具体实施方式

本发明提供了用于减轻与干眼症；皮肤护理/皮肤科治疗和伤口愈合相关的疼痛和不适的方法。目前要求保护的方法包括施用HA组合物，该HA组合物包含高浓度的透明质酸(HA)，例如高于约30mg/mL或更高浓度。当以0.1-10Hz的频率测量时，确定这样的组合物具有高弹性，例如高弹性模量G’。特征在于高弹性的HA组合物(例如含有高浓度HA的组合物)在减轻由干眼症；美容治疗；或伤口愈合引起的疼痛和不适方面令人吃惊地有效。不希望受到特定理论的束缚，如由高值弹性模量G’所证实的，据信包含高浓度HA的本发明的HA组合物在治疗疼痛和不适中的效力是由其高弹性所决定的。不希望受到特定理论的束缚，还据信本发明的HA组合物的效力是由HA分子与疼痛传导通道(如TRPV1)具有相对高可能性相互作用，从而降低伤害感受器兴奋性所决定的。在本发明的方法中使用的HA的平均分子量可以是200万或更低，例如约100-200万之间。

I.在本发明的方法中使用的透明质酸组合物

本发明提供了包括向需要其的受试者施用包含透明质酸(HA)的组合物的方法。在一些实施方式中，组合物包含透明质酸，其中透明质酸以高于约30mg/mL(或高于约3重量/体积％)的浓度存在于组合物中；透明质酸具有约100万和约200万之间的平均分子量；以及透明质酸是未交联的和/或基本上不含化学修饰。

例如，组合物中的透明质酸浓度可以是约30mg/mL(或约3％w/v)、约35mg/mL(或约3.5％w/v)、约40mg/mL(或约4％w/v)、约45mg/mL(或约4.5％w/v)、约50mg/mL(或约5％w/v)、约55mg/mL(或约5.5％w/v)、约60mg/mL(或约6％w/v)、约65mg/mL(或约6.5％w/v)、约70mg/mL(或约7％w/v)、约75mg/mL(或约7.5％w/v)、约80mg/mL(或约8％w/v)、约85mg/mL(或约8.5％w/v)、约90mg/mL(或约9％w/v)、约95mg/mL(或约9.5％w/v)、约100mg/mL(或约10％w/v)、约105mg/mL(或约10.5％w/v)、约110mg/mL(或约11％w/v)、约115mg/mL(或约11.5％w/v)、约120mg/mL(或约12％w/v)、约125mg/mL(或约12.5％w/v)、约130mg/mL(或约13％w/v)、约135mg/mL(或约13.5％w/v)、约140mg/mL(或约14％w/v)、约145mg/mL(或约14.5％w/v)或者约150mg/mL(或约15％w/v)。在一个具体实施方式中，HA以约40mg/mL(或约4％w/v)的浓度存在于组合物中。在其他具体实施方式中，HA以约41mg/mL(或约4.1％w/v)、约42mg/mL(或约4.2％w/v)、约43mg/mL(或约4.3％w/v)、约44mg/mL(或约4.4％w/v)、约45mg/mL(或约4.5％w/v)、约46mg/mL(或约4.6％w/v)、约47mg/mL(或约4.7％w/v)、约48mg/mL(或约4.8％w/v)、约49mg/mL(或约4.9％w/v)、约50mg/mL(或约5.0％w/v)、约51mg/mL(或约5.1％w/v)、约52mg/mL(或约5.2％w/v)、约53mg/mL(或约5.3％w/v)、约54mg/mL(或约5.4％w/v)、约55mg/mL(或约5.5％w/v)、约56mg/mL(或约5.6％w/v)、约57mg/mL(或约5.7％w/v)、约58mg/mL(或约5.8％w/v)、约59mg/mL(或约5.9％w/v)或者约60mg/mL(或约6％w/v)的浓度存在于本发明的组合物中。

在一些实例中，组合物中的透明质酸浓度可以高于约30mg/mL(或约3％w/v)，例如高于约31mg/mL(或约3.1％w/v)、高于约32mg/mL(或约3.2％w/v)、高于约33mg/mL(或约3.3％w/v)、高于约34mg/mL(或约3.4％w/v)、高于约35mg/mL(或约3.5％w/v)、高于约36mg/mL(或约3.6％w/v)、高于约37mg/mL(或约3.7％w/v)、高于约38mg/mL(或约3.8％w/v)或者高于约39mg/mL(或约3.9％w/v)。

在一些实例中，组合物中的透明质酸可以具有约100万和约200万之间的平均分子量；例如，约110万和约200万之间、约120万和约200万之间、约130万和约200万之间、约140万和约200万之间、约150万和约200万之间或者约160万和约200万之间。

在某些实施方式中，组合物中使用的透明质酸是未交联的和/或不含化学修饰。例如，组合物中使用的透明质酸未被酰胺化，所述酰胺化可以通过HA的羧基和如在例如EP专利号1095064B1中所述的衍生剂的胺基之间的反应形成。组合物中使用的透明质酸还可以是不含化学修饰和/或未交联的，所述化学修饰和/或交联可能是透明质酸与碳化二亚胺如单碳化二亚胺或双碳化二亚胺反应的结果，如例如美国专利号8,323,617中所述。在一些情况下，组合物中使用的透明质酸还可以不含丙烯酸酯(例如如在美国公开号2010/0048755中所述的甲基丙烯酸酯)；如在例如美国公开号2013/0209531中所述的硫酸酯；以及如在例如美国公开号2015/0148310中所述的氘。

在一些实施方式中，本发明的HA组合物不含其他药学活性物质。如本文中所使用的，“药学活性物质”是能够在受试者(例如，人或动物受试者)中发挥生物学效应的物质。术语“药学活性物质”还包括当向受试者施用组合物时能够调节HA组合物的生物学效应(例如减轻与干眼症；皮肤护理/皮肤科治疗或愈合伤口相关的疼痛和不适)的物质。在某些实施方式中，药学活性物质是蛋白质，例如骨形成蛋白(BMP)如rhGDF-5。在某些实施方式中，药学活性物质是不同于HA的糖胺聚糖(GAG)，例如软骨素。在一些实施方式中，药学活性物质是羟丙基甲基纤维素。在其他实施方式中，药学活性物质是局部麻醉剂如利多卡因或布比卡因。在一些情况下，药学活性物质是嘌呤能受体激动剂，例如P2Y₂受体激动剂。

在某些实施方式中，本发明的HA组合物不含能够清除自由基的分子，如多元醇，例如山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇或异麦芽酮糖醇。在其他实施方式中，在本发明的方法中使用的HA组合物不含降低HA弹性的分子，例如葡聚糖或蔗糖。

在一些情况下，在本发明的方法中使用的HA组合物不含聚二醇，例如聚乙二醇。

HA组合物可以基本上由在生理学缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂或碳酸氢盐缓冲剂)中以高于约30mg/mL(约3％w/v)或约40mg/mL(约4％w/v)浓度存在的HA组成，并且HA具有约100万和约200万之间的平均分子量。例如，在本发明的方法中使用的HA组合物基本上由以约40mg/mL(或约4％w/v)浓度存在的HA组成，并且HA具有约100万和约200万之间的平均分子量。

在本发明的方法中使用的组合物中透明质酸可以具有当以0.5Hz的频率测量时至少100帕斯卡的弹性，或当以0.5Hz的频率测量时至少400帕斯卡的弹性，或当以0.5Hz的频率测量时至少1,000帕斯卡的弹性，或当以0.5Hz的频率测量时至少2,000帕斯卡的弹性，或当以0.5Hz的频率测量时至少4,000帕斯卡的弹性，或当以0.5Hz的频率测量时400和5,000帕斯卡之间的弹性。

