Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗白血病的药物中的应用
阅读说明：本技术 Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗白血病的药物中的应用 (Application of RNA helicase DHX33 inhibitor in preparation of drugs for treating leukemia ) 是由 张严冬 聂光丽 李相鲁 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗白血病的药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在白血病发展中的重要作用,提供的小分子化合物具有抑制DHX33解旋酶活力的作用,进而促进由DHX33调控的BCL-2家族蛋白介导的白血病癌细胞凋亡,该小分子化合物可以快速诱导白血病细胞的凋亡,但对正常血细胞无杀伤性,因此具有重要的医药开发价值。(The invention discloses application of an RNA helicase DHX33 inhibitor in preparation of a medicament for treating or adjunctively treating leukemia. The invention establishes the important function of DHX33 protein in leukemia development, the provided small molecular compound has the function of inhibiting DHX33 helicase activity, and further promotes the apoptosis of leukemia cancer cells mediated by BCL-2 family protein regulated and controlled by DHX33, and the small molecular compound can rapidly induce the apoptosis of leukemia cells, but has no killing property on normal blood cells, thereby having important medicine development value.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗白血病的药物中的应用。
背景技术
白血病是一类造血干细胞异常增殖的恶性血液肿瘤，在我国，白血病的发病率排到各类肿瘤疾病发病率的第六位，通常是由于调控细胞生长及凋亡等生物过程的重要基因发生改变而导致的。依据白血病发病的机制、癌变细胞来源等特征，可以针对不同种类的白血病进行特定的治疗。白血病中具有比较理想的治疗效果的白血病包括毛细胞白血病(HCL)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、核心结合因子白血病(CBF)和慢性髓系白血病(CML)。近年来由于嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)和抗体治疗技术的发展，急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的治疗也取得了突破性进展，尤其是针对CD19、CD20、CD22等表面抗原阳性的B细胞类白血病。但对上述抗原为阴性的急性T细胞类白血病、急性髓系白血病(AML)和相关的疾病骨髓增生异常综合征(MDS)均缺乏有效的药物治疗。这些类别的白血病目前还未得到很好的控制，存在治疗药物种类少、靶向性差、不能完全达到预期治疗效果等问题。
毛细胞白血病(HCL)广义上为一种特殊类型的慢性淋巴细胞白血病。目前的治疗药物有喷司他丁(Pentostatin)、克拉屈滨(Cladribine)、利妥昔单抗(Rituximab)等。喷司他丁是一种腺苷脱氨酶(ADA)抑制剂，抑制白血病细胞中ADA的mRNA合成。克拉屈滨有效率为80％至100％，10年生存率为70％。利妥昔单抗是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体，该抗体与跨膜蛋白CD20抗原特异性结合。
急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓系白血病(AML)的一种特殊类型。APL占AML的5％-10％。蒽环类药物和ATRA联合治疗是APL的一线治疗。三氧化二砷(ATO)也被批准用于APL挽救性治疗，作为ATRA加化疗方案的一部分进入一线巩固治疗。
慢性髓系白血病(CML)是独特的白血病。由于每个CML患者都有相同的由BCRABL1编码的异常BCRABL1蛋白，是酪氨酸激酶活性导致了CML，抑制激酶活性可逆转CML的大部分表型，并延迟了CML向急性期的转化。伊马替尼(Imatinib)是酪氨酸激酶的抑制剂，对PDGF受体、c-Kit和Abl的IC50值分别是0.1、0.1和0.025μM。伊马替尼治疗将慢性粒细胞白血病的年死亡率从10％到20％下降到≤2％。10年的存活率估计在80％以上。
慢性淋巴细胞白血病(CLL)的标准治疗主要是烷基化药物(氯丁二烯、环磷酰胺)联合类固醇和长春新碱治疗，但并没有提高存活率。在了解细胞受体、酪氨酸激酶、磷酸肌醇3激酶δ等生理学途径的基础上，开发了几种小分子抑制剂，包括依鲁替尼(ibrutinib，一种BTK抑制剂)、艾代拉利司(idelalisib，一种磷酸肌醇3激酶δ抑制剂)和维特克拉(venetoclax，一种BCL2抑制剂)。依鲁替尼加维特克拉(加或不加CD20单克隆抗体)方案在治疗1年或更长时间后产生了80％的普遍CR(complete remission)和骨髓MRD(minimalresidual disease)阴性率。
