调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征药物中的应用
阅读说明：本技术 调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征药物中的应用 (Application of preparation for regulating and controlling expression level of ApoC3 in preparation of medicine for preventing or treating insulin-resistant polycystic ovarian syndrome ) 是由 李荔 曾静 胡克 莫蕙 张红梅 李小芳 繆华章 茹雪媚 周嘉禾 钟明琳 叶喜阳 于 2021-02-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征药物中的应用。本发明通过发现,PCOS患者卵巢组织及颗粒细胞呈增殖状态,PCOS患者卵巢组织ApoC3高表达,PCOS模型大鼠卵巢组织ApoC3高表达,与PCOS卵巢局部胰岛素抵抗密切相关,进一步发现,利用胰岛素增敏剂可以下调卵巢中APOC3蛋白表达,改善模型大鼠卵巢组织的IR抵抗情况,因此可以将调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵抗型多囊卵巢综合征药物中的应用。(The invention discloses application of a preparation for regulating and controlling the expression level of ApoC3 in preparing a medicament for preventing or treating insulin-resistant polycystic ovary syndrome. According to the invention, the ovarian tissue and granular cells of a PCOS patient are in a proliferation state, the ovarian tissue ApoC3 of the PCOS patient is highly expressed, and the ovarian tissue ApoC3 of a PCOS model rat is highly expressed and is closely related to local insulin resistance of the PCOS ovary, and further, the application of an insulin sensitizer to the preparation of a medicine for preventing or treating insulin-resistant polycystic ovarian syndrome can be used for regulating the expression level of ApoC3, so that the APOC3 protein in the ovary can be down-regulated, and the IR resistance condition of the ovarian tissue of the model rat can be improved.)
技术领域
：本发明属于生物医药领域，具体涉及调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素 抵抗型多囊卵巢综合征药物中的应用。
背景技术
：一、胰岛素抵抗型的PCOS患者存在更为严重的糖脂代谢紊乱，尽早干预，对于改善PCOS患者生殖健康至关重要。
胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)和高胰岛素血症是多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)患者主要病理基础，在PCOS的发生发展中起关键的作用，国内外研究发 现PCOS患者中50-70％存在IR及高胰岛素血症。PCOS患者胰岛素抵抗状态(PCOS-IR) 不仅影响其生育力，还与一系列的健康问题相关，包括月经稀发或闭经、异常子宫出血、自 然流产、妊娠高血压疾病、2型糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等。2013年美国内分泌协 会颁布PCOS诊疗指南指出：不孕在PCOS患者中是突出存在的临床问题；PCOS-IR患者还 存在着诸多如妊娠糖尿病、先兆子痫等产科并发症，其罹患2型糖尿病、心血管疾病、子宫 内膜癌的风险比不伴IR的PCOS患者高2-6倍。2018年PCOS国际循证指南提出：PCOS属 于影响公共健康的疾病。我们前期研究亦发现：胰岛素抵抗型的PCOS患者存在更为严重的 糖脂代谢紊乱，尽早干预PCOS患者的胰岛素抵抗，对于提高妇女生殖健康有重要意义。
二、载脂蛋白C-Ⅲ可作为分子标记物，诊断PCOS患者的胰岛素抵抗状态。
ApoC3基因位于11号染色体A1/CIII/AIV基因簇内，全长3.1kb，编码ApoC3蛋白。ApoC3 蛋白是一个拥有79个氨基酸的糖蛋白，人体内主要在肝脏合成，少量在小肠合成，主要是调 节三酰甘油脂蛋白(TRLS)的分解与代谢。ApoC3作为脂蛋白脂酶(LPL)抑制剂，可通过 抑制脂肪酶、肝脂酶、胆固醇脂卵磷脂酰基转移酶的活性影响脂代谢。多位学者提出ApoC3 过多，不仅使脂蛋白与低密度脂蛋白受体结合受阻，而且使脂蛋白与TRLs及其残粒结合受 阻，抑制受体与极低密度脂蛋白(VLDL)、乳糜微粒(DM)有效结合，可以引起脂代谢紊乱， 可造成内脏脂肪堆积、肥胖、高甘油三酯血症、2型糖尿病等。
三、PCOS患者存在卵巢局部IR，与高表达的ApoC3密切相关，导致排卵功能障碍。
近20年来，越来越多的研究表明，胰岛素抵抗以及代偿性高胰岛素血症是PCOS的重 要特征改变之一，胰岛素代谢异常或胰岛素信号传导途径异常是PCOS发病机制的核心。PCOS-IR能够增加垂体对促性腺激素释放激素的反应性，导致促黄体生成素以及雄激素分泌 增加，破坏下丘脑-垂体-卵巢轴的正常功能，与高雄激素血症、生殖障碍和代谢综合征等密 切相关。多项研究表明在患有PCOS的女性中,胰岛素活性在经典靶器官(脂肪组织和骨骼肌 等)中缺失引起胰岛素抵抗。PCOS同时具有卵巢局部IR，如卵巢颗粒细胞IR，影响卵巢局 部葡萄糖代谢、胆固醇摄取、甾体激素生成以及细胞分裂增殖。有研究发现PCOS患者卵巢 颗粒细胞存在受体后胰岛素信号传导分子的改变，导致下游激酶活性的改变，减弱胰岛素信 号转导，促进卵巢局部胰岛素抵抗发生。可见，胰岛素活性缺陷的复杂机制也可表现在卵巢 局部，而这也是我们本次研究的主要内容。胰岛素在细胞内的信号传导途径包括调节葡萄糖 代谢的促代谢途径和引起细胞分裂增殖作用的促分裂途径等。卵巢局部IR时表现为细胞内胰 岛素的促代谢作用途径受损，而促分裂作用途径发生放大现象，使卵巢体积增加、卵泡发育 停滞、排卵障碍、及卵巢局部高雄激素状态，并导致生殖障碍。我们前期发现：PCOS患者 卵巢组织及颗粒细胞呈增殖状态。
发明内容
：本发明的目的是提供调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵抗型多囊卵巢 综合征药物中的应用。
优选，所述的调控ApoC3表达量的制剂是降低ApoC3表达量的制剂。
进一步优选，所述的降低ApoC3表达量的制剂是胰岛素增敏剂。
优选，所述的胰岛素增敏剂可以为二甲双胍或小檗碱。
本发明通过发现，PCOS患者卵巢组织及颗粒细胞呈增殖状态，PCOS患者卵巢组织ApoC3高表达，PCOS模型大鼠卵巢组织ApoC3高表达，与PCOS卵巢局部胰岛素抵抗密 切相关，进一步发现，利用胰岛素增敏剂可以下调卵巢中APOC3蛋白表达，改善模型大鼠 卵巢组织的IR抵抗情况，因此可以将调控ApoC3表达量的制剂在制备预防或治疗胰岛素抵 抗型多囊卵巢综合征药物中的应用。
附图说明
：图1是免疫组化法及Western blot检测PCNA表达，其中A是免疫组化检测PCNA表达，B 是Westernblot检测PCNA表达，C是Westernblot检测caspase 3的表达。
图2是PCOS-IR患者卵巢组织中ApoC3蛋白高表达(HE×40)，A.PCOS-IR卵巢颗粒细胞 ApoC3高表达，B.PCOS-NIR卵巢组织ApoC3低表达；