应当理解，可以采用多种方法测量生物聚合物如透明质酸的弹性。在一个实施方式中，以特定频率(以赫兹计)下的压力(以帕斯卡计)测量包含透明质酸的组合物的弹性。例如，可以在0.5Hz、2.5Hz或5.0Hz下测量可以用于评估本文提供的透明质酸组合物的弹性的频率。

还应当理解，可以以任何相关的频率表示弹性。因此，例如，在一个实施方式中，基于2.5Hz的频率表示弹性，并且具有高弹性的包含透明质酸的组合物是在2.5Hz的频率下具有至少200Pa弹性的组合物。类似地，在一个实施方式中，基于5.0Hz的频率表示弹性，并且具有高弹性的包含透明质酸的组合物是在5.0Hz的频率下具有至少400Pa弹性的组合物。

在一个实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，用于目前要求保护的方法中的包含透明质酸的组合物具有至少100帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有至少300帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有至少350帕斯卡的弹性。

在另一个实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，包含透明质酸的组合物具有至少400帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有至少750帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有至少900帕斯卡的弹性。

在另一个实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，包含透明质酸的组合物具有至少1000帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有至少1600帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有至少2000帕斯卡的弹性。

在又一个实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，包含透明质酸的组合物具有至少2600帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有至少4000帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有至少4500帕斯卡的弹性。

在一个实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，包含透明质酸的组合物具有至少4000帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有至少5000帕斯卡的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有至少6000帕斯卡的弹性。

在一些实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，组合物具有100和10,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，组合物具有400和5,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在0.5Hz的频率下测量时，组合物具有1,000和2,000帕斯卡之间的弹性。

在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有300和10,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有750和6,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在2.5Hz的频率下测量时，组合物具有1,500和4,000帕斯卡之间的弹性。

在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有300和10,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有900和7,000帕斯卡之间的弹性。在一些实施方式中，当在5.0Hz的频率下测量时，组合物具有2,000和5,000帕斯卡之间的弹性。

在一些实施方式中，可以通过使用适宜的装置(例如，流变仪)来测量弹性。例如，可以通过使用Stresstech高分辨率研究流变仪(Reologica Instruments AB)来测量弹性。通常，在环境温度和压力下测定弹性；然而，应当理解，还可以在非环境温度和/或压力下测量弹性。应当进一步理解，本领域普通技术人员知晓如何将在不同温度和压力下测定的弹性量值换算成在环境温度和压力下的弹性量值。

可以通过增加组合物中透明质酸的浓度来制备透明质酸的高弹性组合物。因此，在一个方面中，目前要求保护的方法利用具有高弹性的组合物，所述组合物包含高百分含量的透明质酸。例如，组合物可以包含至少3.0％的透明质酸(重量比体积)、至少3.5％的透明质酸(重量比体积)、至少4.0％的透明质酸(重量比体积)、至少4.5％的透明质酸(重量比体积)、至少5.0％的透明质酸(重量比体积)、至少5.5％的透明质酸(重量比体积)、至少6.0％的透明质酸(重量比体积)、至少6.5％的透明质酸(重量比体积)、至少7.0％的透明质酸(重量比体积)、至少7.5％的透明质酸(重量比体积)、至少8.0％的透明质酸(重量比体积)、至少8.5％的透明质酸(重量比体积)、至少8.9％的透明质酸(重量比体积)、至少9.0％的透明质酸(重量比体积)、至少10.0％的透明质酸(重量比体积)、至少11.0％的透明质酸(重量比体积)、至少12.0％的透明质酸(重量比体积)、至少13.0％的透明质酸(重量比体积)、至少14.0％的透明质酸(重量比体积)或者至少15.0％或更多的透明质酸(重量比体积)。

所列值的中间范围也旨在包括在用于本发明方法的组合物中。例如，组合物中透明质酸的含量可以在约3％和约15％之间(重量/体积)、约3％和约10％之间(重量/体积)、约3.5％和约9％之间(重量/体积)、约4％和约8％之间(重量/体积)或者约5％和约7％之间(重量/体积)。

应当进一步理解，还可以通过替代方式表示在特定体积中的透明质酸的量(例如，克/升或摩尔/升)。本领域普通技术人员将知晓如何对表示在特定体积中的透明质酸的量的各种方式进行换算。

具有高浓度透明质酸(甚至具有约100-200万的平均分子量)的透明质酸组合物在治疗疼痛(例如与干眼症、美容治疗或愈合伤口相关的疼痛)中特别有效。因此，本文所述的HA组合物中包含的透明质酸可以具有落入100万和200万之间的范围的平均分子量，并且其还小于200万、小于190万、小于180万、小于170万、小于160万、小于150万、小于140万、小于130万、小于120万、小于110万、小于100万、小于90万、小于80万、小于70万、小于60万或者小于50万。在其他情况下，本文所述的HA组合物中包含的透明质酸可以具有落入100万和200万之间的范围的平均分子量，并且其还大于10万、大于20万、大于30万、大于40万、大于50万、大于60万、大于70万、大于80万、大于90万、大于100万、大于110万、大于120万、大于130万、大于140万、大于150万、大于160万、大于170万、大于180万或者大于190万。

所列值的中间范围也旨在是本发明的一部分。例如，在本文提供的透明质酸组合物中，透明质酸的平均分子量是在100万和200万之间、100万和150万之间、50万和100万之间、50万和200万之间或者90万和140万之间。

在本文所述的透明质酸组合物的一些实施方式中，组合物中存在的大部分透明质酸落入了本文所述的平均分子量的范围内。因此，例如，在具有20万和200万之间的透明质酸平均分子量的组合物中，组合物中存在的至少95％的透明质酸落入了20万和2百万之间的范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少50％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少60％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少70％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少80％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少90％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少95％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少98％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少99％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。在一些实施方式中，本文提供的组合物中存在的至少99.9％的透明质酸落入了所述平均分子量范围内。

II.透明质酸的来源

在本文所述的组合物和方法中使用的透明质酸可以从任何来源获得。通常，无论其来源如何(例如，鸡冠、人组织或细菌细胞壁)，透明质酸具有相同的化学结构。可以从例如鸡冠、从细菌细胞壁以及从人组织(脐带、眼玻璃体、关节滑液等)获得透明质酸。在一些实施方式中，透明质酸是从鸡冠中分离的。在一些实施方式中，透明质酸是从人组织(例如，脐带、眼玻璃体、关节滑液)中分离的。在一些实施方式中，透明质酸是从细胞培养物中分离的。在一些实施方式中，透明质酸是从细菌细胞壁中分离的。从不同来源分离透明质酸是本领域普通技术人员所知晓的。例如，在美国专利号4,141,973中描述了从鸡冠中收集和纯化透明质酸，而在美国专利号4,517.295中描述了从细菌来源收集和纯化透明质酸。在一些实施方式中，将透明质酸纯化和收集至pH 6-8的含0.15M NaCl的溶液中。通常，从不同来源获得的透明质酸将不含蛋白质或透明质酸以外的糖胺聚糖。

在一些实施方式中，对分离的透明质酸进行进一步纯化以获得具有所需平均分子量范围的透明质酸(例如通过柱层析)。纯化具有所需平均分子量范围的透明质酸的方法是本领域普通技术人员所知晓的。

在一个方面中，本文公开的具有高弹性的透明质酸是未经修饰的透明质酸。然而，应当理解，在一些实施方式中，透明质酸可以是经化学修饰的。例如，可以对透明质酸进行化学修饰以增加透明质酸的弹性。