综上，多种急性白血病的治疗没有明显的改善，存在治疗药物靶向性差、不能完全达到预期治疗效果等问题。因此，寻找并开发更为有效的白血病治疗药物、降低药物毒副作用、提高治愈率始终是白血病研究领域亟待解决的科学问题。寻找并开发新的靶点和思路对于治疗急性淋巴白血病亦尤为关键。
发明内容
本发明的目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗白血病的药物或组合物中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗白血病的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A、B、C、D或它们药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：
本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行白血病的治疗，因此在第二方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为新型白血病治疗靶点的应用。
第三方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的细胞程序性凋亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导白血病细胞的凋亡，而对正常细胞不具有杀伤性。
DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。
细胞程序性凋亡途径是细胞正常代谢活动中的重要途径，在异常增生的癌细胞中，这一途经呈现异常抑制状态，逃离细胞程序性凋亡，进而无限扩增，对癌症的发生发展起着关键的影响。本申请中的实验结果表明，DHX33蛋白是调控白血病细胞程序性凋亡的重要调控因子之一，影响淋巴细胞或髓系白血病的程序性凋亡，这一过程依赖于DHX33的RNA解旋酶活力。DHX33的酶活抑制剂可以快速诱导淋巴细胞或髓系白血病中的癌细胞凋亡，而对正常细胞无明显杀伤性。本发明首次表明DHX33是治疗淋巴细胞白血病的一个靶向位点。本发明提供的小分子化合物可以有效抑制DHX33的解旋酶活力，进而通过诱导癌细胞凋亡而显著抑制淋巴细胞或髓系白血病的发展。
第四方面，本发明提供了一种用于治疗或者辅助治疗白血病的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的癌细胞程序性凋亡过程。该靶向药物的有效成分为化合物A、B、C、D或者它们药学上可接受的盐或者前药。
第五方面，本发明提供了所述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗白血病中的应用。
第六方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗白血病的药物或药物组合物中的应用，该抑制剂选自化合物A、B、C或者它们药学上可接受的盐或者前药。
在本发明的实施方案中，白血病为淋巴细胞白血病，例如B淋巴细胞白血病、T淋巴细胞白血病，例如急性T淋巴细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病等急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病，或髓系白血病，例如急性髓系白血病、慢性髓系白血病。
在第七方面，本发明提供了合成化合物A的方法，包括以下步骤：
1)通过以下路线合成化合物3(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)：
2)通过以下路线合成化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)：
以及
3)通过以下路线合成所述化合物A(AB21697)：
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明确立了DHX33蛋白在白血病发生发展中的重要作用，提供的小分子化合物具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而抑制由DHX33调控的细胞程序性凋亡。该小分子化合物可以在体外和体内显著的抑制白血病细胞的生长，尤其是淋巴细胞白血病或髓系白血病细胞的生长，从而达到治疗白血病的目的，并因此具有重要的医药开发价值。
附图说明
图1为本发明实施例中Jurkat T细胞在DHX33蛋白受抑制(抑制剂A)后相对于对照组的细胞形态分析。
图2为本发明实施例中Jurkat T细胞在DHX33蛋白受抑制(抑制剂A)后相对于对照组的细胞凋亡分析。
图3为本发明实施例中K562细胞在DHX33蛋白受抑制(抑制剂A)后相对于对照组的细胞形态分析。
图4为本发明实施例中K562细胞在DHX33蛋白受抑制后(抑制剂A)相对于对照组的细胞凋亡分析。
图5为本发明实施例中RAJI细胞和Daudi细胞在DHX33蛋白受抑制后(抑制剂A)相对于对照组的细胞凋亡形态变化。
图6为本发明实施例中Jurkat T及K562细胞在DHX33蛋白受抑制后(抑制剂A)16小时的细胞形态变化。
图7为本发明实施例中Jurkat T细胞及K562细胞在DHX33蛋白受抑制后(抑制剂A)用RNA测序分析凋亡相关基因的变化分析表，同时也比较分析了其他受DHX33蛋白调控的基因变化。
图8为本发明实施例中Jurkat T细胞在DHX33蛋白受抑制后(抑制剂C)提取RNA进行定量PCR分析凋亡相关基因的转录物变化。***和****分别代表P值小于0.005和0.001，统计学上具有显著差异。
图9为本发明实施例中DHX33抑制剂B、C、D在T淋巴细胞白血病细胞中测定的细胞半抑制浓度IC50。
图10为本发明实施例中分析DHX33抑制剂(抑制剂C)处理后淋巴细胞白血病细胞随着化合物浓度增加进行流式检测中的细胞散点图。
图11为本发明实施例中DHX33抑制剂C处理后白血病细胞随着化合物浓度增加的凋亡染色分析。
图12为本发明实施例中DHX33抑制剂C处理后白血病细胞随着化合物浓度增加的凋亡指数分析。
图13为本发明实施例中DHX33抑制剂C处理白血病细胞随着化合物处理时间增加的流式检测的细胞散点图。
图14为本发明实施例中DHX33抑制剂C处理白血病细胞随着化合物处理时间增加的凋亡染色分析。