图3是PCOS模型组及对照组大鼠阴道上皮细胞(A.模型组，B.对照组)；
图4是模型组大鼠胰岛素、HOMA-IR高于对照组大鼠(p＜0.01)；
图5是用胰岛素增敏剂(高、中、低剂量小檗碱及二甲双胍)能改善模型大鼠卵巢组织的IR 抵抗情况，大鼠卵巢ApoC3表达随之下降的图。
具体实施方式
：
以下实施例是对本发明的进一步阐述，而不是对本发明的限制。
实施例1：
材料与方法
1、临床样本的收集
由于PCOS的高度异质性，其诊断标准尚有分歧，本项目组采用2003年欧洲人类生殖和 胚胎与美国生殖医学会的(ESHRE/ASRM)鹿特丹专家会议推荐的诊断标准：
(1)、稀发排卵或无排卵；
(2)、高雄激素的临床表现和(或)高雄激素血症；
(3)、超声表现为多囊卵巢(一侧或双侧卵巢有12个以上直径为2～9mm的卵泡，和(或) 卵巢体积＞10ml)；
(4)、上述3条中符合2条，并排除其他高雄疾病如先天性肾上腺皮质增生、库兴综合征、 分泌雄激素的肿瘤。
由于PCOS的诊断需要排除其他相关高雄激素性疾病，故由专业研究人员按照鹿特丹专家 会议进行筛选PCOS患者。
病例纳入标准如下：
(1)、符合多囊卵巢综合征的诊断标准；
(2)、年龄在18～45岁之间的女性；
(3)、本次治疗期间未曾使用过其他西药治疗；
(4)、知情同意，志愿受试，并可追踪观察者。
病例排除标准如下：
(1)、不符合多囊卵巢综合征的诊断标准者；
(2)、年龄在18以下或45岁以上的女性，或为妊娠期、哺乳期妇女；
(3)、具有严重的心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、血液系统疾病、肺脏疾病或影响其 生存的重大疾病，如肿瘤或艾滋病等；
(4)、有精神或法律上的残疾患者；
(5)、肾上腺、甲状腺、垂体等内分泌功能异常的患者；
(6)、怀疑或确有酒精、药物滥用病史的患者；
PCOS胰岛素抵抗组(实验组)入选30例，PCOS非胰岛素抵抗组(对照组)选择年龄、体重与PCOS胰岛素抵抗组患者匹配的患者，入选30例；两组患者均行腹腔镜下卵巢楔形切除 术，取楔形切除的卵巢组织进行研究。收集样本前，征得医院伦理委员会及患者同意，伦理 委员会审批号为：201401011，并与患者签署手术同意书。腹腔镜手术收集卵巢组织样本时， 其大小应达到整个卵巢组织的十分之一，在卵巢组织表面取一块类似金字塔样结构的组织， 该组织应包括有颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞、间质细胞等各种结构。手术将由广东省 妇幼保健院具有IV类腹腔镜执业资格的妇科内分泌主任医师进行，以确保临床样本收集的准 确性及代表性。
2、卵巢组织病理及免疫组化
A、组织切片制备
a组织块石蜡包埋
将活检取出的子宫内膜组织用4％甲醛溶液固定(配置方法：40％甲醛溶液和水按1:9比 例配制而成)。固定时间以12-24h为宜。将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h后依次 用一次70％酒精、80％酒精各脱水2小时，90％酒精脱水1h，95％酒精脱水40min，无水乙 醇Ⅰ脱水40min，无水乙醇Ⅱ脱水30min。并可将组织放于70％酒精中过夜。脱水后组织直接 浸入二甲苯透明剂中(二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ)，每次透明为10min。而后采用56℃-58℃石蜡将 组织浸入软蜡Ⅰ1h左右，再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min，硬蜡Ⅱ1h。(一般浸蜡时间为3-4h) 软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。最后把蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块 平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。(硬蜡凝 固定型)
b石蜡切片
