具体实施方式

下面，结合附图以及具体的实施方式对本发明做进一步的描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合成新的实施例。除特殊说明的之外，具体实施方式中实施例与实验例中的设备和试剂材料均从市场途径获得，具体的实施例是示范性的，仅用于解释本申请，而不能理解作为本申请保护范围的限制。

一种靶向药物，所述靶向药物包括含有COMMD10基因片段的质粒。经研究发现，铜代谢基因MURR1结构域-10(COMMD10基因)，能够促进肝癌细胞凋亡，能够抑制肝癌细胞增殖和转移，利用含有COMMD10基因片段的质粒得到的靶向药物，能够进入肝癌细胞，提高肝癌细胞COMMD10基因的表达，进而能够有效的治疗肝癌；同时，本发明的靶向药物，可有效的应用于肝癌的靶向基因治疗，具有良好的安全性，极大的降低毒副作用；此外，COMMD10基因还能够增加放射敏感性，能够作为放射增敏的药物进行应用。

为了进一步提升本发明药物的靶向性能和安全性能，本发明的靶向药物中还包括靶向肽，通过靶向肽的设置和修饰，能够使得靶向肽有效的识别靶向细胞，避免传统药物无法识别靶向细胞而给其他细胞造成不良影响，能够进一步提升药物的疗效。

本发明的靶向药物中，对于包含COMMD10基因片段的质粒，可以采用现有的质粒包载材料进行包载，为了更好的让药物进入细胞和提高安全性能，可以通过纳米复合材料进行包载，对于用于包载质粒的纳米复合材料，可以选用沸石咪唑酯骨架材料(无毒、生物相容性良好)，如沸石咪唑酯骨架材料-8(ZIF-8)；对应的，为了提升对靶向细胞的识别性能，可以对纳米复合材料进行靶向修饰，即将上述质粒与用于识别靶向细胞的靶向肽进行连接，如识别肝癌细胞的靶向肽SP94。

为了进一步提升药物的疗效，可以用光热试剂修饰靶向纳米复合材料，即靶向纳米复合材料中还包括有光热试剂，如选用光热试剂PDA，光热试剂PDA的加入，一方面可以实现肿瘤的光热治疗，另一方面可用于修饰靶向肽。

本发明的靶向药物，对于靶向肽、光热试剂、纳米复合材料以及包含COMMD10基因片段的质粒的具体种类不做特别的限定；本发明中，例举一种选用靶向肽为肝癌靶向肽SP94、光热试剂为PDA、纳米复合材料为沸石咪唑酯骨架材料-8(ZIF-8)组成的靶向药物：[email protected]，上述药物，ZIF-8是一种由锌离子和2-甲基咪唑构建的无毒且具有生物相容性的金属有机框架材料，具有较大的孔径体积、高比表面积，并且在中性环境具有良好的稳定性，该药物在进入人体后释药性能比较缓慢，给药物进入靶向细胞提供了时间上的保障，通过光热试剂的加入，可以结合光热疗法进一步提升对肿瘤细胞的杀伤，而加入的SP94，能够准确识别肝癌细胞，使得药物能够有效进入肝癌细胞内，然后在肝癌细胞内增加COMMD10基因的表达，促进肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的增殖和转移，达到治疗癌症的目的；该药物具有良好的生物相容性、肝癌细胞主动靶向性、基因释放可控性，解决了现有的药物靶点多、疗效低、副作用高等缺点。

本发明提供一种所述的靶向药物的制备方法，包括如下步骤：A、包载质粒；B、连接光热试剂；C、连接靶向肽。

上述靶向药物为[email protected]的制备方法包括如下步骤：

A、包载质粒：取含有COMMD10基因片段的质粒与PEI混合，37℃反应，然后加入2-MIM，常温搅拌；再加入Zn(NO₃)₂·6H₂O，常温搅拌，离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤，得到[email protected]；

B、连接光热试剂：将步骤A得到的[email protected]在乙醇中重悬，然后依次加入盐酸多巴胺、NaOH，常温搅拌，离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤，得到[email protected]；

C、连接靶向肽：将步骤B得到的[email protected]，加入Tris-HCl溶液及SP94多肽，常温搅拌，离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤，得到[email protected]。