图15为本发明实施例中DHX33抑制剂C处理白血病细胞随着化合物处理时间增加的凋亡指数分析。
图16为本发明实施例中分析用DHX33抑制剂A处理后的正常人外周血单核细胞的细胞活度分析。
图17为本发明实施例中DHX33抑制剂在正常骨髓间充质细胞中的IC50。
图18为本发明实施例中化合物(抑制剂B和抑制剂C)通过静脉注射和灌胃给药后在大鼠体内的药物代谢分析图。
图19为本发明实施例中化合物(抑制剂B和抑制剂C)的血浆稳定性分析图。
图20为本发明实施例中DHX33抑制剂D对人癌细胞Jurkat T的异种荷瘤模型药效试验实施规划图。其中接种癌细胞的时间、药物处理时间点都有标示。
图21为本发明实施例中DHX33抑制剂D对Jurkat T细胞在免疫缺陷小鼠体内生长的药效作用，图示为终点收获的对照组和药物组小鼠肿瘤图片。
图22为本发明实施例中DHX33抑制剂D对肿瘤生长的终点肿瘤重量分析图。****表示具有显著差异。
图23为本发明实施例中对照组和药物组小鼠体重的监测曲线。二组之间无显著差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
1.细胞培养
Jurkat-T、Raji、Daudi、K562、Nalm6等细胞系购自中科院细胞库。将这些细胞系维持在含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素的RPMI培养基中。CD8细胞从健康志愿者申请抽取。分离见ROSEETTE CD8 T细胞分离试剂盒(Stem Cell Technologies)分离试剂盒。人外周血单核细胞的分离方法，使用5mL的健康志愿者捐献的新鲜血液(用抗凝管收集)，用无菌PBS做1:1的稀释后，缓慢加入与稀释后血液等体积的淋巴细胞分离液上面，注意不要混合。然后将样品在2000rpm的转速条件下离心20分钟，降速缓慢。离心后，白细胞落在中间层，小心用吸管提取含有白细胞的中间层，用PBS洗涤两次即可。小鼠骨髓间充质细胞的提取按照如下方式进行：健康的2月龄小鼠通过断颈处死后，将小鼠腿骨取出，放在无菌PBS溶液中，然后剔除肌肉、肌腱等组织，用无菌剪刀将骨的前后两端剪下，漏出骨髓部分。用无菌1mL注射器吸取1mL的PBS溶液，然后将针头轻轻插入骨髓处，然后将骨髓吹出。通过慢速离心方法(2000rpm,2分钟)将骨髓沉淀，然后重悬于红细胞裂解液中(150mMNH4 Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA(pH 7.4)，放置于冰上5分钟。然后低速离心(2000rpm,2分钟)，去掉上清液。将沉淀的白细胞重悬于含10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、添加非必须氨基酸和链霉素、青霉素的RPMI培养基中，骨髓间充质细胞会在后面的1-3天的时间贴壁生长，其他的细胞通过换液方法去除。
2.RNA测序
RNA测序详见DHX33 Interacts with AP-2beta To Regulate Bcl-2 GeneExpression and Promote Cancer Cell Survival.Wang J,Feng W,Yuan Z,Weber JD,Zhang Y.Mol Cell Biol.2019Aug 12；39(17)。
药物处理后的细胞用NUCLEOSPIN RNAII试剂盒(Clonetech)提取细胞总RNA。然后在变性后用磁珠oligo-dT珠(Genergy Bio(晶能生物技术(上海)有限公司)进一步纯化RNA样品。将纯化的mRNA样品逆转录成第一链cDNA，并进一步合成第二链互补DNA。片段化的DNA样品是平端的，并且在3’末端腺苷酸化。用适配子连接，然后构建文库。通过Qubit(Invitrogen)定量DNA。在cBot簇生成后，然后通过来自Genergy Bio(晶能生物技术(上海)有限公司)的IlluminaHiSeq2500 SBS对DNA样品进行测序。原始数据转换成Fastq格式。每个样品中的转录物的量基于FPKM-片段每千碱基转录物的每百万个片段计算，使用cuffnorm软件计算每个样品的FPKM值并应用log2值。cuffnorm软件用于计算不同样品之间的差异基因转录物。对于KEGG通路分析，使用整个转录物作为背景列表，使用差异转录物作为候选列表，计算P值。基于基因功能对重要基因进行分类。
3.实时定量PCR
引物均由IDT(http：//sg.idtdna.com/site)在线“realtime PCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。通过Highpure RNA分离试剂盒(Roche)提取总RNA，然后使用PrimeScript混和试剂盒(Takara)转录成cDNA。使用SYBR green supermix(Bio-Rad)进行定量PCR反应，并且在用GAPDH值归一化之后通过Ct值计算转录物含量。使用扩增产物的熔解曲线用于确认反应中针对特定基因的单一产物的扩增。
针对人体细胞中参与细胞程序性凋亡基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：
引物名称
序列
NOXA1-Forward
CCAAGCCGTGACCAAGGAC
NOXA1-Reverse
CGCCACATTGTGTAGCACCT
BCL2L13-Forward
TCAGCCCTGCCAATCCAGA
BCL2L13-Reverse
CCGAAATGCCTGATATGTCACT
BCL2L11-Forward
TAAGTTCTGAGTGTGACCGAGA
BCL2L11-Reverse
GCTCTGTCTGTAGGGAGGTAGG
TMBIM1-Forward
GAGAGAGCGGTGAGTGATAGC
TMBIM1-Reverse
ACCTTTCGGATAAAAGTGTGTCG
BCL6-Forward
GGAGTCGAGACATCTTGACTGA
BCL6-Reverse
ATGAGGACCGTTTTATGGGCT
MCL-Forward
CCAAGGACACAAAGCCAATG
MCL-Reverse