III.透明质酸组合物的灭菌

在一些实施方式中，本文所述的和在本发明的方法中使用的HA组合物是无菌的。如本文中所使用的，“无菌组合物”是指可安全地向受试者(例如，人受试者)施用的组合物。因此，无菌组合物将仅具有最少数目的能够导致有害副作用(如有害的组织应答、免疫应答、炎症或感染)的试剂。

用于将透明质酸组合物灭菌的方法是本领域中已知的，并且包括例如，热灭菌或蒸汽灭菌(例如，通过高压灭菌)。在一些实施方式中，通过加热组合物将本发明的HA组合物灭菌。在一些实施方式中，通过将HA组合物加入注射器中，并将含有HA的注射器在131℃下高压灭菌2分钟或在121℃下高压灭菌15分钟，然后立即冷却而将本发明的HA组合物灭菌。

IV.透明质酸组合物的其他组分

本文所述的HA组合物可以包含可以稳定透明质酸和/或使组合物更适于向受试者施用的其他组分。在一些实施方式中，本发明的HA组合物可以包含缓冲剂。加入缓冲剂以确保具有稳定的pH。用于本发明的适宜缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲剂是三磷酸盐缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲剂以1mM和100mM之间、2mM和50mM之间或5mM和20mM之间的浓度存在。在一些实施方式中，缓冲剂的浓度低于1mM。在一些实施方式中，缓冲剂的浓度高于100mM。在一些实施方式中，缓冲剂的浓度是10mM。应当理解，缓冲剂的浓度取决于所使用的缓冲剂的性质。在一些实施方式中，组合物的pH是在pH 7和pH 9之间或pH 7.5和pH 8.5之间。在一些实施方式中，组合物的pH是8.0。在一些实施方式中，组合物的pH是7.5。在一些实施方式中，组合物的pH是8.5。如有需要，可以将酸(如HCL)或碱(如NaOH)加入组合物中以达到所需pH。

例如，HA组合物可以包含缓冲剂，例如生理上相容的缓冲剂，但是不包含任何其他组分。

HA组合物还可以包含稳定化赋形剂，如羧酸或其盐。在一些实施方式中，组合物包含单羧酸和/或其盐。在一些实施方式中，组合物包含葡萄糖酸和/或葡萄糖酸钠。在一些实施方式中，组合物包含二羧酸和/或其盐。在一些实施方式中，组合物包含柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、马来酸、酒石酸和/或其盐。在一些实施方式中，羧酸是柠檬酸钠。在一些实施方式中，组合物包含三羧酸(TCA)和/或其盐。在一些实施方式中，组合物包含次氮基三乙酸和/或次氮基三乙酸钠。在一些实施方式中，组合物包含四羧酸和/或其盐。在一些实施方式中，组合物包含乙二胺四乙酸(EDTA)和/或EDTA钠。在一些实施方式中，组合物包含五羧酸和/或其盐。在一些实施方式中，组合物包含二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和/或DTPA钠。适宜的羧酸包括但不限于柠檬酸盐化合物(如柠檬酸钠)；酒石酸盐化合物、琥珀酸盐化合物和EDTA。Kaushil等在Protein Science 1999 8:222-233和Busby等在Journal ofBiological Chemistry第256卷，第23期12140-1210-12147页中描述了羧酸及其用途。在一些实施方式中，稳定化赋形剂具有50至600mM之间、250至500mM之间或250至350mM之间的浓度。在一些实施方式中，稳定化赋形剂的浓度为300mM、在一些实施方式中，稳定化赋形剂的浓度低于100mM。在一些实施方式中，稳定化赋形剂的浓度高于600mM。

本文所述的HA组合物还可以包含糖(例如，二糖)。可以加入组合物中的二糖包括但不限于蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、右旋糖和葡聚糖。在一些情况下，糖可以以0.5至5％之间(重量/体积)存在。在一些情况下，糖可以以1至2％之间(重量/体积)存在。在一个实施方式中，糖可以以1％存在。在一些实施方式中，糖可以以低于1％(重量/体积)存在。在一些实施方式中，糖可以以高于5％(重量/体积)存在。在一个实施方式中，糖可以是蔗糖或海藻糖，并且以1％(重量/体积)存在。

在一些实施方式中，本文所述的HA组合物可以包含盐。可以用于组合物中的盐包括氯化钠和其他生理上相容的盐。在一些实施方式中，在本文所述的HA组合物中存在的盐浓度为约10mM和约250mM之间、约25mM和约100mM之间、约30mM和约70mM之间、约45mM和约150mM之间、约125mM和约200mM之间、约150mM和约250mM之间或者约190mM和约250mM之间。在一些实施方式中，盐浓度为50mM。在一些实施方式中，盐浓度低于10mM。在一些实施方式中，盐浓度高于250mM。在一个具体实施方式中，盐浓度是在约50mM和约200mM之间。

在一些实施方式中，本发明的HA组合物可以具有正常的渗透压，例如约310mOsm/L。在其他实施方式中，本发明的HA组合物可以具有低于正常渗透压的渗透压，例如低于310mOsm/L。例如，本发明的HA组合物可以具有约20mOsm/L和约500mOsm/L之间的渗透压，例如约150和约310mOsm/L之间、约150和约200mOsm/L之间、约160和约220mOsm/L之间、约180和约250mOsm/L之间、约200和约300mOsm/L之间、约250和约310mOsm/L之间、约290和约310mOsm/L之间、约250和约290mOsm/L之间或者约270和约300mOsm/L之间。在一些实施方式中，本发明的HA组合物的渗透压可以是约150mOsm/L、约155mOsm/L、约160mOsm/L、约165mOsm/L、约170mOsm/L、约175mOsm/L、约180mOsm/L、约185mOsm/L、约190mOsm/L、约195mOsm/L、约200mOsm/L、约205mOsm/L、约210mOsm/L、约215mOsm/L、约220mOsm/L、约225mOsm/L、约230mOsm/L、约235mOsm/L、约240mOsm/L、约245mOsm/L、约250mOsm/L、约255mOsm/L、约260mOsm/L、约265mOsm/L、约270mOsm/L、约275mOsm/L、约280mOsm/L、约285mOsm/L、约290mOsm/L、约295mOsm/L、约300mOsm/L、约305mOsm/L或者约310mOsm/L。在一个具体实施方式中，本发明的HA组合物的渗透压是在约100mOsm/L和约400mOsm/L之间，例如约100mOsm/L、约110mOsm/L、约120mOsm/L、约130mOsm/L、约140mOsm/L或者约150mOsm/L。

在一些实施方式中，本文所述的HA组合物包含一种或多种抗氧剂。抗氧剂是能够通过从溶液中除去自由基而抑制氧化的物质。抗氧剂是本领域普通技术人员熟知的并且包括下述物质，如抗坏血酸、抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸钠或抗坏血酸钙)、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、没食子酸烷基酯、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、连二亚硫酸钠、巯基乙酸钠、甲醛次硫酸钠、生育酚及其衍生物(d-α生育酚、d-α生育酚乙酸酯、d-α生育酚琥珀酸酯、β生育酚、δ生育酚、γ生育酚和d-α生育酚聚氧乙二醇1000琥珀酸酯)、单硫代甘油和亚硫酸钠。此类物质通常以0.01至2.0％的范围添加。

在一些实施方式中，HA组合物可以包含一种或多种等张剂。该术语在本领域中可以与等渗剂互换使用，并且已知其是可以加入组合物中以增加渗透压的化合物，如0.9％氯化钠溶液的渗透压与人细胞外液(如血浆)是等渗的。可以用于HA组合物中的优选的等张剂包括氯化钠、甘露醇、山梨醇、乳糖、右旋糖和甘油。