实施例1

一种靶向药物，该靶向药物为[email protected]，其中，COMMD10pDNA为包含COMMD10基因片段的质粒，ZIF-8为沸石咪唑酯骨架材料-8，PDA为光热试剂，SP94为肝癌靶向肽；其通过如下步骤制得：

A、包载质粒：取300μL含有COMMD10基因片段的质粒(1.56μg/μL)加入PEI(50μg)中混合，37℃反应30min，然后加入0.4g 2-MIM(预先溶解在1.6mL水中)，常温搅拌10min；再加入0.04g Zn(NO₃)₂·6H₂O(预先溶解在0.16mL水中)，常温搅拌10min，离心(10000r/min)5min，取沉淀物，用蒸馏水洗涤2次，得到[email protected]；

B、连接光热试剂：将步骤A得到的[email protected](20mg)在20mL乙醇中重悬，然后依次加入66.7μL盐酸多巴胺(150mg/mL)、166.7μL NaOH(20mg/mL)，常温搅拌2h，离心(10000r/min)5min，取沉淀物，用蒸馏水洗涤2次，得到[email protected]；

C、连接靶向肽：将步骤B得到的[email protected](10mg)，加入3mLTris-HCl溶液(pH8.5，10mM)及10mg SP94多肽，常温搅拌12h，离心(10000r/min)5min，取沉淀物，用蒸馏水洗涤2次，得到[email protected]；

含有COMMD10基因片段的质粒购自广州复能基因有限公司，为市售公开途径得到，该质粒的核苷酸序列为ATGGCGGTCCCCGCGGCGCTGATCCTACGGGAGAGCCCCAGCATGAAGAAAGCAGTGTCACTGATAAATGCAATAGATACAGGAAGATTTCCACGGTTGCTCACTCGGATTCTTCAAAAACTTCACCTGAAGGCTGAGAGCAGTTTCAGTGAAGAAGAGGAAGAAAAACTTCAAGCGGCATTTTCTCTAGAGAAACAAGATCTTCACCTAGTTCTTGAAACAATATCATTTATTTTAGAACAGGCAGTGTATCACAATGTGAAGCCAGCAGCTTTGCAGCAGCAATTAGAGAACATTCATCTTAGACAAGACAAAGCTGAAGCATTTGTCAATACGTGGTCTTCTATGGGTCAAGAAACAGTTGAAAAGTTCCGGCAGAGAATTCTGGCTCCCTGTAAGCTAGAGACCGTTGGATGGCAGCTTAACCTTCAGATGGCTCACTCTGCTCAAGCAAAACTAAAATCTCCTCAAGCTGTGTTACAACTCGGAGTGAACAATGAAGATTCAAAGAGCCTGGAGAAAGTTCTTGTGGAATTCAGTCACAAGGAGTTGTTTGATTTCTATAACAAGCTAGAGACTATACAAGCACAGCTGGATTCCCTTACATAG。

实验例1

对实施例1制备的[email protected]涉及到的纳米粒复合材料理化性质进行检测：

1)物理形貌及测量Zeta电位

结合图1，在透射电镜下分别观察ZIF-8纳米粒、ZIF-8-PDA-SP94纳米粒，可见二者的颗粒粒径均一，分散性良好，可见用其包载质粒能够使得药物很好的吸收并进入肝癌细胞；

结合图2，纳米粒zeta电位由动态光散射仪(布鲁克海文国家实验室仪器公司)检测ZIF-8纳米粒、ZIF-8-PDA-SP94纳米粒，材料呈负电荷，可延长药物材料在体内的血液半循环时间。

2)X射线光电子能谱(XPS)和X射线衍射(XRD)

结合图3，采用x射线光电子能谱仪(ESCALAB 250Xi，日本)分析ZIF-8纳米粒、ZIF-8-PDA-SP94纳米粒化学组成，图3能够证实ZIF-8-PDA-SP94的纳米粒中PDA修饰成功，并且材料结构稳定；