TGATGTCCAGTTTCCGAAGC
BCL2-Forward
ACTGGAGAGTGCTGAAGATTG
BCL2-Reverse
AGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
BMF-Forward
ACCCCAGCGACTCTTTTATG
BMF-Reverse
TTTCGGGCAATCTGTACCTC
4.细胞凋亡分析
根据制造商的方案用Vybrant凋亡试剂盒#2(Molecular Probes)进行凋亡测定。将细胞用胰蛋白酶(索莱宝生物技术有限公司)消化并重悬于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数。每个样品计数100万个细胞，沉淀细胞，并用磷酸缓冲液洗涤2次，然后用试剂盒中的结合液重悬，然后重悬于含有AnnexinV(膜联蛋白V)的工作溶液中，避光孵育15分钟，然后低速离心(1000rpm)离心5分钟，用磷酸缓冲液洗涤一次。将细胞通过35μm过滤膜(Becton Dickinson)过滤，然后进行流式细胞分析仪(FACS，Becton Dickinson)分析，分析的时候通过绿色荧光强度分析凋亡细胞指数。
5.细胞半抑制浓度IC50值测定
将癌细胞株JURKATT细胞以1X104个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将化合物以10nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞孵育时间达到48h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，孵育2h后，用酶标仪读板(OD450nm)，将实验重复3次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC50)。
6.统计分析
数据表示为平均值+SD。使用斯氏t检验(Student’s test)确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著。
本发明化合物A的合成方法如下：
(一)本申请化合物A(AB21697)的合成及其鉴定
1、化合物3(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)的合成
将化合物1(2-氨基-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(2.5g,18.36mmol,1.0eq)溶解于四氢呋喃(50mL)中，加入化合物2(2,5-己二酮)(3.3g,29.38mmol,1.6eq)、3A分子筛(50g)和对甲苯磺酸(1.4g,7.44mmol,0.4eq)。将混合物加热回流、搅拌过夜。将固体物过滤浓缩，将剩余物用快速柱色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)，获得白色固体粉末状化合物3(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(2.8g，产率：71.2％)。
MS(ESI)m/z:215.3[M+H]+.
TLC：石油醚/乙酸乙酯(10:1)；
Rf:(化合物1)＝0.1；
Rf:(化合物3)＝0.7；
HNMR(CDCl3,400Hz):δ5.87(s,2H),2.24(s,3H),2.11(s,6H),2.08(s,3H)。
2、化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)的合成
将三氯氧磷(1.9ml,20.8mmol,1.0eq)在氮气存在的条件下于零度逐滴添加到二甲基甲酰胺DMF(30mL)中。将混合物于零度搅拌30分钟后升到室温。将溶解于二甲基甲酰胺(4mL)中的化合物3(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(4.46g,20.8mmol,1.0eq)添加到上面的混合物中。将混合物加热到100℃，在氮气存在的条件下搅拌2个小时。冷却后，将反应物倒入冰水中，用30％的氢氧化钠水溶液将反应物pH调节到10。将反应物用己酸乙酯萃取，用盐水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，浓缩。将固体物用快速柱色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)，获得为黄色固体的化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(4.5g，产率：89.4％)。
MS(ESI)m/z:243[M+H]+.
TLC：石油醚/乙酸乙酯(20:1)；
Rf:(化合物3)＝0.7；
Rf:(化合物4)＝0.5；
HNMR(CDCl3,400Hz):δ9.86(s,1H),6.35(s,1H),2.38(s,3H),2.27(s,3H),2.10(s,6H)。
3、化合物A(即AB21697)((E)-2-(3-(2-(1-(1-H-苯并[d]咪唑-2-基]-2-氰基乙烯基])-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)的合成
将化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(455mg,2.89mmol,1.0eq)溶解于乙醇(8mL)中，加入化合物8(2-氰甲基苯并咪唑)(700mg,2.89mmol,1.0eq)和哌啶(246mg,2.89mmol,1.0eq)。将混合物加热回流搅拌1个小时。反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤。收集并干燥固体，获得黄色粉末状化合物A即AB21697((E)-2-(3-(2-(1-(1-H-苯并[d]咪唑-2-基]-2-氰基乙烯基])-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(1.0g，产率：90.1％)。
MS(ESI)m/z:382[M+H]+.
