PharmacolReports2015；67:765–70.doi:10.1016/j.pharep.2015.05.007]。在实验期间，在氧气和空气(1:2)混合物中使用异氟醚(1.7vol％)麻醉小鼠。通过比较腹腔内Ach给药之前和之后25分钟的主动脉弓的两个时间分辨的3D图像(图1)来检查血管的血管运动性(Vasomotor)响应(Sigma-Aldrich，波兰波兹南(PoznańPoland)，50μl，16.6mg/kg b.w.)。使用cineIntraGate^TM FLASH 3D序列获得图像。使用ImageJ软件(1.46r NIH Bethesda，马里兰(Maryland)，美国)和Matlab(MathWorks，纳蒂克(Natick)，马萨诸塞州(Natick)，美国)编写的脚本分析了BCA和LCA的舒张末期容积(图1A)。

在体内测量后，向小鼠腹腔内注射1000IU肝素(Sanofi-Synthelabo；巴黎(Paris)，法国)，并且在10min后，用40mg/kg b.w的硫喷妥钠(Biochemie；维也纳(Vienna)，奥地利)腹腔内麻醉。将血液样品从心脏收集到包含额外的抗凝剂的试管中，并且在4℃下以1000g离心10min。将样品用于通过ENO-20NOx分析仪对血浆中的硝酸根(NO₃ ^-)和亚硝酸根(NO₂ ^-)浓度进行HPLC测量。

为了确定动脉粥样硬化斑块面积和组成，将BCA解剖、固定在4％缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中。从动脉的近端、中端和远端部分收集BCA的5μm厚连续切片。最初用与Martius、Scarlet和Blue trichrom组合的Unna的地衣红(OMSB)显影染色，应用于每十个切片(每个切片之间50μm间隔)上，用于可视化动脉粥样硬化斑块内的胶原蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白、红细胞和血管平滑肌细胞。在使用先前开发的算法[Gajda M,Jasztal A,BanasikT,Jasek-Gajda E,Chlopicki S.Combined orcein and martius scarlet blue(OMSB)staining for qualitative and quantitative analyses of atherosclerotic plaquesin brachiocephalic arteries in apoE/LDLR-/-mice.Histochem Cell Biol 2017.doi:10.1007/s00418-017-1538-8.]基于Columbus软件处理之后，来确定动脉粥样硬化斑块的具体组分以及动脉内腔和壁的面积(图1B)。

实施例2(b)：结果描述

用低剂量和高剂量维生素MK-7处理对体内ApoE/LDLR-/-小鼠的内皮依赖性血管运动性响应的作用。

在6月龄的未处理的ApoE/LDLR-/-小鼠中，注射Ach(以50μl的体积i.p.给予16.6mg/kg b.w.)导致BCA和LCA的收缩，在BCA中总计为-9.13％以及在LCA中总计为-28.33％。

用低剂量维生素MK-7处理两个月足以改善内皮功能，如通过Ach诱导的血管收缩响应的部分逆转所证明的。观察到Ach注射后BCA(图2A)和LCA(图2B)的容积增加(血管容积变化：分别约为3％和-3％)。用高剂量维生素MK-7处理ApoE/LDLR-/-小鼠持续两个月也导致在LCA和BCA中由Ach诱导的内皮依赖性血管舒张的改善。尽管用低剂量(BCA和LCA的容积变化分别为：3.25％和-3.92％)和高剂量(BCA和LCA的容积变化分别为3.12％和4.45％)维生素MK-7处理的组中，Ach诱导的响应的平均结果相似，但由于更均匀的响应和较低的标准误差，在高剂量组中内皮功能的改善更显著。

用低剂量和高剂量维生素MK-7处理对血浆亚硝酸根和硝酸根浓度的作用

用低剂量以及高剂量维生素MK-7处理ApoE/LDLR-/-小鼠持续两个月导致血浆中的NO₂ ^-浓度增加(图3A)(分别增加约58％和42％)。在用以0.03mg/kg b.w./天或10mg/kgb.w./天的剂量的维生素MK-7处理的ApoE/LDLR-/-小鼠中，血浆中NO₃ ^-的浓度(图3B)都没有显著变化。

用低剂量和高剂量维生素MK-7处理对血管壁结构和中膜厚度的作用

如图4A所示，用维生素MK-7处理导致对于血管壁面积(VWA)的鲜明作用，这是代表血管壁的中膜层厚度的参数。在用维生素MK-7处理两个月的小鼠中，VWA显著降低(降低约5％，维生素MK-7的低剂量和高剂量类似)。在以下中的作用更加明显：在用较低剂量(0.03mg/kg b.w./天)维生素MK-7处理的ApoE/LDLR-/-小鼠中的血管的中端和远端部分以及在用较高剂量(10mg/kg b.w./天)维生素MK-7处理的ApoE/LDLR-/-小鼠的血管中的近端部分(图4B)，表明低剂量维生素MK-7对BCA的中端部分中的血管壁结构的作用更强，BCA的该部分的特征在于存在最早、最小晚期斑块和较小晚期血管病理。