在一些实施方式中，本发明的HA组合物可以包含一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括但不限于：氯丁醇(0.3-0.9％w/v)、对羟基苯甲酸酯类(0.01-5.0％)、硫柳汞(0.004-0.2％)、苯甲醇(0.5-5％)、苯酚(0.1-1.0％)等。

在一些实施方式中，HA组合物可以包含适于眼用的组分。

在一些实施方式中，HA组合物可以包含一种或多种使组合物注射过程中的有害副作用最小化的组分。

V.用于眼用的透明质酸组合物

本发明提供了通过向受试者的眼部施用含有HA的组合物减轻与干眼症相关的疼痛和不适的方法。

可以在眼用HA组合物中使用多种载体中的任意一种，包括水、水和与水混溶性溶剂(如C1至C7烷醇、植物油或含有0.5至5％无毒水溶性聚合物的矿物油)的混合物、天然产物如明胶、藻酸盐、果胶、西黄耆胶、刺梧桐胶、黄原胶、角叉菜胶、琼脂和阿拉伯胶、淀粉衍生物如淀粉醋酸酯和羟丙基淀粉，以及还有其他合成产品如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚环氧乙烷，优选交联的聚丙烯酸如中性卡波普(Carbopol)，或者这些聚合物的混合物。载体的浓度通常是活性成分浓度的1至100,000倍。

可以包含在眼用HA组合物中的其他成分包括张力增强剂、防腐剂、增溶剂、无毒赋形剂、缓和剂(demulcent)、螯合剂、pH调节剂、助溶剂和增粘剂。

对于调节pH而言，优选调节至生理pH，缓冲剂可为特别有用的。适于向眼部施用的透明质酸组合物的pH应当保持在4.0至8.0的范围内，更优选约4.0至6.0，更优选约6.5至7.8。可以加入适宜的缓冲剂如硼酸、硼酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、碳酸氢钠、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和各种混合的磷酸盐缓冲剂(包括Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄的组合)及其混合物。通常，缓冲剂的用量范围以重量计从约0.05至2.5％，优选从0.1至1.5％。

如有需要，通常通过加入张力增强剂调节张力。此类试剂可以是例如离子型和/或非离子型。离子型张力增强剂的实例包括碱金属或碱土金属卤化物(例如，CaCl₂、KBr、KCl、LiCl、NaI、NaBr或NaCl)、Na₂SO₄或硼酸。非离子型张力增强剂包括例如尿素、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇或右旋糖。可以使用等张剂调节将在本发明的方法中使用的透明质酸组合物的渗透压调节至接近正常泪液的渗透压，其相当于0.9％的氯化钠溶液或2.5％的甘油溶液。在一些实例中，约100mOsm/L和约150mOsm/L之间的渗透压是优选的，例如100mOsm/L、110mOsm/L、120mOsm/L、120mOsm/L、130mOsm/L、140mOsm/L或150mOsm/L。在其他实例中，约225和400mOsm/L之间的渗透压是优选的，例如约280和约320mOsm/L之间或者约297和约318mOsm/L之间。在一些情况下，平均渗透压可以在约303.7和约306.7mOsm/L之间波动。

在某些实施方式中，眼用HA组合物还可以包含防腐剂。防腐剂通常可以选自季铵化合物如苯扎氯铵(N-苄基-N-(C8-C18烷基)-N,N-二甲基氯化铵)、苯佐氯铵等。其他适宜防腐剂的实例包括硫代水杨酸的烷基汞盐，例如硫柳汞；硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞；过硼酸钠；亚氯酸钠；对羟基苯甲酸酯类，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；醇类，例如氯丁醇、苯甲醇或苯乙醇；胍衍生物，例如氯己定或聚六亚甲基双胍；咪唑烷基脲(杰马TM)或山梨酸。优选的防腐剂是季铵化合物，特别是苯扎氯铵或其衍生物如Polyquad(参见美国专利号4,407,791)、烷基汞盐和对羟基苯甲酸酯类。在适当情况下，将足量防腐剂加入眼用组合物中以确保防止在使用期间出现由细菌和真菌引起的二次污染。

在另一个实施方式中，眼用HA组合物不包含防腐剂。此类组合物将有用于佩戴隐形眼镜的患者，或者使用几种局部滴眼剂和/或眼表面已经受损(例如，干眼)的那些患者，其中限制暴露于防腐剂可能是更理想的。

眼用HA组合物还可能另外需要存在增溶剂，特别是如果活性成分或非活性成分趋向于形成混悬液或乳液。适用于在本发明的方法中使用的透明质酸组合物的增溶剂包括例如泰洛沙泊、脂肪酸甘油聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇酯、聚乙二醇、甘油醚、环糊精(例如，α-、β-或γ-环糊精，例如烷基化的、羟烷基化的、羧烷基化的或烷氧基羰基-烷基化的衍生物，或者单-或二糖基-α-、β-或γ-环糊精，单-或二麦芽糖基-α-、β-或γ-环糊精或潘糖基(panosyl)-环糊精)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或者这些化合物的混合物。优选的增溶剂可以是蓖麻油和环氧乙烷的反应产物，例如市售产品Cremophor或Cremophor已证实蓖麻油和环氧乙烷的反应产物是特别好的增溶剂，眼睛对其具有特别好的耐受性。另一种优选的增溶剂可以是泰洛沙泊或环糊精。所使用的浓度特别地取决于组合物中透明质酸的浓度。所加入的量通常足以将组合物中的透明质酸溶解。例如，增溶剂的浓度是组合物中透明质酸浓度的0.1至5000倍。

眼用HA组合物还可以进一步包含无毒赋形剂，例如，乳化剂、润湿剂或填充剂，例如，聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400和聚乙二醇600，或者碳蜡(Carbowax)1000、碳蜡1500、碳蜡4000、碳蜡6000和碳蜡10000。所加入的赋形剂的量和类型是根据特定的需求，并且其通常是在以重量计从约0.0001％至约90％的范围内。

还可以将其他化合物加入本发明的制剂中以增加载体的粘度。粘度增强剂的实例包括但不限于多糖如硫酸软骨素及其盐、葡聚糖、各种纤维素家族的聚合物；乙烯基聚合物；以及丙烯酸聚合物。

在一个实施方式中，除了HA以外，拟供眼用的透明质酸组合物可以包含通常存在于眼用组合物中的其他成分。此类组分的实例可以包括其他活性成分，包括但不限于血管收缩剂、抗过敏剂、抗感染剂、类固醇、麻醉剂、抗炎剂、镇痛剂、干眼剂(例如，促分泌素、类粘液状物(mucomimetic)、聚合物、脂质、抗氧剂)，或者与包含其他活性成分的组合物联合施用(同时或顺序)，其他活性成分包括但不限于血管收缩剂、抗过敏剂、抗感染剂、类固醇、麻醉剂、抗炎剂、镇痛剂或干眼剂(例如，促分泌素、类粘液状物、聚合物、脂质、抗氧剂)。

在一些实施方式中，向受试者的眼表面施用本发明的透明质酸组合物，如受试者的眼睑下方(例如，上眼睑或下眼睑的下方)或在受试者的角膜-眼睑界面处。在一些实施方式中，本发明的透明质酸组合物不适于作为或不用作眼科手术过程中的粘弹性手术工具或装置，即其在眼科手术过程中不适于注射或者不注射入眼部。

在一个实例中，在即将休息或睡眠之前向受试者施用本发明的透明质酸组合物。

VI.用于皮肤护理/皮肤科使用的透明质酸组合物

本发明还提供了通过施用包含HA的组合物在需要其的受试者中减轻疼痛和不适，同时将至少一种皮肤瑕疵最小化的方法。除了HA以外，拟供皮肤护理/皮肤科使用的此类HA组合物可以包含通常存在于此类组合物(例如，用作皮肤填充物的组合物)中的其他成分。此类成分可以包括例如胶原、肉毒碱、维生素E、维生素A和硫酸软骨素。

