一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用
阅读说明：本技术 一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用 (Pickering emulsion, preparation method thereof and application thereof in preparation of vaccine immunologic adjuvant ) 是由 赵兰华 李忠玉 陈虹亮 舒明艺 于 2021-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及免疫学技术领域,尤其涉及一种pickering乳液及其制备方法和作为疫苗免疫佐剂的应用。本发明制备的GO-SQPickering乳液经稳定性测试和体外评估,显示出良好的稳定性和明显增强的佐剂效果；以CtpORF5重组蛋白疫苗为模式抗原,建立小鼠生殖道抗Ct感染模型,评估了GO-SQPickering佐剂对机体的免疫保护力和安全性,结果显示,本发明提供的GO-SQPickering乳液能够显著增强小鼠体液免疫及细胞免疫,且安全性较高。因此,具有增强免疫反应,提高疫苗免疫保护力的潜在价值。(The invention relates to the technical field of immunology, in particular to pickering emulsion, a preparation method thereof and application of pickering emulsion as a vaccine immunologic adjuvant. The GO-SQPickering emulsion prepared by the invention shows good stability and obviously enhanced adjuvant effect through stability test and in-vitro evaluation; the CtpORF5 recombinant protein vaccine is used as a model antigen to establish a mouse genital tract anti-Ct infection model, and the immune protection and safety of the GO-SQPickering adjuvant on organisms are evaluated, and the result shows that the GO-SQPickering emulsion provided by the invention can obviously enhance the humoral immunity and cellular immunity of mice and has higher safety. Therefore, the vaccine has potential value of enhancing immune response and improving immune protection of the vaccine.)
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种pickering乳液及其制备方法和在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
背景技术
传染性疾病一直是威胁人类健康最大的因素，尤其是新型病原体导致的疾病往往给全球卫生事业带来巨大挑战，给人类生产生活带来严重影响甚至是致命打击。历史上流感、鼠疫等造成的死伤数目触目惊心，本次新型冠状病毒肺炎的爆发再一次让人类惊醒。疫苗作为公认的预防传染性疾病最经济有效的手段再次成为大众焦点。佐剂可降低疫苗用量，增强免疫原性，在疫情爆发时有效应对疫苗产量及供应问题。目前已批准使用的佐剂主要包括铝盐类、乳剂类，Toll样受体激动剂类等。传统铝佐剂虽已广泛应用于多种疫苗，但其只能增强体液免疫不能增强细胞免疫且对亚单位疫苗作用有限，其它佐剂如脂质体、免疫调节物类、寡核苷酸类、多糖类、细胞因子类等目前均尚未实现临床应用，因此探索安全高效的新型佐剂仍是疫苗学研究的重点。