用低剂量和高剂量维生素MK-7处理对动脉粥样硬化斑块大小和组成的作用

用低剂量或高剂量的维生素MK-7对ApoE/LDLR-/-小鼠进行两个月的处理未导致对斑块大小的有益作用。在用较低剂量维生素MK-7处理的小鼠中，内壁面积(IWA，图5A)，即斑块和内腔面积的总和，仅在血管的中端部分减少，并且此作用在整个血管中是不可见。因此，在用低剂量或高剂量维生素MK-7处理的小鼠中，表示为IWA的百分比的斑块和内腔面积(图5B-5C)没有变化。然而，尽管处理组和未处理组之间在斑块中胶原蛋白的含量上缺失差异(图5D)，但观察到动脉粥样硬化斑块组成的显著变化。在用低剂量或高剂量维生素MK-7处理的ApoE/LDLR-/-小鼠中，表示为斑块的百分比的脂质核(图5E)在用较低或较高剂量维生素MK-7处理两个月后减少(减少约17％，与低剂量和高剂量后类似)。特别地，斑块中脂质含量的变化在具有最小晚期斑块的BCA的中端部分和具有在分叉远端处形成的斑块的BCA的近端部分中是可见的，但在具有在分叉近端处形成的斑块的远端部分是不可见的。

实施例2(c)：结论

在患有晚期动脉粥样硬化的ApoE/LDLR-/-小鼠中，用维生素K2(MK-7)处理两个月改善了体内内皮功能，如通过以下证明的：由体内乙酰胆碱诱导的功能性内皮依赖性响应的改善，其是评估NO依赖性功能的经过充分验证的措施[Bar A,Skorka T,Jasinski K,Sternak M,Bartel,Tyrankiewicz U,et al.Retrospectively-gated MRI for in vivoassessment of endothelium-dependent vasodilatation and endothelialpermeability in murine models of endothelial dysfunction.NMR Biomed 2016；29(8):1088]，以及增加的血浆亚硝酸根浓度，其是反映内皮NO依赖性功能的参数[Kleinbongard P,Dejam A,Lauer T,Rassaf T,Schindler A,Picker O,et al.Plasmanitrite reflects constitutive nitric oxide synthase activity in mammals.FreeRadic Biol Med2003；35:790–6；Kleinbongard P,Dejam A,Lauer T,Jax T,Kerber S,Gharini P,et al.Plasma nitrite concentrations reflect the degree ofendothelial dysfunction in humans.Free Radic Biol Med 2006；40:295–302.

doi:10.1016/j.freeradbiomed.2005.08.025]。即使是低剂量(0.03mg/kg b.w./天)维生素K2也有显著作用。据我们所知，这里首次描述了维生素K2对内皮功能的作用。通过维生素K2改善内皮功能的原理是否与维生素K2的典型或非典型作用原理有关，需要进一步的原理研究。

也证实了维生素K2对血管结构的已知作用，因为如血管壁面积下降所证明的，用维生素K2(MK-7)处理导致中膜厚度显著下降。这种作用可能与在平滑肌细胞中维生素K2的已知原理——基质Gla蛋白的依赖性羧基化有关[Schurgers LJ,Uitto J,Reutelingsperger CP.Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein:acrucial switch to control ectopic mineralization.Trends Mol Med 2013；19:217–26.doi:10.1016/j.molmed.2012.12.008]，并且在BCA的中端部分最为明显，血管的该部分具有最早、最小晚期的动脉粥样硬化斑块。

尽管用维生素K2(MK-7)处理确实显著影响血管壁的中膜层的结构，但维生素K2(MK-7)对动脉粥样硬化斑块的大小没有实质性作用。这些结果并不令人惊讶，考虑到以下事实：在此研究中使用的是患有晚期动脉粥样硬化的ApoE/LDLR-/-小鼠，并且预期维生素K2不会具有强的抗动脉粥样硬化活性。另一方面，用维生素K2(MK-7)处理基本上改变了斑块组成，并且特别是脂质/斑块比率。维生素K2(MK-7)对斑块组成的作用在具有最早动脉粥样硬化斑块的BCA的中端部分最明显。此结果表明，如果实验在具有动脉粥样硬化斑块发展的早期阶段的模型中进行，则维生素K2的明显的抗炎作用可以转化为明显的抗动脉粥样硬化作用。此结果还表明，用维生素K2处理可能对动脉粥样硬化斑块发展具有预防作用。

总而言之，这里呈现的结果提供了令人信服的证据，即除了在先前报道的平滑肌细胞中其对中膜厚度和其他基质Gla蛋白依赖性原理的已知药理学活性外[Schurgers LJ,Uitto J,Reutelingsperger CP.Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein:a crucial switch to control ectopic mineralization.Trends Mol Med2013；19:217–26.doi:10.1016/j.molmed.2012.12.008]，维生素K2改善了内皮功能并限制动脉粥样硬化斑块的炎症负担。