在切片前先切去标本周围过多的石蜡(此过程称为“修块”)，但也不能留得太少，否则易 造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切片厚度为5μm。贴片时先在干净的载玻片上涂 一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1-2h，直到玻片烘干；若组织剥脱可涂一层蛋清加 以固定。将贴好的片放置在干净的玻片盒中，4℃冰箱保存，备用。
B、免疫组化部分
a脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。然后把组织切 片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；而后分别在无水乙醇中浸泡、95％ 乙醇中浸泡以及70％乙醇中各浸泡5min后，用PBS洗两次，每次各5min。接着用蒸馏水或 PBS配置新鲜的3％H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
b包埋
抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。煮沸热修复，电炉或者水浴锅加热， 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右，放入组织切片加热10～15min，加热完毕用 自来水冷却至室温，方能将切片取出。用PBS洗5min后，滴加5％BSA封闭液，室温封闭15分钟。甩去多余液体，不洗。而后滴加一抗，4℃过夜(4℃过夜后在室温复温45min)。 第二天清晨用PBS洗3次每次2min。接着滴加聚合HRP标记抗兔子/小鼠IgG二抗，室温孵 育1h。然后用PBS洗3次每次2min。
c显色
用DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)，观察至目的信号深背景 颜色浅时立即用蒸馏水终止。先用苏木素复染20s，蒸馏水洗2次每次2min。而后把切片依 次放入50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇中脱水，每次2min。接着将切片放入100％ 二甲苯10min透明。最后用中性树脂50ul封片，室温保存。
3、结果：
人组织样本caspase3及PCNA检测
(1)选取30例PCOS患者及非30例非PCOS卵巢组织进行研究，提取总蛋白，用Western blot检测caspase3的蛋白表达量，结果显示PCOS组中cleaved caspase3的表达量较正常组要 低，表明PCOS卵巢组织中细胞凋亡量要少于正常组。分别用免疫组化法及Westernblot检测 PCNA表达，免疫组化结果表明：PCOS患者中PCNA的表达较正常组增加(红棕色)，因为 PCNA与细胞增殖程度相关，PCNA的表达量增加表明PCOS中细胞增殖较正常组增多。 Western blot检测组织显示，PCOS组织中PCNA的表达量较正常组要高，结果与免疫组化的 结果一致。GAPDH为内参，两组caspase3及PCNA灰度进行统计，PCOS组明显高于对照， 具有统计学意义。误差线代表标准误，P<0.05。图1
(2)、前期预实验对PCOS患者卵巢组织进行免疫组化研究：发现PCOS-IR患者卵巢组织 中ApoC3蛋白高表达，见图2，其中A显示PCOS-IR患者卵巢组织中卵巢颗粒细胞的胞核、 胞浆中ApoC3均高表达，染色呈深棕黄色；B显示PCOS-NIR患者卵巢颗粒细胞的胞核、胞浆中ApoC3均低表达。免疫组化结果提示：ApoC3可能参与PCOS卵巢局部胰岛素抵抗。
实施例2：PCOS-IR大鼠模型的建立
一、材料与方法
1.实验动物
80只21日龄雌性SD大鼠，来源于广东省医学实验动物中心25℃恒温(50％湿度)，清洁级饲养。12小时光照(6：00～18：00)和12小时黑暗(18：00～6：00)周期交替 进行。自由摄取食物和水。
2.实验材料及仪器
DHEA、芝麻油、普通饲料(由广东省医学实验动物中心加工完成)、葡萄糖、0.9％生理 盐水、Elisa试剂盒、瑞-姬氏染色试剂盒、血糖仪(三诺)、血糖试纸、光学显微镜、离心机等。
3.方法