在一些实施方式中，将用于皮肤护理/皮肤科使用的HA组合物注射入皮肤。因此，可以以使用HA组合物填充的容器的形式将其制剂，例如预充式注射器。可以将本领域技术人员已知的任何预充式注射器与本发明的组合物联用。在例如PCT公开WO05032627、WO08094984、WO9945985、WO03077976，美国专利US6792743、US5607400、US5893842、US7081107、US7041087、US5989227、US6807797、US6142976、US5899889，美国专利公开US20070161961A1、US20050075611A1、US20070092487A1、US20040267194A1或US20060129108A1中描述了可以使用的预充式注射器。预充式注射器可以由各种材料制成。在一个实施方式中，预充式注射器是玻璃注射器。在另一个实施方式中，预充式注射器是塑料注射器。本领域技术人员将会理解，用于生产注射器的材料的性质和/或质量可能会影响储存在注射器中的HA组合物的稳定性。在一个实施方式中，预充式注射剂包含基于硅酮的润滑剂。在一个实施方式中，预充式注射器包含焙制(baked-on)硅酮。在另一个实施方式中，预充式注射器不含基于硅酮的润滑剂。本领域技术人员还将理解，从注射器筒、注射器尖端帽、针栓或塞子浸入制剂中的少量污染成分也可能会影响组合物的稳定性。例如，应当理解的是，在生产过程中引入的钨可能会对制剂的稳定性造成不利影响。在一个实施方式中，预充式注射器可以包含水平高于500ppb的钨。在另一个实施方式中，预充式注射器是低钨注射器。在另一个实施方式中，预充式注射器可以包含水平在约500ppb和约10ppb之间、约400ppb和约10ppb之间、约300ppb和约10ppb之间、约200ppb和约10ppb之间、约100ppb和约10ppb之间、约50ppb和约10ppb之间、约25ppb和约10ppb之间的钨。

VII.用于伤口愈合的透明质酸组合物

本发明还提供了用于在需要其的受试者中减轻疼痛和不适，同时促进伤口愈合的方法。除了HA以外，用于局部使用的此类HA组合物可以包含通常在此类组合物中使用的其他成分。此类成分可以包括例如1,3-丁二醇、甘油、黄原胶、硫酸软骨素钠、乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯、癸基十四烷基醚、柠檬酸钠、依地酸钠和维生素(例如，维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K)。此类成分还可以包括其他药学活性物质。在一些情况下，这些其他药学活性物质不包括用于治疗疼痛的镇痛剂。在其他情况下，这些药学活性物质包括抗生素，例如通常用于治疗皮肤感染且拟供局部使用的抗生素。

在本文所公开的方法中使用的HA组合物还包括制成成品的、包装的和带标签的药物产品。该制品包括在适当的器皿或容器(如玻璃药瓶、预充式注射器或密封的其他容器)中的适当的单位剂型。在一个实施方式中，单位剂型以无菌无颗粒HA组合物的形式提供，其适于向受试者(例如，受试者的面部、颈部、手臂、腿部或背部)进行胃肠外施用(例如，皮内或皮下施用)。

与任何药物产品一样，对包装材料和容器进行设计以保护产品在储存和运输过程中的稳定性。此外，本发明的产品包括使用说明或其他信息材料，其针对如何适当地预防或治疗考虑中的疾病或病症，以及如何和以何种频率施用HA组合物向医师、技术人员或患者提出建议。换言之，制品包括指示或建议给药方案的说明手段，给药方案包括但不限于实际剂量、监测程序和其他监测信息。

VIII.用于减轻与干眼相关的疼痛和不适的方法

干眼病是一种影响约10-20％人群的眼部疾病。其可能与病理状况有关，如白内障或自身免疫性疾病，或者在没有病理状况的情况下，可能在某些情况下出现，如长时间用眼、在电脑上工作、处于干燥的环境中、使用隐形眼镜或者暴露于导致眼表面干燥的药物。

在患有干眼症的个体中，导致眨眼的反射和支持性泪液物质的分泌受损。干眼的体征和症状包括眼干涩；泪液产生、体积和流量减少；泪液组成异常；泪液渗透压增加；角膜炎；结膜和角膜染色；泛红；视力模糊；泪膜破裂时间缩短；结膜泛红加重；泪膜中碎片过多、眼部砂粒感；眼部灼烧；眼部异物感；过多流泪；畏光；眼部刺痛；屈光不正；眼部敏感；长期佩戴隐形眼镜导致的眼部刺激和不适。过多流泪应答可能似乎是违反直觉的，但是其是对由干眼所导致的刺激和异物感的自然反射应答。一些个体还可能出现由眼部过敏和干眼症状联合引起的眼部瘙痒。

还有很多可能影响人干眼症状的变量，包括循环激素水平、多种自身免疫性疾病(例如，斯耶格伦氏综合征和系统性红斑狼疮)、包括PRK或LASIK在内的眼部手术、多种药物、环境状况、用眼(如使用电脑)、眼疲劳、佩戴隐形眼镜和机械影响(如角膜敏感性、部分眼睑闭合、表面不平整(例如，翼状胬肉)和眼睑不平整(例如，眼睑下垂、睑内翻/睑外翻、结膜黄斑)。具有较低湿度的环境(例如，导致脱水的那些环境)可能会加剧或导致干眼症状，如坐在带有除霜器的飞机或汽车中或者生活在干燥气候带。此外，用眼也会加剧症状。能够极大地影响症状的用眼包括长时间看电视或使用电脑，此时眨眼率降低。

此前已将含有HA的组合物用于治疗干眼症。含有HA的滴眼液是市售的并且通常含有浓度低于1％的HA。示例性的含有HA的市售滴眼液包括Opticalm滴眼液(0.2％HA)；Aquify舒适滴剂(0.1％HA)；Blink(0.15％HA)；Hyal滴剂(0.2％HA)；Hycosan(0.1％HA)；Oxyal(0.15％HA)和Vismed(0.18％和0.8％HA)。

申请人令人惊奇地发现，可以向受试者的眼部有效施用包含浓度高于约30mg/mL(或3％HA)(例如，40mg/mL(或4％HA))的HA的高度浓缩HA组合物以用于治疗干眼症。此前未使用此类高浓缩HA组合物用于治疗干眼，因为认为这些组合物过于粘稠而无法有效地向眼部施用。

申请人还令人惊奇地发现，一旦施用于眼部，浓缩的HA组合物在治疗与干眼症相关的疼痛和不适方面令人惊奇地有效。不希望受到特定理论的束缚，据信与干眼症相关的疼痛可能受到伤害感受器TRPV1通道的调控，而高浓缩HA组合物中的HA分子与存在于眼感觉神经和角膜细胞上的TRPV1通道相互作用，从而降低了伤害感受器对有害刺激的应答。因此，在一些实施方式中，与干眼症相关的疼痛和不适被受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道所调控。而且，浓缩HA的特征性弹粘性性质减少了施用于眼表面上的溶液通过正常流泪和眨眼的除去，从而延长了HA溶液的保护作用。

本发明提供了一种用于在需要其的受试者中减轻与干眼症相关的疼痛和不适的方法，其包括向受试者的眼部施用包含透明质酸的组合物，其中透明质酸以高于约30mg/mL的浓度存在于组合物中；透明质酸具有约100万和约200万之间的平均分子量；以及透明质酸是未交联的和/或基本上不含化学修饰，从而在所述受试者中减轻所述疼痛和不适。