维生素K2的内皮作用可与K2依赖性羧基化原理有关。无论原理是什么，由维生素K2提供的内皮功能改善可有助于改善血管僵硬度，血管僵硬度据报道由维生素K2改善[Knapen MHJ,Braam LAJLM,Drummen NE,Bekers O,Hoeks APG,Vermeer C.Menaquinone-7supplementation improves arterial stiffness in healthy postmenopausalwomen.Thromb Haemost2015；113:1135–44.doi:10.1160/TH14-08-0675]。事实上，已知血管僵硬度受内皮功能调节，并且改善内皮功能的改善了血管僵硬度[Daiber A,Steven S,Weber A,Shuvaev V V.,Muzykantov VR,Laher I,et al.Targeting vascular(endothelial)dysfunction.Br J Pharmacol 2016.doi:10.1111/bph.13517；O’RourkeMF,Hashimoto J.Arterial Stiffness.J Cardiopulm Rehabil Prev

2008；28:225–37.doi:10.1097/01.HCR.0000327179.21498.38]。

此外，考虑到以下事实：内皮参与大多数(如果不是所有)疾病状态，作为病理生理学的主要决定因素或作为附带损害的受害者[Chlopicki S.Perspectives inpharmacology of endothelium:From bench to bedside.Pharmacol Reports 2015；67:vi–ix.doi:10.1016/j.pharep.2015.08.005；Frolow M,Drozdz A,Kowalewska A,Nizankowski R,Chlopicki S.Comprehensive assessment of vascular health inpatients；towards endothelium-guided therapy.

Pharmacol Rep 2015；67:786–92.doi:10.1016/j.pharep.2015.05.010]，维生素K2对内皮功能的作用的发现表明了对于维生素K2作为在与内皮功能障碍相关的各种疾病/病症(例如糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、神经退行性疾病、肾移植患者、血液透析患者等)中的血管保护剂，新颖的治疗展望。

实施例3

在该研究的第一部分中，将低剂量(0.05mg/kg b.w./天)以及较高剂量(0.5mg/kgb.w./天和5mg/kg b.w./天)维生素K2(MK-7，除非另有说明,否则在此实施例中简称为“维生素K2”)对没有良好建立的动脉粥样硬化斑块和具有早期内皮功能障碍的ApoE/LDLR-/-小鼠中的内皮功能的作用进行评估。

在该研究的第二部分中，低剂量(0.03mg/kg b.w./天)以及高剂量(10mg/kgb.w./天)维生素K2(MK-7)对具有预先建立的动脉粥样硬化的ApoE/LDLR-/-小鼠中的内皮功能的作用进行评估。

在该研究的第一部分中，用维生素K2(MK-7)处理小鼠持续两周、四周或八周。在该研究的第二部分中，用维生素K2(MK-7)处理小鼠持续八周。

基于功能研究(基于MRI的评估和使用电子顺磁共振对主动脉中NO产生的评估)以及通过生化分析(血浆硝酸根、亚硝酸根和维生素K浓度，以及使用自动校准凝血酶曲线(Calibrated Automated Thrombogram)进行的凝血酶产生评估)来分析体内内皮功能。另外，进行了全面定性和定量组织学分析。

实施例3(a)：材料和方法

在该研究的第一部分中，将没有良好建立的动脉粥样硬化斑块和具有早期内皮功能障碍的的雄性小鼠(8-11周龄)用于检查用低剂量(0.05mg/kg b.w./天)或较高剂量(0.5和5mg/kg b.w./天)维生素K2(MK-7)处理两周、四周和八周的作用。将小鼠随机分配到四个实验组之一：对照(未处理的组)和分别用以0.05、0.5和5mg/kg b.w./天的剂量的维生素K2处理的三个组。在10-16周龄时进行终点测量。

在该研究的第二部分中，用K2(MK-7)处理患有晚期内皮功能障碍和预先建立的动脉粥样硬化的雌性小鼠(16周龄)持续8周。在该研究的此部分中，将小鼠随机分配到三个实验组之一：对照(未处理的组)和用低剂量和高剂量(分别为0.03和10mg/kg b.w./天)处理的两个组。在24周龄时进行终点测量。

为了进行这两项研究，将维生素K2溶解在大豆油中并作为如表1中示出的半合成AIN 93G饮食的一部分给药，不具有或具有包含维生素K1的标准维生素混合物。

将小鼠饲养在具有恒定环境条件(22-25℃、65-75％湿度和12小时光/暗循环)的房间中的集体笼中。动物随意获得每日提供的饮食和水。

表1

¹包含75mg/kg(相当于剂量0.15mg/kg b.w./天)维生素K1的标准维生素混合物

²没有维生素K1的维生素混合物

通过磁共振成像(MRI)评估体内内皮依赖性血管舒张

使用位于克拉科夫波兰科学院(Polish Academy of Sciences in Krakow)的核物理研究所(Institute of Nuclear Physics)的磁共振成像系的9.4T扫描仪(BioSpec94/20USR，Bruker，德国)进行磁共振成像(MRI)实验。在实验期间，使用异氟醚(Aerrane,Baxter Sp.z o.o.，波兰，1.7vol％)在氧气和空气(1:2)混合物中麻醉小鼠并在仰卧位成像。