3.1大鼠动物模型造模方法选取21日龄SD雌性大鼠，参照随机数表法随机分成模型 组与空白对照组，对照组15只，模型组65只。分组后，模型组大鼠颈背部皮下注射溶于注射用芝麻油的脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)溶液0.2ml(6mg/100g)，空白对照组大鼠颈背部皮下注射注射用芝麻油0.2ml，连续注射49天。每三天大鼠称重一次。
3.2造模成功评估方法
3.2.1大鼠阴道上皮细胞
经造模结束前10天，连续每天通过瑞-姬氏染色方法，观察大鼠阴道脱落细胞学变化， 阴道上皮细胞持续10天为角化状态，为诱导成功的PCOS大鼠。
具体实验方法为：用无菌棉签蘸少许生理盐水，插入大鼠阴道轻轻捻动，取出棉签，将 带有阴道上皮细胞的黏液沿同一个方向涂抹在玻片上，自然干燥，每一只大鼠每日制作两张 玻片，用瑞-姬氏染色A试剂3-4滴均匀涂染30-60s，然后加B试剂6-10滴，再染色10min 后自来水冲洗，自然干燥后分别在40倍、100倍光学显微镜下观察阴道上皮细胞。
3.2.2大鼠空腹血糖及空腹胰岛素检测：将成功PCOS模型大鼠和空白组大鼠各随机选 取10只老鼠，当晚8时禁食，次晨8时取大鼠眶静脉血做空腹血糖(Fasting blood-glucose, FBG)和空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)检测。血糖水平通过葡萄糖氧化酶法(罗氏血糖仪) 检测，胰岛素(INS)采用酶联免疫(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)方法检测。 按照2g/kg的剂量大鼠灌胃50％葡萄糖，在给葡萄糖后30，60，120min大鼠剪尾取一滴血 通过血糖仪监测大鼠血糖，绘制OGTT曲线，计算曲线下面积。以及在60,120min时眶静脉 取1ml血于含有抗凝剂的干燥管中，放置在冰上，待当日取材完毕后，离心15min(2500转/ 分)，仔细收集上清，用ELISA方法检测血清胰岛素。依据胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)计算方法，HOMA-IR＝FBG(mmol/L)×FINS(m U/L)/22.5。
4、动物实验结果
PCOS-IR大鼠卵巢组织ApoC3蛋白高表达，使用胰岛素增敏剂能改善模型大鼠IR状态， 其卵巢组织ApoC3蛋白表达随之下降。
1、我们通过皮下注射脱氢表雄酮(溶解于芝麻油中)法，成功建立PCOS-IR大鼠模型。 结果显示模型组大鼠的阴道上皮细胞持续10天均为角化状态，无明显动情周期，而对照组 大鼠有动情周期。提示PCOS-IR大鼠模型建立成功，见图3。
2、模型组(PCOS-IR组)大鼠空腹胰岛素值、HOMA-IR指数明显高于对照组；模型组大鼠空腹胰岛素水平、服用葡萄糖后1h以及2h胰岛素均远高于对照组大鼠，p＜0.01，提示成功建立PCOS-IR大鼠模型，见图4。
3、Western Blot检测各组大鼠卵巢组织中APOC3蛋白的表达：
实验方法
60只PCOS-IR大鼠采用随机分组，每组12只分别为：模型组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组、盐酸二甲双胍阳性对照组。
对照组采用胰岛素增敏剂盐酸二甲双胍(500mgbid)，根据动物公斤体重剂量折算系数 法换算出大鼠的等效剂量。治疗组大鼠分别以高剂量(162mg/kg)、中剂量(81mg/kg)、低剂 量(40.2mg/kg)的小檗碱进行灌胃干预，每天一次，每次2ml，二甲双胍组每日给予2ml盐 酸二甲双胍溶液(45mg/kg)灌胃。连续给药28天。
PCOS-IR大鼠卵巢组织中ApoC3蛋白高表达，且使用胰岛素增敏剂(高、中、低剂量小 檗碱及二甲双胍)能改善模型大鼠卵巢组织的IR抵抗情况，大鼠卵巢ApoC3表达随之下降， 见图5。
APOC3蛋白：结果显示，与正常组相比，模型组的APOC3蛋白表达量显著上调(P<0.01)， 高、低剂量组可下调APOC3蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。中剂量下调APOC3蛋白表达，但 未显示出显著性差异(P>0.05)。(注：1.正常组；2.阳性药(二甲双胍)组；3.模型组；4.低剂量 小檗碱组；5.中剂量小檗碱组；6.高剂量小檗碱组)。