乳液(Emulsion)作为疫苗佐剂已有一定应用基础，目前有MF59、AS02、AS03、AF03等乳液类佐剂被批准用于人体，是除铝佐剂外应用最广泛的佐剂类型。乳液作为佐剂具有以下特征：(1)保护抗原口服乳液类佐剂能提高抗原在胃肠道中的稳定性，保护抗原免遭蛋白酶降解；鼻腔免疫时则能快速加强抗原迁移，避免长时间停留于鼻腔而被降解；(2)增加抗原表面积，调节免疫应答乳滴吸附抗原能增大抗原表面积，从而被抗原提呈细胞识别，并影响免疫反应强度和类型，因此液滴大小、组成成分、分散均匀度等均有可能是影响佐剂效果的因素；(3)缓释抗原纳米颗粒的吸附可促使抗原在注射部位缓慢释放，形成持续的免疫保护，申请者的最新研究发现，纳米乳佐剂以不同方式搭载抗原时，其抗原释放速度差异较大，进而导致佐剂效果大不相同，证明乳液的佐剂作用与抗原缓释密切相关；(4)物化性质优良乳液颗粒分布均匀，低温或常温均可保存；加之制备方法简单，成本较低，适合大规模生产，因而被认为是一种优良的疫苗佐剂。但仍存在以下几方面问题有待解决:
1.安全性有待进一步提高，传统乳液必须依靠表面活性剂稳定油水界面，用于佐剂注射至机体可能引发较强的副反应，因此需寻找适宜的替代物，尽量减少表面活性剂的使用量。2.稳定性有待进一步改善，乳液由于其热力学不稳定性，高温高压时易出现不同程度的破乳，从而影响颗粒完整性和佐剂效果，通常只能以过滤方式除菌。3.免疫增强机制未予阐明，目前研究认为乳液类佐剂通常与免疫细胞募集、抗原摄取有关，并倾向于Th1型免疫反应，与TLR无关，但深层次的免疫应答机制未知。4.具体的剂量、免疫程序和节省抗原的程度未明晰，难以衡量乳液佐剂对疫苗的辅助作用究竟到达何种程度，与目前已批准使用的佐剂对比是否效果更好。因此，提供一种既能避免使用表面活性剂又能稳定油水界面的乳液体系，并将其设计成新型的佐剂具有重要的现实意义。
Pickering乳液是指采用固体粒子稳定油水体系的一种特殊乳液。相较普通乳液，Pickering不需添加表面活性剂，且引入固体粒子的浓度大大低于表面活性剂的用量，对人体和环境的毒害作用远小于表面活性剂，故而安全性可能更高；另外，固体粒子在油水界面发生不可逆吸附，形成的界面膜牢固，可防止液滴聚并，因此Pickering乳液体系不易受外界酸碱性、盐浓度、温度及油相组成的影响，具有更强的稳定性。Xia等构建了基于PLGA粒子稳定的Pickering乳液，发现其佐剂效果明显优于以传统表面活性剂稳定的普通乳液佐剂，且优化的Pickering乳液可激活抗原呈递细胞并增强抗原募集，有效刺激体液和细胞免疫。
沙眼衣原体会引起眼部或生殖器感染，其主要并发症包括致盲性沙眼和生殖功能障碍，例如尿道炎，宫颈炎和输卵管炎，根据世界卫生组织发布的最新估计，每年登记的新病例超过1.3亿。导致生殖后遗症，如盆腔炎(PID)，早产和梗阻性不育。据估计，40％-60％的PID病例和30％的异位妊娠是由沙眼衣原体感染引起的，给人类医疗保健造成巨大的社会经济负担我国自2001年监控以来，报告的Ct病理数目已超过淋病，居8种性传播病原体首位。因此，合理设计一种新型的Pickering乳液作为Ct疫苗佐剂解决普通乳液的安全性和稳定性问题，具有及其重要的价值和意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种pickering乳液及其制备方法和其作为疫苗免疫佐剂中的应用。本发明提供的pickering乳液具有良好的稳定性和明显增强的免疫佐剂效果，且安全性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种pickering乳液的制备方法，包括：
将氧化石墨烯和水混合，得到水相；
以角鲨烯(Squalene,SQ)为油相，将油相和水相混合、超声，得到pickering乳液。
一些实施方案中，所述水相和油相的质量比为10：(1～2)。一些具体实施例中，所述水相和油相的质量比为
一些实施方案中，所述水相中，氧化石墨烯的浓度为1～3mg/mL。一些具体实施例中，氧化石墨烯的浓度为1mg/mL。
本发明中，氧化石墨烯的厚度1-3nm，片径小于5μm。一些具体实施例中，氧化石墨烯的片径具体可为＜15nm、15nm～200nm或0.5μm～5μm。本发明对氧化石墨烯的来源没有特殊限定，可通过市售获得，也可通过本领域的常规方法制得，如Hammer法。