在一些情况下，拟供眼用的HA组合物是凝胶、软膏、擦剂、洗剂或乳膏形式。在某些方面中，该HA组合物不是透镜或微球形式。

拟供眼用的HA组合物可以向眼表面施用，如在眼睑下(例如，在上眼睑或下眼睑的下方)或在角膜-眼睑界面处。在一个方面中，不将HA组合物注射入受试者眼内。由于其具有较高粘度，使得在施用HA组合物后即刻受试者看清的能力可能会受到影响，因而可以在即将休息或睡眠之前向受试者的眼部施用这些组合物。

本领域普通技术人员将能够确定本文所述眼用HA组合物的适宜施用方案，以实现与干眼症相关的疼痛和不适的减轻。例如，可以每天施用HA组合物持续约3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月等，或者持续任意长度的时间直至实现与干眼症相关的疼痛和不适的减轻。在一些实施方式中，这样的疼痛和不适的减轻可以是长期减轻，例如持续约12小时、约24小时、约1天、约3天、约5天、约7天、约14天或者约28天。

术语“干眼症”包括但不限于与一种或多种选自下组的症状相关的干眼症：眼干涩；泪膜破裂时间缩短；泪液产生、体积和流量减少；泪液组成异常；泪液渗透压增加；角膜炎；结膜和角膜染色；泛红；视力模糊；结膜泛红加重；泪膜中碎片过多、眼部砂粒感；眼部灼烧；眼部异物感；过多流泪；畏光；眼部刺痛；屈光不正；眼部敏感；长期佩戴隐形眼镜导致的眼部刺激和不适。

干眼症还可能与选自下组的状况相关：自身免疫性疾病；眼部手术；摄入药物；干燥的环境条件；长时间使用电脑；眼疲劳；佩戴隐形眼镜，角膜敏感；部分眼睑闭合；表面不平整；眼睑不平整；以及与神经性疼痛相关的病况(如白内障或视网膜脱离)。在一个实例中，干眼症可能与眼部手术相关，如屈光手术(如屈光性角膜切削术(PRK))、白内障手术、视网膜脱离手术、激光原位角膜磨镶术(LASIK)或者涉及角膜感觉神经损伤的任何角膜手术操作。

IX.用于减轻疼痛和不适同时将皮肤瑕疵最小化的方法

HA是细胞外基质(ECM)的主要组分，并且在软结缔组织(如皮肤)中以特别大的量存在。在正常皮肤中，HA主要由真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞合成。利用其带有负电荷的残基，HA用作保持皮肤的水合和弹性的水泵。HA在控制食物、激素、微生物和无机盐在结缔组织中的分布以及清除可能诱导炎症反应的代谢废物方面具有主要作用。随着年龄的增长，HA的量及其聚合程度降低，导致结缔组织中保留的水量减少。然后，皮肤经历老化过程，使得纤维化增加和弹性纤维的质量下降。

HA已广泛用于化妆品应用中，其包括将HA组合物以乳膏或凝胶形式用于局部应用的用途和将HA组合物作为皮肤填充物注射入皮肤的用途。后一种用途涉及将HA组合物注射入受试者的顶部皮肤层中，例如受试者的面部、颈部、手臂、腿部、躯干或胸部。该用途由于对因皱纹导致的皮肤凹陷具有机械填充作用，以及由于对皮肤衰老和对维持皮肤弹性和坚度的机械性质而言必要的ECM的降解具有预防作用而使得皱纹减少。

尽管用于软组织扩增的皮肤填充物的注射是微创皮肤科操作，但是患者通常会表现出对于与这样的操作相关的疼痛的关注。通常使用局部麻醉膏减轻在这些操作过程中的疼痛，以及还可以将麻醉剂包含在用于注射的HA组合物中。

本发明避免了在这些操作过程中使用麻醉剂的需求。具体而言，本发明提供了通过向受试者施用高浓缩HA组合物而用于在需要其的受试者中减轻与皮肤科操作相关的疼痛和不适，同时将至少一种皮肤瑕疵最小化的方法。如上所述，令人惊奇地发现，本文所述的高浓缩HA组合物在治疗与皮肤科操作(其可以包括，例如注射入受试者的皮肤)相关的疼痛和不适方面令人惊奇地有效。不希望受到特定理论的束缚，据信与将HA组合物注射入皮肤相关的疼痛可受到伤害感受器的TRPV1通道的调节，而高浓缩HA组合物中的HA分子与在皮肤和皮下组织的感觉神经以及上皮和结缔组织细胞中存在的TRPV1通道相互作用，从而降低了伤害感受器对有害刺激的应答。

在一些实施方式中，可以使用注射装置(如针、套管针、套管或灌注装置)通过注射(例如，皮下或皮内注射)向需要其的受试者施用用于美容用途的HA组合物。适于注射本发明的HA组合物的注射装置可以具有2.11mm或更大的标称直径(对应于14G针头，或者14号或更大的针规)。在一些实施方式中，本发明的HA组合物可能过粘而无法使用更小的针头(例如标称直径小于2.11mm的针头)施用。在其他实施方式中，本发明的HA组合物可以允许使用具有小于2.11mm的标称直径的更小的注射装置施用。

例如，适于注射本发明的HA组合物的装置(如注射器)可以具有约0.31mm、0.34mm,、0.36mm、0.41mm、0.474mm、0.46mm、0.49mm、0.515mm、0.51mm、0.54mm、0.57mm、0.59mm、0.642mm、0.64mm、0.67mm、0.718mm、0.72mm、0.77mm、0.82mm、0.87mm、0.91mm、约0.99mm、约1.07mm、约1.17mm、约1.27mm、约1.42mm、约1.47mm、约1.57mm、约1.65mm、约1.73mm、约1.83mm、约1.98mm、约2.11mm、约2.26mm、约2.41mm、约2.54mm或者2.77mm的标称直径，其分别对应于30、29、28、27、26s、26、25.5、25s、25、24.5、24、23.5、23s、23、22.5、22s、22、21.5、21、20.5、20、19.5、19、18.5、18、17.5、17、16.5、16、15.5、15、14.5、14、13.5、13、12.5或12号规格(或者30G、29G、28G、27G、26sG、26G、25.5G、25sG、25G、24.5G、24G、23.5G、23sG、23G、22.5G、22sG、22G、21.5G、21G、20.5G、20G、19.5G、19G、18.5G、18G、17.5G、17G、16.5G、16G、15.5G、15G、14.5G、14G、13.5G、13G、12.5G或12G针头)。在一个实施方式中，可以使用具有约1.27mm的标称直径的18G注射器针头施用本发明的HA组合物。在一些实施方式中，本发明的HA组合物可能过粘而无法使用更小的针头(例如标称直径小于1.27mm的针头)施用。

在一些实施方式中，本发明的方法还可以包括以可注射植入物(特别是皮肤植入物)的形式向受试者施用高浓缩HA组合物。

根据本发明的组合物特别地旨在用于在人或动物的重建或整形手术或美容皮肤学中用于填充皱纹、细纹、皮肤凹陷和疤痕，包括填充由脂肪代谢障碍或脂肪萎缩引起的皮肤凹陷。组合物可以是如上定义的植入物。

X.用于减轻疼痛和不适同时促进伤口愈合的方法

皮肤提供了对于外部环境的机械屏障，并起到了阻止感染剂进入的作用。一旦受伤，下面的组织将暴露于感染；因此，迅速而有效的愈合对于重建屏障功能具有至关重要的意义。成人中的皮肤伤口愈合是一个复杂的过程，并且包括多个阶段，如炎症、肉芽组织形成、再上皮化和重塑。HA可能在这些细胞和基质事件的介导中发挥多方面的作用。通常，向伤口施用局部麻醉剂以减轻与这些伤口相关的疼痛。