HNMR 1H NMR(400MHz,cdcl3)δ9.71(s,1H),8.33(s,1H),7.72(d,J＝6.7Hz,1H),
7.45(d,J＝5.4Hz,1H),7.26(d,J＝9.1Hz,2H),7.01(s,1H),2.28(s,6H),2.13(d,J＝18.8Hz,6H)。
(二)化合物B和化合物C的合成及鉴定请参见CN112661754A。
(三)化合物D(AB24386)的合成及鉴定如下：
1、合成路线如下：
2、合成方法如下：
1)化合物3(2-乙酰基-4-戊酮酸乙酯)的制备方法
将化合物1(乙酰乙酸乙酯)(5g,38.42mmol,1.0eq)溶解于三乙胺(75mL)中，加入化合物2(氯丙酮)(3.5g,38.42mmol,1.0eq)。在有氮气保护的条件下，将反应物于110℃反应2个小时。浓缩之后，将残余物溶解于水(100mL)中，然后用二氯甲烷提取两次(每次50mL)。将有机层用盐水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤然后浓缩。将残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20:1)纯化，获得无色油状化合物3(2-乙酰基-4-戊酮酸乙酯)(1.3g，产率：18.3％)。
MS(ESI)m/z:187[M+H+].
TLC:PE/EA(2/1)
Rf：(化合物1)＝0.6；
Rf：(化合物2)＝0.4；
2)化合物5(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯)的制备方法
将化合物3(2-乙酰基-4-戊酮酸乙酯)(1g,7.23mmol,1.0eq)溶解于甲苯(20mL)中，加入化合物4(2-氨基-3-氰基-5-甲基噻吩)(1.6g,8.68mmol,1.2eq)和对甲苯磺酸(249mg,1.45mmol,0.2eq)。将反应物于110℃搅拌16小时。将固体物过滤后浓缩。将残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝50/1到30/1)纯化，获得黄色油状化合物5(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯)(860mg，产率：41％)。
MS(ESI)m/z:289[M+H+].
TLC：石油醚/乙酸乙酯(10/1)
Rf:(化合物3)＝0.2；
Rf:(化合物4)＝0.4；
3)化合物D(AB24386)(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-N-(6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺)的制备方法
将化合物5(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯)(50mg,0.306mmol,1.0eq)添加到溶解于1mL甲苯的化合物7(5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-胺)(88mg,0.306mmol,1.0eq)中，加入三甲基铝(0.15mL,0.306mmol,1.0eq,2M溶于甲苯)。将反应物于100℃搅拌16小时。将混合物冷却到室温，用甲醇(10mL)淬冷，然后用3M盐酸调节pH到3。将混合物用水(30mL)稀释，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次20mL。将有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩。残余物用制备型高压液相色谱Prep-HPLC(乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化，获得为白色固体的化合物D(AB24386)(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-N-(6-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺)(5mg，产率：4％)。
MS(ESI)m/z:406[M+H+].
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.04(s,1H),11.20(s,1H),7.32(s,1H),7.29(s,1H),6.98(s,1H),6.89(s,1H),6.69(d,J＝7.2Hz,1H),3.73(s,3H),2.47(s,3H)，2.38(s,3H)，2.04(s,3H)。
化合物针对靶点的抑制性分析
使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)进行体外DHX33蛋白解旋酶活力测定。DHX33蛋白的提取、解旋酶活力分析的具体方法参见CN112661754A。使用上述方法进一步分析化合物对DHX33解旋酶活力的抑制性。
本发明的化合物对DHX33解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白解旋酶的活力具有显著的抑制作用。