一些实施方案中，所述超声为每间隔5s～15s超声5s～10s，超声的功率为300～400w，超声的总时间为5min～15min。一些具体实施例中，所述超声为每间隔10s超声10s，超声的功率为325w，超声的总时间为10min。
本发明还提供了由以上制备方法制得的pickering乳液。
其中，所述pickering乳液的平均粒径为1049～3239nm。
本发明还提供了所述pickering乳液在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
所述疫苗包括减毒/灭活疫苗、重组蛋白疫苗或核酸疫苗。
一些实施方案中，所述疫苗为沙眼衣原体疫苗。一些具体实施例中，所述沙眼衣原体疫苗具体为pORF5重组蛋白疫苗。
本发明制备的GO-Pickering乳液经稳定性测试和体外评估，显示出良好的稳定性和明显增强的佐剂效果；以CtpORF5重组蛋白疫苗为模式抗原，建立小鼠生殖道抗Ct感染模型，评估了GO-Pickering佐剂对机体的免疫保护力和安全性，结果显示，本发明提供的GO-Pickering乳液能够显著增强小鼠体液免疫，且安全性较高。
1.本发明GO-Pickering乳液的平均粒径为1049～3239nm，其中，GO的准二维结构和巨大的比表面积利于吸附抗原，减缓抗原释放，促进抗原识别和呈递。
2.GO表面有大量含氧官能团，可使不同片层之间相互排斥，因而在水油体系中的分散性良好；同时这些官能团大多具有亲水性，使其易于结合到油乳界面防止液滴聚集，故而本发明GO-Pickering乳液体系不易受pH值、盐浓度、温度及油相组成等因素的影响，注入机体后可保持稳定，实现抗原缓慢释放。
3.GO-SQ Pickering佐剂刺激小鼠产生抗体的滴度是单独疫苗组的10倍以上，且其刺激细胞因子产生水平显著高于铝佐剂组和单独疫苗组。因此，可证明其可辅助诱导小鼠同时产生高水平的体液免疫和细胞免疫，使机体产生良好的免疫保护力，佐剂效果明显强于铝佐剂。
4.本发明GO-Pickering乳液体系中，GO的浓度远远小于表面活性剂的用量，因此可较大程度上降低生物毒性，可有效解决传统乳液佐剂的安全性问题。
附图说明
图1示实施例1～3GO-SQ pickering乳液的形貌观察结果图；1-a从左到右依次为示实施例3、实施例1和实施例2的GO-SQ pickering乳液；1-b为1mg/ml的GO分散液(片径为0.5～5μm)；
图2示实施例1～3GO-SQ pickering乳液的显微镜观察结果，2-a示实施例2的GO-SQ pickering乳液(水/油相比10:1)，2-b示实施例1的GO-SQ pickering乳液(水/油相比10:2)，2-c示实施例3的GO-SQ pickering乳液(水/油相比10:4)，400×；
图3示实施例1～3GO-SQ pickering乳液的马尔文粒度仪检测粒径和均匀度检测结果图；3-a示实施例2的GO-SQ pickering乳液，3-b示实施例1的GO-SQpickering乳液，3-c示实施例3的GO-SQ pickering乳液；
图4示实施例1GO-SQ pickering乳液的抗原缓释吸附的荧光分析结果，其中，4-a为荧光激发下的观察结果，4-b为明场下观察结果；
图5示实施例1的GO-SQ pickering乳液作为pORF5疫苗的免疫佐剂对小鼠进行免疫，lgG抗体水平的检测结果；其中，5-a为第4、6、8周的小鼠体液中IgG的抗体水平；5-b为第8周各组IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平；5-c为不同佐剂剂量的小鼠IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平；
图6示实施例1的GO-SQ pickering乳液作为pORF5疫苗的免疫佐剂的细胞免疫实验结果，6-a～6-c依次为细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-10的表达水平；
图7示实施例9中GO-SQ Pickering(水油相比为10:2)的形貌观察结果，其中，图左示静置6个月后的状态，图右示静置过夜后的状态；
图8示不同片径GO-SQ Pickering的形貌观察结果，8-a～8-c依次为GO片径粒径小于15nm、15nm～200nm、＞500nm的结果；8-a～8-c中，从左至右依次为水相/油相之比为10:1、10:2、10:4的结果；