使用监测和门控系统(Monitoring and Gating System)(SAInc.,Stony Brook，纽约，美国)监测心脏活动、呼吸和体温(使用循环温水维持在37℃下)。

基于以下评估内皮功能：在头臂动脉(BCA)、左颈总动脉(LCA)(图6A和B)和腹主动脉(AA)(图6C)中血管对乙酰胆碱(Ach)给药的响应，以及在股动脉(FA)(图6D)中对流量增加(流量介导的舒张，FMD)的响应，如在以下中描述的：Bar A,Skorka T,Jasinski K,Sternak M,Bartel,Tyrankiewicz U,et al.Retrospectively-gated MRI for in vivoassessment of endothelium-dependent vasodilatation and endothelialpermeability in murine models of endothelial dysfunction.NMR Biomed 2016；29(8):1088.；Sternak M,Bar A,Adamski MG,Mohaissen T,Marczyk B,Kieronska A,etal.The Deletion of Endothelial Sodium Channelα(αENaC)Impairs Endothelium-Dependent Vasodilation and Endothelial Barrier Integrity in Endotoxemia inVivo.Front Pharmacol2018；9:178.doi:10.3389/fphar.2018.00178.；以及Bar A,Olkowicz M,Tyrankiewicz U,Kus E,Jasinski K,Smolenski RT,et al.Functional andBiochemical Endothelial Profiling In Vivo in a Murine Model of EndothelialDysfunction；Comparison of Effects of 1-Methylnicotinamide and Angiotensin-converting Enzyme Inhibitor.Front Pharmacol 2017；8:183.doi:10.3389/fphar.2017.00183.)。

通过比较腹腔内Ach给药(Sigma-Aldrich，波兰波兹南：50μl，16.6mg/kg)之前和之后25分钟以及血管闭塞之前和之后5分钟的血管的两个时间分辨的3D图像，来检查血管运动性响应。

使用cine IntraGateTM FLASH 3D序列获得图像，用IntraGate 1.2.b.2宏(Bruker)重建。使用ImageJ软件1.46r(NIH Bethesda，马里兰，美国)和Matlab(MathWorks，纳蒂克，马萨诸塞州，美国)编写的脚本分析了血管的舒张末期容积。成像参数包括以下：重复时间(TR)-6.4ms、回波时间(TE)-1.4ms、视野(FOV)-30x30x5 mm3、矩阵大小-256x256x30、翻转角(FA)-30°和累积的数量(NA)-15，重建为7个心脏帧。总扫描时间为10分钟。

使用电子顺磁共振评估主动脉中内皮NO产生

为了测量内皮一氧化氮合酶(eNOS)依赖的一氧化氮(NO)产生，离体使用带有二乙基二硫代氨基甲酸钠盐(DETC)的EPR自旋捕获，如在以下中描述的，具有较小修改：Przyborowski K,Proniewski B,Czarny J,Smeda M,Sitek B,Zakrzewska A,etal.Vascular Nitric Oxide–Superoxide Balance and Thrombus Formation afterAcute Exercise.Med Sci Sport Exerc 2018:1.doi:10.1249/MSS.0000000000001589。

纵向打开从周围组织中清除的分离的主动脉，并在37℃下在48孔板的孔中用10μML-NIL(N6-(1-亚氨基乙基)-赖氨酸，盐酸盐)在Krebs-HEPES缓冲液中预孵育30分钟。接下来，加入250μL的Fe(DETC)2胶体，并用钙离子载体A23187(最终浓度为1μM)刺激主动脉，并且随后在37℃下孵育90分钟。最后，将主动脉称重并在液氮中冷冻(悬浮在新鲜缓冲液中)到在400μL的Krebs–Hepes缓冲液柱的中间，并储存在-80℃直至测量。使用配备有矩形谐振腔H102的X波段EPR光谱仪(EMX Plus，Bruker，德国)获得EPR谱。通过在基线校正后测量NO-Fe(DETC)2的总振幅来量化信号。通过EPR评估的NO产生的定量结果以组织的AU/mg表示。