本发明提供了用于有效治疗皮肤伤口，同时提供疼痛缓解并且避免使用局部麻醉剂的需求的方法。具体而言，本发明提供了通过向需要其的受试者施用高浓缩HA组合物而用于减轻疼痛和不适，同时促进伤口愈合的方法。如上所述，令人惊奇地发现，本文所述的高浓缩HA组合物在治疗与伤口愈合相关的疼痛和不适方面令人惊奇地有效。不希望受到特定理论的束缚，据信与将HA组合物注射入皮肤相关的疼痛可能受到伤害感受器的TRPV1通道的调节，而高浓缩HA组合物中的HA分子与神经支配创伤区域的感觉神经中和该区域的结缔组织细胞中存在的TRPV1通道相互作用，从而降低了伤害感受器对有害刺激的应答。

根据本发明的方法，拟用于向皮肤伤口局部施用的高浓缩HA组合物可以在皮肤上的伤口或疤痕表面上局部施用。组合物可以是含水凝胶或多元醇形式，其含有增稠聚合物(如纤维素衍生物或丙烯酸聚合物)连同常规使用的其他赋形剂(如防腐剂、香料等)。

当疾病状态或病理状况(例如，与干眼症、皮肤护理/皮肤科操作或伤口愈合相关的疼痛和不适)的一个或多个参数存在具有统计学上显著的改善时，治疗、预防或减轻作用是明显的。如果未出现预期将出现的恶化或将发展的症状，则治疗、或减轻或预防作用也是明显的。例如，疾病或病况(例如，疼痛和不适)的可测量参数的至少10％(以及优选至少20％、30％、40％、50％或更多)的有利变化可以表明有效的治疗。如本文所使用的，术语“预防”包括例如在此前经历过疼痛的受试者中预防疼痛和不适的再次发生。

在一些实施方式中，受试者是人、哺乳动物，例如家养动物(如猫或狗)、农场动物(如奶牛、绵羊、马、驴)或啮齿动物(如豚鼠、小鼠或大鼠)。在一个具体实施方式中，受试者是人。在另一个具体实施方式中，受试者是狗。

如本文所使用的，术语“减少至少一种症状”包括减少、减轻或消除与疼痛和不适相关的至少一种症状。该术语还包括在施用本发明的HA组合物后降低参与神经元中疼痛转导过程的离子通道(如TRPV1通道)的活化程度。可以测量在施用本发明的HA组合物后此类通道的活化情况，例如通过测量伤害性刺激后神经元中细胞内Ca²⁺的变化，或通过测量神经元中的全细胞电流。此外，术语“减少至少一种症状”还包括在施用本发明的HA组合物后减少神经元的伤害性放电。

在一些实施方式中，减少与干眼症、皮肤护理/皮肤科操作或伤口愈合相关的疼痛和不适的方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。如本文所使用的，术语“治疗有效量”旨在包括当向需要其的受试者施用时足以治疗、预防、减少或减轻疼痛和不适的本发明HA组合物的量。本领域普通技术人员(例如，医师)将能够容易地确定将是治疗有效的HA组合物的量。通常，组合物的治疗有效量是在约0.1至约500mg之间，例如约0.1mg、约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg或者约500mg。

本文所公开的方法包含多种治疗方案。例如，受试者可以接受第一剂量的本文公开的HA组合物，随后再接受其他剂量。在一些实施方式中，施用第一剂量，随后再以特定间隔施用第二剂量。在一些实施方式中，在第一剂量后约30天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天、约210天、约240天、约270天、约300天、约330天或者约360天施用第二剂量。应当理解，可以基于受试者所经历的疼痛和不适的减轻情况调整给药方案。在一些实施方式中，受试者将每个月、每两个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或者每12个月接受一剂。

通过下述实施例对本发明进行进一步说明，绝不应将其解释为进一步的限制。本申请通篇引用的所有参考资料(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同待审的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入本文。

实施例

除非另有规定，否则在本文所述的组合物中使用的透明质酸(HA)是从动物、人或细菌来源获得的。除非另有规定，否则本文使用的组合物是在生理缓冲剂中。

实施例1：通过在角膜上局部施用4％透明质酸钠减少角膜感觉神经纤维中的脉冲活动

伤害感受器的激发是产生疼痛感觉的第一步。对于急性疼痛而言，疼痛感觉的程度与痛觉纤维的放电频率和刺激所募集的纤维数量密切相关(Acosta等，2001,J.Physiol.534(2),511-525)。此外，外周损伤后的持续性疼痛与伤害感受器的持续活动相关(Belmonte等，2004,Ocular Surface,2,248-253)。

在角膜神经中感觉神经脉冲活动增加是产生眼部不适和疼痛感觉的第一步。在眼表面中神经，通过神经支配角膜和结膜的多觉型伤害感受器和机械-伤害感受器检测伤害性刺激(Belmonte&Giraldez,1981,J.Physiol.,437,709-725；Gallar等，1993,J.Physiol.,468,609-622)。当发生炎症时，多觉型伤害感受器变得敏感并持续放电，引起持续的疼痛感。另一方面，已发现角膜冷热感受器中的活动与眼表面蒸发相关，并且还可能有助于感觉到眼表面干涩的感觉(Gallar等，1993,J.Physiol.,468,609-622；Parra等，2010,Nature Medicine,16,1396-1399；Kovacs等，2016,Pain,157,399-417)。

下文所述的实验目的是检测浓度为4％(4％HA)且平均分子量为100万-200万的透明质酸改变神经支配豚鼠角膜的感觉受体纤维(机械-伤害感受器、多觉型伤害感受器、冷热感受器)中自发和刺激激发的神经脉冲放电的能力。

产生角膜多觉型伤害感受器的化学刺激的一种有效手段是应用98.5％CO₂，由于通过局部形成碳酸而引起酸化(Chen等，1995，Eur.J.Neurosci.7,1154-1163)。已经证明，向人角膜应用类似的CO₂脉冲在所有情况下均能立即引起锐痛感(Chen等，1995,Eur.J.Neurosci.7,1154-1163；Acosta等，2001，J.Physiol.534(2),511-525)。由于在神经末梢周围快速形成质子，因而H⁺的刺激作用可能是直接的，并且通过活化使神经去极化的质子门控离子通道而发生，其可能是“辣椒素通道”TRPV1和/或ASIC通道。而且，受CO₂刺激的角膜上皮细胞中胞内pH降低还可能导致炎性介质(例如，前列腺素)的形成和释放，其可能使角膜多觉型伤害感受器敏化，引起背景放电并增强针对酸性刺激的脉冲应答。

在角膜冷热感受器的情况下，这些纤维在基础角膜温度34℃下显示出背景、规律的脉冲活动，并且随着非常小的温度降低(例如，在泪液蒸发期间出现的温度降低)增加其放电频率(Belmonte等，2015,Curr.Ophthalmol.Rep.3,111-121)。

方法

在实验中使用体重为200-300g的两种性别的顿金哈德莱(Dunkin Hartley)豚鼠。研究是根据NIH实验动物护理和使用指南和欧盟指令(2010/63/EU)以及西班牙关于研究用动物保护的法规进行的，并依照由米格尔·埃尔南德斯大学伦理委员会批准和监督的方案进行。

电生理记录

记录不同功能类型外周角膜受体的脉冲活动。为了实现这一目的，采用腹腔注射100mg/kg戊巴比妥钠将动物安乐死，立即摘除双眼连带球结膜和睑板结膜以及视神经和睫状神经，并将其置于冷盐水(4℃)中。

