具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本申请作进一步地详细说明。

在以下描述中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”、“示例”等等的引用表明如此描述的实施例或示例可以包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度，但并非每个实施例或示例都必然包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度。另外，重复使用短语“根据本申请的一个实施例”虽然有可能是指代相同实施例，但并非必然指代相同的实施例。

为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。

根据本申请的一个实施例，提供一种微量冷冻组织ATAC-seq测序文库的构建方法，包括如下步骤：

S1：进行研磨组织，制备细胞悬液并提取细胞核的步骤；

S2：进行转座及纯化的步骤；

S3：进行PCR富集，并构建文库及片段筛选的步骤；

S4：进行文库质检的步骤。

上述步骤的具体介绍如下：

步骤S1的方法为：将微量冷冻组织(约3-5mg)迅速放入盛有1X HB unstablebuffer的2ml玻璃研磨器(Kimble chase,885301-0002,885300-0002)中，冰上静置5分钟；使用A研磨棒研磨组织约10-15次后把这一步中的溶液用细胞过滤筛过滤到新的50mL离心管中；再使用B研磨棒研磨约20次，把这一步中的溶液用细胞过滤筛过滤后，4℃，350RCF,离心5min；吸弃上清加入350L预冷的1xHB，重悬混匀；加入400μL的50％Iodixanol Solution，混匀；将600μL的30％Iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入25％的溶液层之下；将600μL的40％iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入30％的溶液层之下；冷冻离心机的制动设为0，4℃，3000RCF，离心20min。吸取细胞核层溶液，加入适量的预冷的ATAC-RSB-Tween稀释后，台盼蓝计数；计数8000个细胞核，加入1mL预冷的ATAC-RSB-Tween溶液，混匀。

步骤S2中，转座反应的具体操作为：将步骤(1)提取的细胞核加入到包含5×TTBL10μL，TTEMix V50 5μL，ddH2O 17.5μL，PBS 16.5μL的转座反应体系中，置于PCR仪中，37℃条件下，反应30min。

步骤S2中的纯化过程为：使用Qiagen MinElute PCR purification Kit(250)加入250μl(产物的5倍体积)的PB buffer,混匀。转移到Column中，室温静置5min后8000rpm，室温，离心1min。弃去收集管中的液体，向Column中加入750μl的PE buffer，室温，13000rpm，离心1min。弃去收集管中的液体，室温，10000rpm，离心1min。将Column转移到新的1.5ml Lo-Bind离心管中，开盖静置3min。加入11μl ddH2O，滴加到膜上，室温静置5min，室温，10000rpm，离心1min。

步骤S3的PCR富集的具体操作为：以步骤(2)纯化的DNA产物为模板，配制50μL的反应体系：转座后的DNA 10μl，5×PCR MIX 25μl，N5XX 5μl，N7XX 5μl，ddH2O 5μl，混匀后按照以下条件扩增：72℃延伸5分钟，98℃预变性30秒，然后按以下参数扩增5个循环：98℃变性10秒，63℃变性30秒，72℃延伸1分钟，最后12℃Hold。

使用qPCR确定最低限度循环PCR扩增的次数，quantitative PCR(qPCR)15μl反应体系：上述扩增了5次的DNA 5μl，100×SYBR Green I 0.06μl，2×2PCR MIX 5μl，与上述相同的N5XX 0.25μl，N7XX 0.25μl，ddH2O 4.44μl。混匀后按照以下条件：98℃30秒，20个循环：98℃10秒，63℃30秒，72℃1分钟。

根据以上qPCR结果预测需要添加的PCR cycles(1/3Rn max),将剩下的45μl样品按照以下程序进行PCR扩增：98℃预变性30秒，然后按以下参数扩增5个循环：98℃变性10秒，63℃变性30秒，72℃延伸1分钟，最后12℃Hold。

步骤S3中的扩增产物进行长度分选：加入50μL的DNA，分别按DNA与Beads体积比例1:0.55和1:1进行两轮Beads分选，得到目的大小DNA。

使用Qubit4.0测量浓度，使用PART8:使用Qsep1进行片段分布检测。

实施例1：

冷冻微量食管鳞癌组织ATAC-seq测序的建库的方法。

(1)配置ATAC-seq建库所需试剂

a.6X HB unstable

b.1X HB unstable

c.50％Iodixanol Solution

d.40％Iodixanol Solution

e.30％Iodixanol Solution

(2)研磨组织，提取细胞核

a.吸取预冷的2mL1 x HB unstable buffer于组织研磨器中，置于冰上，待用。

b.迅速称取镜放大内镜下钳取的微量食管鳞癌标本，5mg。

c.迅速放入含有HB unstable buffer的组织研磨器中，冰上静置解冻约5min。

d.使用A研磨棒进行约10～15次研磨。

e.把上一步中的溶液用细胞过滤筛过滤到新的50mL离心管中。

f.再使用B研磨棒研磨约15次。

g.把上一步中的溶液用细胞过滤筛过滤到新的50mL离心管中。

h.转移到新的2mL的Lo-Bind离心管中，4℃，350RCF,离心5min。

i.吸弃上清至剩余约50L的体积，加入350L预冷的1xHB，重悬混匀。

j.加入400μL的50％Iodixanol Solution，混匀。

k.将600μL的30％Iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入25％的溶液层之下。

l.将600μL的40％iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入30％的溶液层之下。

m.把冷冻离心机的制动设为0，4℃，3000RCF，离心20min。

n.观察到明显的细胞核层，吸弃适量的上层溶液，吸取细胞核层溶液转移到新的1.5mL的Lobind离心管中。

o.加入约200μL预冷的ATAC-RSB-Tween进行稀释，混匀。

p.吸取5μL上一步的溶液与5μL的台盼蓝溶液混匀，于血球计数板上计数，计算细胞核浓度。

q.转移6000个细胞核到新的1.5mL的Lo-Bind离心管中，加入1mL预冷的ATAC-RSB-Tween溶液，混匀，4℃，500RCF，离心10min。

(3)转座

a.按下表配制Tn5 reaction mix:

b.弃去上清，吸取50μL上步中配制的mix至EP管中，混匀

c.37℃，孵育30min

(4)纯化

a.使用Qiagen MinElute PCR purification Kit(250)加入250μl(产物的5倍体积)的PB buffer,混匀。

b.转移到Column中，室温静置5min后8000rpm，室温，离心1min.