血液取样和生化分析

在体内MRI测量后，向小鼠腹腔内注射1000IU肝素(Sanofi-Synthelabo；巴黎，法国)，并且在15分钟后，用100mg/kg b.w的氯胺酮+10mg/kg b.w甲苯噻嗪mg/kg b.w腹腔内麻醉。将血液样品从心脏收集到包含额外的抗凝剂的试管中。在同一天，使用自动生化分析仪ABX Pentra 400(Horiba Medical，京都(Kyoto)，日本)将25μL全血用于血球计数(bloodcount)分析。将剩余的血液在4℃下以1000g离心10分钟，并且将血浆深度冷冻，用于通过ENO-20NOx分析仪进行HPLC测量硝酸根(NO^3-)和亚硝酸根(NO^2-)浓度，或用于通过生化分析仪(ABX Pentra 400-Horiba Medical，京都，日本)进行脂质特征和肝酶分析。此外，如下文所述，在从用EDTA K2和蛋白酶抑制剂混合物收集的血液样品中获得的血浆样品中，对维生素K衍生物浓度进行基于L-APCI-MS/MS的评估，该血液样品在4℃下以1000g离心10分钟。

血浆维生素K浓度的基于LC-APCI-MS/MS的评估

为了测量血浆中维生素K2和还有其他维生素K衍生物(即维生素K1——叶绿醌(PK)和MK-4)的浓度，开发了基于具有大气压化学电离技术的高效液相色谱-串联质谱(LC-APCI-MS/MS)的选择性且灵敏的方法。该方法基于以下，具有一些调整：Riphagen IJ,vander Molen JC,van Faassen M,Navis G,de Borst MH,Muskiet FAJ,et al.Measurementof plasma vitamin K1(phylloquinone)and K2(menaquinones-4and-7)using HPLC-tandem mass spectrometry.Clin Chem Lab Med 2016；54:1201–10.doi:10.1515/cclm-2015-0864.。

通过将1mg标准品溶解在10mL乙醇中，制备分析物(K1、MK-4和MK-7)和内标(K1-d7)的单独储备溶液(100μg/mL)。在乙醇中制备10μg/mL的标准混合物储备溶液。将单独的储备溶液和标准混合物在使用前在-20℃下在黑暗中储存。对于分析曲线，通过用乙醇稀释储备溶液来制备范围是0.5ng/mL至10μg/mL的标准混合物的工作溶液。通过用乙醇稀释K1-d7储备溶液，制备1μg/mL的内标工作溶液。通过将90μL的空白血浆样品与10μL合适的标准工作溶液混合物混合来制备校准曲线样品。校准点的浓度等于0.05；0.1；0.25；0.5；0.75；1；2.5；5；10；25；50；100；200；400；600；750；1000ng/mL。

将琥珀色管中的100μL血浆的等分样品掺有10μL的内标——维生素K1-d7(在乙醇中1ug/mL)。加入额外的乙醇(200μL)以使蛋白变性，和1mL的己烷简单混合，接着是振荡15分钟。将溶液以15.000rpm离心15分钟，并且将上层定量转移到新管中，并在室温下在氮气流下蒸发。将残留物用30μL的2-丙醇溶解，以15.000rpm离心15分钟，并将5μL注射到柱中。

用Ultimate 3000HPLC系统(Dionex,森尼维耳市(Sunnyvale)，加利福尼亚州，美国)进行HPLC分析。使用反相PFP分析柱(Kinetex 2,6μm PFP,100.0x 3.0mm,Phenomenex,托伦斯(Torrance)，加利福尼亚州，美国)用由在2-丙醇中的0.1％甲酸(A相)和在5mM甲酸铵中的0.1％甲酸(B相)组成的流动相以梯度洗脱进行分离。测定的维生素K衍生物的色谱图在图12中示出。

用配备有APCI电喷雾离子源的TSQ Quantum Ultra三重四极杆质谱仪(ThermoScientific,沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州，美国)进行质谱法。以正电离模式收集所有MS分析。质谱仪工作参数如下：电晕放电针电压，4kV，汽化器温度：325℃，保护气体(sheathgas)压力50Arb，离子吹扫气体压力10Arb，辅助气体压力30Arb，毛细管温度325℃和具有氩气作为碰撞气体的碰撞压力1.5毫托。

使用自动校准凝血酶曲线(CAT)评估凝血酶产生

使用如以下描述的自动校准凝血酶曲线(calibrated automatedthrombography)(CAT)技术，在血小板缺乏的小鼠血浆中测量凝血酶产生：Hemker HC,Giesen P,Al Dieri R,Regnault V,de Smedt E,Wagenvoord R,et al.Calibratedautomated thrombin generation measurement in clotting plasma.PathophysiolHaemost Thromb 2003；33:4–15.doi:71636。

通过将21μL稀释血浆(1:1，与BSA5缓冲液)与7μlL的荧光底物(Z-Gly-Gly-Arg-AMC，16.6mM)和包含磷脂、组织因子和CaCl₂(分别为4μM、1pM和16.6mM)的14μL触发溶液混合来激活凝血酶产生。在校准孔中，将14μL试剂替换为校准品(102nM)。激活后立即将5μL的混合物移取到平底96孔聚苯乙烯板的纸盘上，并用40μL的矿物油覆盖。使用FluoroskanAscent软件(Thermo Labsystems，赫尔辛基(Helsinki)，芬兰(Finland))测量荧光信号，并将其转换为凝血酶浓度，如在以下描述的：Hemker HC,Kremers R.Data management inThrombin Generation.Thromb Res 2013；131:3–11.doi:10.1016/j.thromres.2012.10.011。分析的参数包括内源性凝血酶潜力(ETP)、峰值凝血酶浓度(峰值)和滞后时间。