表1：化合物A、化合物B、化合物C、化合物D对DHX33蛋白解旋酶活力的抑制性分析
*代表半抑制浓度≥400nM；
**代表100nM≤半抑制浓度＜400nM；
***代表20nM≤半抑制浓度＜100nM；
****代表半抑制浓度＜20nM。
实施例1DHX33蛋白抑制剂在淋巴细胞白血病中起重要作用，对DHX33蛋白的抑制显著抑制了淋巴细胞白血病细胞的生长
体外培养多种人白血病模型细胞系，包括Jurkat T细胞系、Raji细胞系、Daudi细胞系、K562细胞系和Nalm6细胞系，进行体外细胞活度实验。Jurkat细胞，一种悬浮细胞，是用于研究人急性T细胞白血病的一种模型细胞。Raji是一种人B为淋巴瘤细胞模型，为B细胞起源。Daudi细胞系是人Burkkit淋巴瘤细胞，该细胞携带EB病毒，是典型的B淋巴母细胞系，用于白血病发病机制的研究。K562细胞系是人慢性髓系白血病细胞。Nalm6细胞系是人急性B淋巴细胞白血病细胞。
实验如图1所示，相对于DMSO对照组，用DHX33抑制剂化合物A处理的Jurkat T细胞在形态外观、数量和活度上都有明显的死亡现象。Jurkat T细胞培养2代之后，经过DHX33抑制剂(化合物A)处理或者DMSO溶媒处理72h后，用细胞流式分析仪分析细胞凋亡情况。结果如图2所示，在系列浓度处理72h的情况下，Jurkat T细胞的凋亡比例呈现随浓度增加而癌细胞凋亡比例增大的现象。所用化合物A的浓度为4-5μM，处理72小时后，癌细胞的凋亡比率达到50％左右。
将K562细胞复苏培养一段时间，经过DHX33蛋白抑制剂(化合物A)或者DMSO溶媒处理72h，然后在倒置显微镜下观察。结果如图3所示，用DMSO处理的K562细胞生长旺盛，细胞数量致密，形态正常；而用2μM的DHX33抑制剂化合物A处理的K562细胞系生长受阻，细胞数量相对减少，形态发生变化，用4μM的DHX33蛋白抑制剂化合物A处理的K562细胞系明显生长受阻，细胞数量骤减，形态发生改变，细胞状态差。由图4可见，流式细胞仪分析显示，用4μM的化合物A处理的K562细胞系发生凋亡现象。
图5显示了在Raji细胞系及Daudi细胞系中，用化合物A处理之后两株细胞在形态上具有相似的结果，表现出明显的细胞凋亡。
以上结果均是化合物A处理癌细胞72小时的结果。如果把化合物A的处理时间缩短到16个小时，可以看到癌细胞在化合物A处理下快速地出现生长抑制和细胞分裂异常的现象，表现为细胞分裂抑制，如图6所示。
本实施例的结果表明，DHX33蛋白抑制剂对多种白血病细胞具有杀伤作用。
实施例2DHX33抑制剂诱发细胞程序性凋亡是引起白血病细胞死亡的主要原因
B淋巴细胞瘤-2基因简称Bcl-2(B-cell lymphoma-2)，即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因，是细胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，具有明显抑制细胞凋亡的作用，它在白血病细胞经常出现高表达。经DHX33蛋白抑制剂A处理后的Jurkat T细胞中，BCL2基因下调。
BMF(bcl-2-modifying factor)是一种具有促凋亡作用的Bcl-2家族成员，在正常生理状态下，内源性BMF持续锚定在胞浆中的细胞骨架上，时刻感受细胞内的变化，一旦损伤刺激作用于细胞，BMF从胞浆转移至线粒体，触发线粒体凋亡途径，诱导细胞凋亡。经DHX33抑制剂化合物A处理后的Jurkat T细胞，其BMF基因上调，即促进了白血病细胞凋亡。
Mcl-1(myeloid cell leukemia-1)基因作为Bcl-2家族成员之一，在细胞的生存、凋亡、周期及分化调控中起着重要的作用。Mcl-1基因与血液系统恶性肿瘤的发生和发展有着密切的关系。研究表明，抑制Mcl-1基因的表达，可促进细胞凋亡并提高肿瘤细胞对放疗及化疗的敏感性，在本实施例中，Mcl基因下调，表明协调促进了白血病细胞凋亡。
为了分析DHX33抑制剂处理后癌细胞引起明显凋亡的分子机理，将Jurkat T细胞和K562细胞用DHX33抑制剂化合物A处理仅16个小时，然后收获细胞提取总RNA，然后按照标准流程进行RNA-seq测序分析。图7的结果显示，在两株癌细胞中，化合物A均可以有效调控参与细胞凋亡的多种基因的转录。这些基因包括BMF、Mcl、Bcl2L11、Bcl2L13、Noxa1等。同时表格也提供了抑制剂处理下其他的已经证明可以被DHX33调控的基因比如参与细胞周期的基因及参与细胞糖酵解基因的表达变化。这些结果进一步证实了DHX33已经在细胞中被有效抑制。为了验证RNA测序结果的正确性，对Jurkat T细胞进一步分析了用化合物C处理的Jurkat T细胞中上述基因的表达，具体结果见图8。由图8可知，在用DHX33抑制剂C处理的Jurkat T细胞中，多种促进凋亡的基因出现上调，比如Noxa、BMF等；而参与抑制凋亡的基因下调，比如Mcl。
实施例3优化后获得的高活性化合物C更有效诱发癌细胞程序性凋亡