从切离的眼球上小心地移除结缔组织和眼外肌以暴露带有视神经周围睫状神经的眼后部。然后将眼放入专门设计的双腔室中，以保持带有结膜的眼球前段与背极和睫状神经分开。在室前部中，将结膜钉固在隔板上，以便将分别灌注的两个室隔离。用温(34℃)盐水灌注前室，在上角膜巩膜边界上连续滴下。在充满温矿物油的隔室的后室中，将神经丝与睫状神经分离并置于Ag-AgCl电极上，以使用常规电生理设备单极记录单一单位脉冲活动。在后室中对于Ag/AgCl颗粒(pellet)记录电信号。将电信号转移至带有CED接口的PC，并使用适当的软件进行分析。在任何预期刺激之前，记录所选单位的自发活动1分钟。随后使用经校正的von Frey纤毛机械刺激针(范围0.25-4.00mN)确定机械阈值。利用使用细涂刷进行的机械刺激对角膜传入纤维的感受野进行定位并且随后使用阈上von Frey纤毛机械刺激针绘图。对于化学刺激而言，在角膜感受野上施用含98.5％CO₂的喷射气体30秒。通过使用定制的Peltier装置冷却(降至20℃)灌注溶液进行热刺激。

数据分析

在多觉型纤维的单纤维记录中，对根据其刺激形式、幅度和形状区分的单个单元的脉冲放电进行分析。以在开始记录时30秒期间和刺激间期期间测量的平均脉冲频率(以脉冲/秒计)表示持续的脉冲活动。测量下述参数对针对CO₂的应答进行定量：潜伏期：在CO₂脉冲开始与由单位给予的第一个脉冲之间的时间延迟；平均放电率：在整个CO₂脉冲中的平均每秒脉冲数(脉冲/秒)；后放电：在CO₂脉冲后即刻30秒期间的平均放电频率(脉冲/秒)。

在冷神经纤维记录中，计算下述附加放电模式参数：平均放电频率：每秒记录的平均脉冲数(脉冲/秒)；冷却阈值：基础温度下获得平均神经脉冲频率的25％增加的冷却斜坡期间的温度；峰应答：在冷却斜坡期间脉冲频率的最大脉冲/秒值；峰应答时的温度：达到峰频率时的温度值(℃)。

实验方案

遵循以下实验顺序：

多觉型痛觉纤维的鉴定

对神经支配角膜并响应采用施加于角膜表面的湿细刷的机械刺激的含丝纤维进行鉴定。在将神经丝分开以后，通过机械刺激对单个角膜伤害性单位进行定位。为了对每个分离的单个单元进行进一步表征(确定多觉型)，进行下述程序：

1.采用von Frey丝绘制感受野边界和确定机械阈值；

2.测量对98.5％CO₂的30秒脉冲的应答。如果未检测到应答，则考察新的纤维。

4％HA对多觉型伤害感受器的作用

将4％HA溶液施用于角膜表面上。定期向角膜滴1滴盐水以保持湿度。滴注4％HA后，在连续的时间(施用4％HA后5、20、35、50、65和80分钟)向角膜表面施用30秒CO₂脉冲。然后使用盐水持续洗涤角膜5分钟，并在洗涤后15分钟和20分钟测量对CO₂的应答。在方案结束时测量电阈值以确证纤维的应答性。测量在整个实验操作过程中存在的自发活动以及对CO₂刺激脉冲应答的幅度。

冷热敏感性纤维的鉴定

通过在角膜上施用一滴冷盐水鉴定含有神经支配角膜的冷热敏感性纤维的丝。在将纤维分开以后，使用施用在角膜上的冰冷金属棒(尖端直径为1mm)对含有单个角膜冷单位的丝进行定位以绘制感受野。

记录在34℃下由单个冷敏感性神经末梢所显示出的持续脉冲活动。通过使用Peltier装置改变感受野的温度进行从34℃至15℃的冷却斜坡。

4％HA对冷热感受器神经活动的作用

将4％HA施用于暴露在隔室的前室中的眼表面上，在施用HA后5、20、35、50、65和80分钟以及对角膜进行洗涤后15和20分钟考察对34℃下冷热感受器持续活动的影响以及对冷却斜坡的应答。

确定静息温度34℃下的平均持续活动、热阈值以及在冷却斜坡期间神经脉冲活动的增加。

结果

在完整角膜中，被鉴定为多觉型伤害感受器纤维的感觉传入部分呈现出的角膜感受野通常延伸至多达进入邻近巩膜1mm。多觉型伤害感受器纤维在静息时是沉默的，对机械刺激以及对98.5％CO₂产生应答。

在2个单个多觉型单元和2个冷敏感性单元中测量了4％HA对于持续活动和针对CO₂的放电应答的作用。分析了在向角膜表面应用4％HA前后CO₂的作用。如下表1中所示，多觉型伤害感受器在静息时是沉默的，在2分钟记录时段期间无持续活动。它们对于30秒的CO₂脉冲产生2.5秒应答，平均脉冲放电频率为每秒约6次脉冲。在将4％HA施用于角膜上之后的前35分钟期间，对CO₂的应答出现显著降低，并在之后停止。在4％HA处理80分钟后的洗涤逐渐恢复了对CO₂的应答。

表1：角膜多觉型伤害感受器的持续活动、CO₂应答和后放电值以每秒脉冲数表示；潜伏期以秒表示。对于冷热感受器而言，自发活动、冷却斜坡应答和峰频率值以每秒脉冲数表示。阈值和在峰频率下的温度以℃表示；n.r.：无脉冲活动。

还记录了冷热感受器纤维中的脉冲活动，其代表了所有角膜感觉传入部分的约10％。我们证实了在完整的眼中在34 ℃时的正常持续脉冲活动以及由15℃冷却脉冲导致的显著频率增加，这是眼冷热感受器的特征(Gallar等，1993,J.Physiol.,468,609-622；Parra等，2010,Nature Medicine,16,1396-1399)。

如表1中所示，在34℃时，将角膜暴露于4％HA 4小时降低了冷热感受器的背景持续活动。未观察到冷阈值的明显变化，但是亦如表1中所示，对冷却斜坡的应答显著降低，并且在洗涤后20分钟仅部分恢复，而在此期间由冷却斜坡激发的峰频率值返回至正常值。

总之，这些结果表明4％HA减少了由对角膜的酸刺激所导致的多觉型伤害感受器纤维中的异常脉冲活动。这可能是HA分子与使伤害性神经末梢敏化的TRPV1通道相互作用的结果(Caires等，2015,Nat.Comm.6,8095)，证明高浓度HA在诱发这种作用方面是非常有效的。而且，冷热感受器中的活动减少，可能是由于与较低浓度的HA溶液相比在角膜表面形成了更有效的屏障。

实施例2：通过不同针头尺寸排出HA所需的力

对从带有不同直径针头(30-18G)的3mL注射器中排出4％HA组合物所需的压力进行测量，并在图1中示出。由两板平衡的一个板施加力，将其垂直作用于注射器的针栓上。将增加量级的重量加至对侧板。如图1中示出的结果所证明的，可以使用直径为30-18G的针头向受试者施用本发明的HA组合物。

等同物

认为前述撰写的说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明的范围不受所提供的实施例的限制，因为这些实施例旨在作为本发明的一个方面的单一说明，并且其他功能等同的实施方式是在本发明的范围内。除了本文所示和所述的那些以外，对本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是从前面的描述中显而易见的，并且其落入所附权利要求的范围内。本发明的优点和目的并不一定包含在本发明的每个实施方式中。