动脉粥样硬化斑块的面积和组成的组织学评估(截面方法)

为了确定动脉粥样硬化斑块面积和组成，将分离的头臂动脉(BCA)解剖，固定在4％缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中。从动脉的近端至远端部分收集BCA的5μm厚连续切片。用与Martius、Scarlet和Blue trichrom组合的Unna的地衣红(OMSB)染色，应用于每十个切片(每个切片之间50μm间隔)上，用于定量分析动脉粥样硬化斑块。在使用如在GajdaM,Jasztal A,Banasik T,Jasek-Gajda E,Chlopicki S.Combined orcein and martiusscarlet blue(OMSB)staining for qualitative and quantitative analyses ofatherosclerotic plaques in brachiocephalic arteries in apoE/LDLR-/-mice.Histochem Cell Biol 2017.doi:10.1007/s00418-017-1538-8中描述的特别设计的算法基于Columbus软件处理之后，来确定动脉粥样硬化斑块的具体组分以及动脉内腔和壁的面积(图9)。分析的参数包括血管壁面积(VWA)、内部血管面积(IVA＝斑块面积+内腔面积)、斑块面积(表示为内壁面积的百分比：斑块/IWA)和内腔面积(表示为内壁面积的百分比：内腔/IWA)。

BCA中动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的免疫组织化学检测

为了检测BCA中的巨噬细胞，进行了动脉粥样硬化斑块免疫组织化学染色。用10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6)热诱导的表位修复后，将脱石蜡切片用5％正常山羊血清和1％过氧化氢封闭。巨噬细胞通过与单克隆抗Mac-3抗体(BD Pharmingen,550292)过夜孵育而显露。接下来，将切片用生物素化的二抗处理，随后用辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素处理。将3,3'-二氨基联苯胺(DAB)作为色原用于可视化抗体-抗原相互作用。用苏木精复染切片。考虑到阳性反应的数量和强度，手动评估Mac-3染色的强度。最终结果示出为来自两次独立分析的平均值。

实施例3(b)：结果描述

维生素K2处理对处于晚期动脉粥样硬化斑块发展之前的阶段的年轻ApoE/LDLR-/-小鼠中一氧化氮依赖性内皮功能的作用

如图7(A-B)中示出的，在15周龄处理的ApoE/LDLR^-/-小鼠中，与未处理的ApoE/LDLR^-/-小鼠相比，用低剂量(0.05mg/kg b.w./天)维生素K2(MK-7)处理四周改善了FA中的FMD(容积变化：用K2处理的小鼠中为33.26％以及在未处理的小鼠中为17.45％，p<0.001)以及改善了AA中的Ach响应(容积变化：用K2处理的小鼠中为-1.59％以及未处理的小鼠中为-11.22％，p＝0.02)。在此年龄下，ApoE/LDLR^-/-小鼠的特征为内皮功能障碍的成熟表型，但还没有晚期动脉粥样硬化斑块。

与维生素K2处理的四周时间段相比，用低剂量维生素K2(0.05mg/kg b.w./天)处理的两周时间段不足以改善内皮功能，如通过以下证明的：响应于股动脉中流量增加的血管舒张的程度(FMD-FA，图7A)和响应于腹主动脉中乙酰胆碱的内皮依赖性的程度(ACH-AA，图7B)缺少变化。然而，较高剂量维生素K2仅在处理两周后改善了内皮功能(与在未处理的小鼠中，分别为FA的20.86％和AA的-7.72％相比，对于0.5mg/kg b.w./天的剂量，容积变化：为FA的28.57％，p＝0.04和AA的1.52％，p＝0.05；以及对于5mg/kg b.w./天的剂量，容积变化：为FA的26.55％，p＝0.1和AA的0.16％，p＝0.1)。

与通过用K2给药4周以低剂量处理实现的内皮功能改善相比，通过用较高剂量(0.5mg/kg b.w./天和5mg/kg b.w./天)K2处理四周所提供的内皮功能改善并不优异(图7(A-B))，尽管事实上，维生素K2的三种剂量(0.05；0.5；5mg/kg b.w./天)导致K2(图8A)和和MK-4(图8B)的血浆浓度的剂量依赖性增加。MK4 2,3-环氧化物在血浆中的浓度(图8E)在所有组中保持在相似水平，而维生素K1(图8C)和K1 2,3-环氧化物(图8D)血浆浓度随着维生素K2的剂量增加而倾向于下降。

此外，与以低剂量(0.05mg/kg b.w./天)给药的K2相比，将处理时间延长至8周(图7C-D)也与优异的处理作用无关(与在未处理的小鼠中，分别为FA的14.28％和AA的-16.22％相比，容积变化：为FA的28.34％，p＝0.03，和AA的-0.65％，p＝0.05)。