图9示不同片径GO-SQ Pickering的显微观察结果，从左至右依次为水相/油相之比为10:1、10:2、10:4的结果；
图10示GO-SQ Pickering的安全性评价结果。
具体实施方式
本发明提供了一种pickering乳液及其制备方法和作为疫苗免疫佐剂的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明GO-SQ pickering乳液的制备
将氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO，片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为1mg/mL的水相；
以角鲨烯(Squalene,SQ)为油相，将水相和油相按照质量比10:2的比例混合，在325w功率下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到GO-SQ pickering乳液。形貌观察结果见图1-a，显微镜观察结果见图2-b，(400×),马尔文粒度仪检测粒径和均匀度检测结果见图3-b，经测定GO-SQ Pickering对BSA的包埋率为43％。
实施例2本发明GO-SQ pickering乳液的制备
将氧化石墨烯(片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为1mg/mL的水相；
以角鲨烯为油相，将水相和油相按照10:1的比例混合，在325w功率下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到GO-SQ pickering乳液。形貌观察结果见图1-a，显微镜观察结果见图2-a，(400×),马尔文粒度仪检测粒径和均匀度检测结果见图3-a。
实施例3本发明GO-SQ pickering乳液的制备
将氧化石墨烯(片径为0.5～5μm)和水混合，得到氧化石墨烯浓度为1mg/mL的水相；
以角鲨烯为油相，将水相和油相按照10:4的比例混合，在325w功率下超声10s，间隔10s，如此反复超声，共超声10min，得到GO-SQ pickering乳液。
实施例4GO-SQ pickering乳液的测试和表征
实施例1～3的GO-SQ pickering乳液形貌观察结果见图1，显微镜观察结果见图2，马尔文粒度仪检测粒径和均匀度检测结果见图3；
由图1结果可知，上层为pickering乳液，下层为未结合的GO水分散液，下层颜色较原GO分散液浅，说明GO片层已进入Pickering体系中。随着油相减少，上层pickering乳液也变少，下层的透明度差异明显。
由图2～3可知，实施例1制得的GO-SQ pickering乳液粒径更小更均匀。
实施例5GO-SQ Pickering抗原吸附搭载试验
抗原吸附实验：将GO-SQpickering与FITC-BSA冰上混合4h(混合比例与动物实验一致，1mlpickering乳液中含500ug BSA)，取乳液于荧光显微镜下观察，结果见图4。
结果显示，蛋白吸附于于GO-SQ Pickering乳液液滴的表面，吸附方式搭载疫苗可增强其抗原性，从而易于被免疫系统识别提呈。
实施例6体液免疫检测
每只雌性Balb/c小鼠注射0.1ml含50μgpORF5蛋白的GO-SQ Pickering乳液，以单独pORF5蛋白和铝佐剂组为对照，于0、2、4周免疫三次。取第4、6、8周的小鼠血清间接ELISA法测定IgG的抗体水平(图5-a)，并比较第8周各组IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平(图5-b)，以及不同佐剂剂量的小鼠IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平(图5-c)，结果见表图5。
由以上结果可知，各组小鼠的IgG抗体随免疫时间变化，可以看出，各组小鼠抗体随免疫次数增加基本呈增加趋势，说明该重组蛋白疫苗具有良好的免疫原性，GO-SQPickering佐剂组IgG抗体高于单独疫苗组和生理盐水组，,其IgG抗体滴度约为单独疫苗组的10-100倍。因此GO-SQ Pickering佐剂组均能显著增强小鼠的体液免疫。