因为化合物A具有较高的细胞半抑制浓度，即活性相对不高，对化合物A的分子优化后选择化合物B(IC50＝10-20nM)和化合物C(IC50＝0.15μM)(参见CN112661754A)来进一步分析DHX33抑制剂对白血病细胞的诱导凋亡作用。图9显示了用化合物B、C和D处理的Jurkat T细胞的半抑制浓度分析，结果表明，这几个化合物在Jurkat T细胞中的抑制剂浓度，即IC50，在0.025到0.18μM之间，比化合物A的活性有显著提高。
首先在增加化合物C剂量的基础上，分析凋亡指数。将癌细胞分别用0、0.1、0.25、0.5、1μM处理24小时，收获细胞后，用凋亡染色试剂盒分析细胞的凋亡比率。如图10-12所示，实验数据显示，抑制DHX33蛋白后，JurkatT细胞发生显著的细胞凋亡。数据分别呈现了细胞的散点图，凋亡细胞集群比率(不同样品的细胞在图上标示了不同浓度或者处理时间，其中#351代指化合物C)。用抑制剂C处理癌细胞24小时后，最高剂量的化合物C可以导致接近90％的细胞出现凋亡。凋亡比率用表格标示出来，表格中记录了分析的总体细胞数和凋亡的细胞数，以及凋亡细胞占总细胞的比率。类似地，如图13-15所示，用化合物C在不同的处理时间条件下分析Jurkat T细胞的凋亡，在处理96小时后，Jurkat T细胞的凋亡比例已经超过90％。
上述实验结果证明，浓度较低的化合物C对淋巴细胞白血病细胞具有高效的诱导凋亡作用。
实施例4DHX33抑制剂对正常细胞无明显杀伤性
为了进一步分析DHX33抑制剂对正常血细胞的抑制作用。提取了正常人外周血单核细胞，并用DHX33抑制剂化合物A来处理。结果如图16所示，人血液中的单核外周血细胞没有发生明显的生长抑制性，说明化合物A对正常细胞的杀伤或者抑制作用不明显。
进一步分析化合物C对从小鼠骨髓中提取的间充质细胞的抑制作用。结果如图17所示，在正常细胞中，化合物C的细胞半抑制浓度为2.2μM，这相对于白血病细胞而言，超过了10倍以上。而且正常细胞在用化合物C处理后的总体活度要比癌细胞的活度高。以上实验结果证实，化合物C对癌细胞的敏感性是对正常细胞敏感性的至少10倍。
实施例5DHX33蛋白抑制剂的动物体内药代学分析
小分子化合物虽然可以在体外具有明显的抑制癌细胞生长的作用，但是在体内的药效发挥会受到体内药代动力学影响，因此选择化合物B和化合物C分别进行药代学分析。
静脉注射用化合物样品制备：每只大鼠平均体重300g，用100μLDMSO溶解0.3mg化合物C，然后加入400μL聚乙二醇400，最后加入1mL的无菌磷酸缓冲液配成澄清的溶液，用于大鼠尾静脉注射。
灌胃化合物的样品制备：对每只300g的大鼠，将2.4mg的化合物B(KEYE-2020-3)或化合物C(KEYE-2021-21(化合物B只用于灌胃实验)溶解于100μLDMSO中，加入1.4mLphorsal50PG(购自上海新睿生物科技有限公司)，用于大鼠的灌胃。大鼠在灌胃之前，禁食10h，在灌胃之后的4h解禁。
大鼠来源：中英SIPPR/BK实验动物公司，上海，中国。
大鼠数量，共6只，3只用于静脉注射，3只用于口服灌胃。
血浆样品收集：
静脉注射：注射后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h。
口服灌胃：口服后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24h。
血浆样品收集及操作步骤：大鼠给药后进行静脉取血，每个时间点取血0.2mL。将血液样品放置于冰上含有EDTA的小管中，直至离心。血液样品在取血后的1h内用离心机以6800g离心6分钟，然后迅速置于-80℃冰箱内，剩余的血液处理掉。
样品分析和数据处理：
分析结果通过质量检验后确定。大于66.7％的质量检验的样品的准确度应该保持在已知数据的80-120％范围内。
标准参数，包括曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(0-∞))、清除半衰期(T1/2)、最大血浆浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)，通过FDA认证的药代程序PhoenixWinNonlin 7.0(Pharsight,USA)进行分析。从图18可见，化合物B和化合物C在大鼠给药后的各种药代学参数。从图中数据可见，化合物C具有较好的生物利用度,无论是静脉注射或者口服给药，都具有较好的吸收。特别是，化合物C具有较好的口服生物利用度，平均生物利用度达到43％左右。
除了分析药物的药代动力学参数之外，本实施例还进行了血浆稳定性实验。血浆稳定性实验方法具体如下：
1.将100mM KCl缓冲液(含有5mM MgCl2，pH 7.41)预热到37℃。
2.将人血浆迅速融化到37℃。
3.测试化合物和内参的制备：
1)将化合物B(KEYE-2021-9)和化合物C(KEYE-10-6)用DMSO溶解，配制成10mM的母液。然后配置0.5mM溶液A：将10μL的10mM母液加入到190μL乙腈中，得溶液A；
2)0.01mM溶液B：将20μL溶液A加入到980μL的100mM KCl缓冲液，得溶液B。
4.预热血浆和溶液B，37℃孵育5分钟。
5.向孔内加入90μL预热的血浆样品，时间点如下：0、5、15、30、60、120分钟。
6.在0分钟时间点，将含有内参普鲁卡因的400μL乙腈加入到0-分钟的孔内，然后加入10μL溶液B。