通过取自与未处理的、年龄匹配的ApoE/LDLR^-/-小鼠相比，用低剂量(0.05mg/kgb.w./天)维生素K2处理的ApoE/LDLR^-/-小鼠(图2E)，示出通过在离体主动脉中EPR在相同动物中测量的增加的一氧化氮产生，证实了低剂量(0.05mg/kg)维生素K2改善体内测量的内皮依赖性血管舒张的积极作用。

维生素K₂处理对处于晚期动脉粥样硬化阶段的较老ApoE/LDLR-/-小鼠中内皮功能的作用

在24周龄、未处理的ApoE/LDLR^-/-小鼠中，其特征为晚期内皮功能障碍和动脉粥样硬化斑块的存在，注射Ach导致BCA和LCA的收缩，在BCA中总计为-9.13％以及在LCA中总计为-28.33％。如图10(A-B)中示出的，用低剂量(0.03mg/kg b.w/天)维生素K2处理八周导致内皮功能的改善，如通过Ach诱导的血管收缩响应的部分逆转所证明的。Ach注射后BCA(图10A)和LCA(图10B)的容积变化分别为约3％和-3％。用高剂量(10mg/kg b.w/天)维生素K2处理ApoE/LDLR^-/-小鼠持续八周也导致在LCA和BCA中由Ach诱导的内皮依赖性血管舒张的改善。

在用低剂量(对于BCA和LCA，容积变化：分别为3.25％和-3.92％)和高剂量(对于BCA和LCA，容积变化：分别为3.12％和4.45％)维生素K2处理的组中，Ach诱导的响应的平均结果是相似的。然而，由于更均匀的响应和更低的标准误差，高剂量组中内皮功能的改善更显著。

通过用低剂量以及高剂量维生素K2处理较老ApoE/LDLR^-/-小鼠持续八周的内皮依赖性血管舒张的改善导致了血浆中NO₂ ^-浓度(图10C)增加(分别增加约58％和42％)。在用以0.03mg/kg b.w./天的剂量或以10mg/kg b.w./天的剂量的维生素K2处理的ApoE/LDLR-/-小鼠中，血浆中NO₃ ^-的浓度(图10D)都没有显著变化。

用不影响脂质特征、肝酶浓度、血细胞计数(表2)或凝血酶产生(图10(E-F))的任一剂量的维生素K2对ApoE/LDLR^-/-小鼠处理八周。

表2

用维生素K2-MK-7处理对于处于晚期动脉粥样硬化阶段的较老ApoE/LDLR-/-中头臂动脉中的血管壁结构、中膜厚度和动脉粥样硬化斑块大小的作用

如图11A中示出的，与24周龄未处理的ApoE/LDLR-/-小鼠相比，在用维生素K2(MK-7)处理持续八周的24周龄ApoE/LDLR-/-小鼠中，对血管壁面积(VWA)有鲜明作用，参数代表血管壁的中膜层厚度。低剂量和高剂量维生素K2的作用程度相似(对于低剂量和高剂量维生素K2-MK-7，VWA降低约5％)。

与未处理的24周龄的ApoE/LDLR-/-小鼠相比，用维生素K2在低剂量(0.03mg/kgb.w./天)或高剂量(10mg/kg b.w./天)下用维生素K2处理持续八周的24周龄ApoE/LDLR-/-小鼠中的斑块大小没有差异。在用较低剂量维生素K2处理的小鼠中，内壁面积(IWA，图11(B))，即斑块和内腔面积的总和，仅在血管的中端部分减少(未示出数据)，但是此作用在整个血管中是不可见。因此，在用低剂量或高剂量维生素K2处理的小鼠中，表示为IWA的百分比的斑块和内腔面积(图11(C-D))没有变化。维生素K2对动脉粥样硬化斑块大小的作用的缺失与动脉粥样硬化斑块中MAC的未变化的表达相一致，这表明在处理的和未处理的24月龄的ApoE/LDLR-/-小鼠中动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞含量相似(MAC-3染色的强度：在未处理的小鼠中为92±28；在用低剂量(0.05mg/kg b.w./天)的K2-MK-7处理的小鼠中为128±26；在用高剂量(10mg/kg b.w./天)K2-MK-7处理的小鼠中为139±29)。

实施例3(c)：结论

得出的结论是，维生素K2(MK-7)改善了ApoE/LDLR^-/-小鼠中的NO依赖性内皮功能。尤其，结果示出，维生素K2提供了血管保护作用，与在ApoE/LDLR^-/-小鼠中在动脉粥样硬化斑块发生之前或同时是否用维生素K2处理内皮功能障碍无关，表明维生素K2诱导的对内皮功能的作用与维生素K2可能的抗动脉粥样硬化作用无关联。此外，这些结果并未证实维生素K2(MK-7)处理对动脉粥样硬化斑块大小和巨噬细胞含量的任何显著作用。维生素K2诱导的内皮功能的改善也与凝血因子活性的变化无关联，如由凝血酶活性(CAT)未变化所证明的。