c.弃去收集管中的液体，向Column中加入750μl的PE buffer，室温，13000rpm，离心1min。

d.弃去收集管中的液体，室温，10000rpm，离心1min。

e.将Column转移到新的1.5ml Lo-Bind离心管中，开盖静置3min。

f.加入11μl ddH2O，滴加到膜上，室温静置5min，室温，10000rpm，离心1min。

(1)PCR富集，构建文库。

a.配置PCR反应体系

b.PCR反应程序

c.按下表配置qPCR体系

d.qPCR反应程序

e.根据以上结果预测需要添加的cycles数(1/3Rn max)，将剩下的45μl样品按下表程序进行PCR扩增

(5)文库片段筛选

a.涡旋振荡混匀VAHTS DNAClean Beads并吸取27.5μl体积至50μlPCR产物中，使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

b.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。

c.涡旋振荡混匀VAHTS DNAClean Beads并吸取50μl体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

d.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。

e.保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清。漂洗2次。

f.保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。

g.将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

(5)文库质检

使用Qubit4.0测量浓度，使用Qsep1进行片段分布检测。果如图3所示，文库片段大小范围200-700bp，主峰约200bp、500bp、700bp，呈锯齿峰形状。

实施例2：

冷冻微量肠组织ATAC-seq测序的建库的方法。

(1)配置ATAC-seq建库所需试剂

a.6X HB unstable

b.1X HB unstable

c.50％Iodixanol Solution

d.40％Iodixanol Solution

e.30％Iodixanol Solution

(2)研磨组织，提取细胞核

a.吸取预冷的2mL1 x HB unstable buffer于组织研磨器中，置于冰上，待用。

b.迅速称取镜放大内镜下钳取的微量食管鳞癌标本，5mg。

c.迅速放入含有HB unstable buffer的组织研磨器中，冰上静置解冻约5min。

d.使用A研磨棒进行约20次研磨。

e.把上一步中的溶液用细胞过滤筛过滤到新的50mL离心管中。

f.再使用B研磨棒研磨约20次。

g.把上一步中的溶液用细胞过滤筛过滤到新的50mL离心管中。

h.转移到新的2mL的Lo-Bind离心管中，4℃，350RCF,离心5min。吸弃上清至剩余约50L的体积，加入350L预冷的1xHB，重悬混匀。

i.加入400μL的50％Iodixanol Solution，混匀。

j.将600μL的30％Iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入25％的溶液层之下。

k.将600μL的40％iodixanol Solution碘克沙醇溶液小心地加入30％的溶液层之下。

l.把冷冻离心机的制动设为0，4℃，3000RCF，离心20min。

m.观察到明显的细胞核层，吸弃适量的上层溶液，吸取细胞核层溶液转移到新的1.5mL的Lobind离心管中。

n.加入约200μL预冷的ATAC-RSB-Tween进行稀释，混匀。

o.吸取5μL上一步的溶液与5μL的台盼蓝溶液混匀，于血球计数板上计数，计算细胞核浓度。

p.转移30000个细胞核到新的1.5mL的Lo-Bind离心管中，加入1mL预冷的ATAC-RSB-Tween溶液，混匀，4℃，500RCF，离心10min。

(3)转座

a.按下表配制Tn5 reaction mix:

b.弃去上清，吸取50μL上步中配制的mix至EP管中，混匀

c.37℃，孵育30min

(4)纯化

a.使用Qiagen MinElute PCR purification Kit(250)加入250μl(产物的5倍体积)的PB buffer,混匀。

b.转移到Column中，室温静置5min后8000rpm，室温，离心1min.

c.弃去收集管中的液体，向Column中加入750μl的PE buffer，室温，13000rpm，离心1min。

d.弃去收集管中的液体，室温，10000rpm，离心1min。

e.将Column转移到新的1.5ml Lo-Bind离心管中，开盖静置3min。

f.加入11μl ddH2O，滴加到膜上，室温静置5min，室温，10000rpm，离心1min。

(5)PCR富集，构建文库。

a.配置PCR反应体系

f.PCR反应程序

g.按下表配置qPCR体系

h.qPCR反应程序

i.根据以上结果预测需要添加的cycles数(1/3Rn max)，将剩下的45μl样品按下表程序进行PCR扩增

(5)文库片段筛选

a.涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取27.5μl体积至50μlPCR产物中，使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

b.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。

c.涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取50μl体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

d.将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。

e.保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清。漂洗2次。

f.保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。

g.将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

(5)文库质检

使用Qubit4.0测量浓度，使用Qsep1进行片段分布检测。结果如图3所示，文库片段大小范围200-700bp，主峰约200bp、300bp、500bp，呈锯齿峰形状。

以上所述实施例仅表示本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此本发明的保护范围应该以所述权利要求为准。