7.对于其他时间点，将10μL事先预热的溶液B加入到设定的孔内，时间点如下：5、15、30、60、120分钟，然后计时。
8.在下面的几个时间点：5、15、30、60、120分钟，将400μL含有内参普鲁卡因的乙腈加入到每个孔内，用来终止反应。
9.淬灭后，将板摇晃5分钟(600rpm)并保存于-20℃(必要时)直至用LC/MS/MS分析。
10.在用液质联机LC/MS/MS进行分析前，将样品融化到室温，然后6000rpm离心20分钟。
11.将100μL上清液转移到96孔板的孔中，事先每孔已经加入了100μL的水，进行LC/MS测试。
实验结果如图19所示，化合物B和化合物C非常稳定，不易在血浆中被修饰。
以上的体内体外的药物代谢数据显示，DHX33的小分子抑制剂在体内可以达到有效浓度，并且具有较好的代谢稳定性。以上数据支持DHX33小分子抑制剂具有开发为有效的诱导白血病细胞凋亡药物的价值。
实施例6DHX33蛋白抑制剂的动物体内药效学分析
具体的实验规划如图20所示，待肿瘤可以触摸到后，将小鼠进行随机分组。给药方式选择小动物的尾静脉注射，在本申请的四个化合物中，化合物D具有较好的水溶性，因此本实验选择化合物D进行静脉注射给药。实验详情如下：
1、动物信息
种属及品系：NOD-SCID严重免疫缺陷小鼠品系。
性别及周龄：雌性，6周龄。
体重：20-22g，偏差约为体重均值的±20％。
接种动物数：8只。
动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。
2、动物饲养
居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼4只。
温度：20-26℃。
湿度：40-70％。
光照：12h昼夜交替。
饲料：辐照小鼠饲料，购自江苏协同医药生物工程有限公司，自由进食。
饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。
垫料：玉米芯，购自江苏协同医药生物工程有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换两次。
适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。
动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。
所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。
3、溶媒处方及给药溶液储存条件
(1)受试物：化合物D
药物配置：按照每只体重20g的小鼠计算，称取0.2mg或者0.5mg粉末状态化合物D，先用2.5μl的NMP在常温下溶解，然后按照NMP:PEG400:Tween 80＝1:2:1的体积比在常温下依次加入上述助溶剂，然后再加入90μl无菌水，使得最终NMP的含量为2.5％，PEG400为5％，Tween 80为2.5％，水为90％。
(2)细胞株
人T淋巴癌细胞株Jurkat T购自中科院细胞库。
(3)培养基
RPMI培养基和胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司(Grand Island,NY,USA)。
4、实验设计
实验设计如表2所示。
表2.受试物对人T淋巴癌细胞Jurkat T-NOD-SCID严重免疫缺陷小鼠的异种移植瘤生长抑制作用研究方案
注：NA表示不适用，IV表示静脉注射，QOD表示两天一次，Vehicle表示对照组。
5、实验方法
(1)模型建立
将人T淋巴癌细胞Jurkat T培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基，维持在含5％CO2的37℃饱和湿度培养箱中。
收集对数生长期的Jurkat T细胞，将细胞浓度调整至每毫升5×107个细胞。在无菌条件下，将0.1mL细胞悬液接种至小鼠右侧背部皮下，接种浓度为5×106个细胞/0.1mL/小鼠。
(2)分组及给药观察
在肿瘤生长到可以触摸并且平均体积达到接近50mm3时，将动物按肿瘤体积入组并随机分组。如果肿瘤体积超过或者少于平均体积的25％以上，不进行入组实验。满足这一标准的小鼠有6只，每组三只。分组当日记为Day 1，并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2-3次测定肿瘤体积(按照标准方法)及动物体重，每日观察记录动物临床症状。
实验终点说明：
实验终点：最后一次称量结束后，用CO2对剩余动物实施安乐死。
从图21-22可见，与对照组相比，DHX33抑制剂(化合物D)处理后的小鼠肿瘤有明显的抑制现象。16天药物处理之后，对照组小鼠的肿瘤增长至平均重量达到0.81克左右，而药物组小鼠的肿瘤不可见。****代表两组间有显著差异，P值小于0.001
DHX33抑制剂(化合物D)在通过静脉注射处理小鼠16天的过程中，也对各组小鼠的体重进行的跟踪监测。检测结果如图23所示，结果表明，药物组小鼠没有明显的体重减轻现象，与对照组相比，药物组小鼠的行为和体重均正常。
以上实验数据表明，本发明的DHX33小分子抑制剂对小鼠没有明显毒副作用。