初免后第8周即三免后第4周，检测各组小鼠血清中IgG及其亚型IgG1,IgG2a发现，GO-SQ Pickering佐剂组小鼠IgG,IgG1,IgG2a均高于单独疫苗(p>0.05)，数据显示，其IgG抗体滴度是单独疫苗组的10倍以上。表明GO-SQ Pickering佐剂可增强体液免疫，效果基本与铝佐剂组相当。各组小鼠的IgG1平均值高于IgG2a,可据此粗略推断各组佐剂与pORF5重组蛋白疫苗激发机体产生倾向于Th1型的免疫反应。
佐剂5倍稀释后其佐剂与原始佐剂产生的IgG水平无明显差异，因此基于安全性和成本考虑，可采用5倍稀释的Pickering佐剂用于后续实验。
实施例7细胞因子检测
(1)于末次免疫2周后收集小鼠脾淋巴细胞，加入3ml红细胞裂解液充分吹打混匀，室温静置5分钟，加6ml不完全1640培养基终止，4℃、1000g离心5min；弃上清，加入6ml含有双抗(青霉素+链霉素)Hanks液(1:100)充分吹打混匀，4℃、1000g离心5min；
(2)取1ml密度为2×106个/ml的脾淋巴细胞悬液至24孔培养板中，每孔加入10μgpORF5蛋白刺激，充分混匀，37℃、5％CO2培养箱放置48h；
(3)刺激完成后，充分吹打混匀细胞并转移至EP管，4℃、1200g离心10min，收集上清液，-20℃冰箱保存；
根据试剂盒说明书检测培养上清中细胞因子(IFN-γ，IL-10，IL-2)的表达水平。结果见图6。
结果显示，IFN-γ：GO-SQ Pickering佐剂刺激机体产生高水平的IFN-γ，明显高于单独疫苗组及铝佐剂疫苗组，与GO组基本相当(见图6-a)。
IL-2：GO-SQPickering具有明显的刺激作用，可刺激机体产生高水平的IL-2，其平均值约为单独疫苗组的4倍，且明显高于GO组(见图6-b)。
IL-10：GO-SQ Pickering与单独疫苗组对比无明显差异，GO-SQ Pickering组产生免疫抑制因子IL-10低于铝佐剂组，说明GO-SQ Pickering的免疫效果明显强于铝佐剂(见图6-c)。
以上细胞因子水平的比较表明，GO-SQ Pickering佐剂刺激机体产生良好的细胞免疫，其效果强于单独GO组和铝佐剂组。
实施例8不同片径GO-SQ Pickering的性质
利用不同片径的GO制备GO-SQ Pickering，制备方法同实施例1，制得到的GO-SQPickering的形貌观察结果见图8；显微观察结果见图9。
结果显示，片径小于15nm的GO形成的GO-SQ Pickering为乳白色(9-a)，随着GO片径的增大，Pickering乳液逐渐呈现略带棕色(9-b示GO片径为50-200nm，9-c示GO片径为大于500nm)，随着油相增多，上层的Pickering乳液比例逐渐增大。显微观察发现，乳滴大小随油相增加而增大，且随GO片径的增大而增大。
实施例9稳定性测试
(1)离心测试
10000g离心10min，液滴加速浮于上层，大小未有明显变化
(2)高温测试
沸水浴中放置20min,乳液外观无变化，粒子大小及均匀度无变化
(3)冻干测试
真空冷冻干燥后，震动混匀于水中，粒子大小未见变化。
(4)长期稳定性观察
超声结束后GO仍未完全进入乳液层，下层仍成棕色，静置6个月后GO分散到上层Pickering乳液中，使下层较澄清颜色很浅甚至基本完全清亮，但上层乳液的体积及形貌未见明显变化但颜色变得更深，见图7。
结论：从离心、高温、冻干及长期稳定性观察结果可认为GO-SQ Pickering具有良好的稳定性，便于特殊环境下长期保存。
实施例10安全性评价
将Balb/c小鼠(平均体重30g)禁食8h，每只小鼠腹腔一次性注射0.6ml实施例1～3GO-SQ Pickering(最大给药)，观察其活动状态，发现小鼠状态正常，无死亡，7天后解剖小鼠观察脏器，观察GO的分布。其中，实施例1GO-SQ Pickering的结果见图10。
结果显示，本发明Pickering乳液高剂量腹腔注射后，其心脏、肝脏、肺部无明显外观变化，大肠处仍有未吸收的黑色GO，在小鼠皮下形成囊块包裹未能及时吸收代谢的Pickering乳液，避免其游走于腹腔脏器引起损害，另一方面可能形成缓释作用。本发明pickering乳液大大减少了GO的用量，避免了过量GO对机体代谢形成负担，安全性高的同时降低了制备成本。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。