因此得出结论，维生素K2(MK-7)的低剂量，特别是与推荐给人的维生素K2的有效剂量相当的那些剂量，为心血管健康提供益处，可在调节内皮功能中发挥重要作用。

此项研究示出，低剂量维生素K2(MK-7)可以改善主动脉中由乙酰胆碱诱导的和在股主动脉中由流量诱导的内皮依赖性响应。先前示出这些响应是由在小鼠中的内皮NO介导的。通过主动脉中的EPR测量离体证实了通过用维生素K2处理改善内皮功能，这表明与未处理的动物相比，在取自维生素K2处理的ApoE/LDLR^-/-小鼠的主动脉中，NO产生增加。通过维生素K2的内皮依赖性血管舒张的改善也与增加的亚硝酸根血浆浓度(内皮功能的可靠标志物)相关。

用低剂量(0.05mg/kg b.w./天)维生素K2处理导致在血浆中几乎检测不到的MK-7水平(在每六只小鼠中检测到2只，总计11.06nM)，表明MK-7被赋予了药理功效，在浓度的纳摩尔范围内改善内皮功能。

有趣的是，处理四周后维生素K2的内皮作用可以被加速到处理的两周，但不通过用较高剂量(0.5、5mg/kg b.w./天)维生素K2处理来加强，尽管MK-7的血浆浓度较高以及通过较高剂量维生素K2处理方案实现的MK-4的血浆浓度的平行增加。这些结果似乎与维生素K2—MK-7在体内经由UBIAD1转化为维生素K2—MK-4的观点相一致，但是这里报道的内皮作用是由MK-7直接诱导还是由MK-4在MK-7代谢后诱导尚待确定。尽管如此，此项研究表明，维生素K2(MK-7)的可饱和内皮作用原理是用维生素K2(MK-7)的相对低剂量和血浆维生素K2浓度的低纳摩尔范围来实现的。

在此研究中未确定涉及维生素K2诱导的内皮功能改善的原理。然而，此项研究证实，维生素K2的内皮作用与凝血系统无关，如通过基于CAT(用于定量评估凝血酶产生的参考方法)测量的凝血酶活性未变化所证明的。该研究还排除了通过在ApoE/LDLR^-/-小鼠中证明的维生素K2改善内皮功能与抑制动脉粥样硬化斑块形成有关联的可能性，因为维生素K2提供了血管保护作用，与在年轻和较老ApoE/LDLR^-/-小鼠中在动脉粥样硬化斑块发生之前或同时是否用维生素K2处理内皮功能障碍无关。

与缺乏抗动脉粥样硬化作用相比，维生素K2提供了与维生素K2的低剂量和高剂量程度相似的中膜厚度降低，这可能与平滑肌细胞中基质Gla蛋白(MGP)的维生素K2依赖性羧基化有关联，这是维生素K2的充分描述的原理。因此，低剂量维生素K2足以改善ApoE/LDLR^-/-小鼠中血管壁的平滑肌细胞的羧基化状态。内皮NO依赖性功能的改善是否与内皮中改善的羧基化状态、与MGP或与其他维生素K依赖性蛋白(VKPD)相关联尚待确定。

在内皮中确定了包括MGP(血管钙化的重要抑制剂)、涉及内皮存活的Gas6和骨钙蛋白(OC)的许多VKPD。基于此项研究，仍然不确定哪些类型的VKPD在NO依赖性功能的调节中起作用。一种可能性是，维生素K2对平滑肌细胞的有益作用或者维生素K2的抗炎作用也有助于改善由维生素K2诱导的内皮功能。此外，内皮或其他细胞中的VKDP非依赖性原理也存在可能性。

无论如何，本发明研究示出，维生素K2的低剂量，即与人有效的血管保护剂量(180-360μg)相容，改善内皮功能。数据暗示，此处发现的维生素K2的内皮作用可有助于维生素K2对血管健康的有益作用。此外，内皮功能障碍也可能涉及维生素K不足——与心血管死亡率有关。此项研究提供了以下证据，维生素K2处理改善了ApoE/LDLR^-/-小鼠中的内皮功能障碍，该小鼠是高的高胆固醇血症的基因驱动的模型，与在人试验中研究的老龄或绝经女性相比，代表了不同的内皮和血管病理学，示出维生素K2处理对内皮功能的负面结果。因此，应考虑维生素K2处理对内皮功能可能的疾病特异性影响。

总之，此项研究示出的维生素K2对内皮功能的作用是令人惊讶的。考虑到以下事实：内皮参与大多数(如果不是所有)疾病状态(作为病理生理学的主要决定因素或作为附带损害的受害者)，维生素K2可能被认为是与内皮功能障碍相关的各种疾病中的潜在血管保护剂。