结合图4，采用x射线衍射仪(Bruker D8，德国)对纳米粒的晶体结构进行分析，图4能够证实在制备过程中ZIF-8晶体形态稳定。

3)光学性能和光热性能

结合图5，采用分光光度计(Infinite M200 PRO多功能酶标仪)检测不同浓度ZIF-8-PDA-SP94纳米粒紫外光谱图，图5显示表明该纳米粒具有较强的光吸收能力，且呈现浓度依赖性；

结合图6，采用红外热像仪(FLK-TI100 9HZ)检测不同浓度纳米粒的光热性能(808nm激光光源激发)，图6显示表明该纳米粒具有优异的光热转换效率，可以达到光热疗法灼烧肿瘤的温度，且呈现浓度依赖性。

4)琼脂糖凝胶电泳

为了展示纳米粒对质粒的保护作用，将含有GFP pDNA的[email protected]纳米粒和游离GFP pDNA分散到PBS溶液中。加入DNase I，37℃孵育30min，然后加入1μL EDTA灭活DNaseI。6000rpm离心5min，收集的纳米结构固体重新悬浮在水溶液中进行琼脂糖凝胶电泳。

为了评价由[email protected]纳米粒保护的GFP pDNA，将DNase I处理后收集的固体重新悬浮到PBS溶液中。加入10μL EDTA完全溶解ZIF-8载体，然后用肝素溶液从纳米粒中完全提取释放出来的GFP pDNA。琼脂糖凝胶电泳分析计算受保护的GFP pDNA。

结合图7，图7表明该纳米粒能够保护药物中所含有的质粒不被DNA酶所降解。其中泳道1为DNA Marker，泳道2和3为DNase I未处理/处理的游离GFP pDNA，泳道4和5为DNaseI未处理/处理的[email protected]纳米粒，泳道6为DNase I处理的[email protected]纳米粒，释放出来的GFP pDNA。

实验例2

对实施例1制备的[email protected]的纳米粒生物学性质进行检测：

1)CCK-8法检测材料安全性

结合图8，利用CCK-8法测试不同浓度的纳米粒细胞存活率的影响，如图8所示，该纳米粒对细胞的存活具有可忽略的影响，证明该纳米粒是一种安全无毒的材料(靶向药物)。

2)免疫荧光实验检测材料细胞摄取

将肝癌细胞接种于12孔板，培养过夜后，与载ICG染料的纳米粒(游离ICG、载ICG无SP94纳米粒组、载ICG有SP94纳米粒组)分别培养1、3、6、12h。PBS洗涤一次后，4％多聚甲醛固定；PBS洗涤三次后，Triton破膜；PBS洗涤后，DAPI核染色，荧光显微镜下观察。其中，DAPI核染色为蓝色荧光，ICG为红色荧光。

结合图9，该纳米粒能够有效被肝癌细胞摄取，且6h摄取最高，经过SP94修饰的纳米粒其被细胞摄取量比未经修饰的更高。

3)定量RT-PCR法及免疫印迹检测纳米粒转染效率

将肝癌细胞接种于六孔板，培养过夜后，与载对照质粒pGFP/COMMD10质粒的纳米粒培养72h后，通过Trizol试剂收取总RNA进行qRT-PCR实验，通过全蛋白提取试剂盒提取总蛋白进行免疫印迹实验。

qRT-PCR实验：根据Premix Ex Taq II(Takara)说明书要求配置PCR反应液，将样品加入到实时PCR专用PCR管后，设置ABI7500(Perkin Elmer/appliedBiosystems)的PCR反应条件为：95℃5s，60℃34s，40cycles。数据按2^-ΔΔCt公式计算出基因的相对表达量。COMMD10和内参GAPDH的逆转录引物购自睿博兴科公司。COMMD10引物：正向：5'-CTCCTCAAGCTGTGTTACAACTC-3'；反向：5'-GGAATCCAGCTGTGCTTGTATAG-3'。GAPDH引物：正向：5'-CCATCAATGACCCCTTCATTGACC-3'；反向：5'-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTTCC-3'。

免疫印迹实验：使用Bio-Rad公司BCA Protein Assay Reagengt Kit进行蛋白定量，煮沸变性后，进行SDS-PAGE电泳至跑出目的蛋白(COMMD10分子量为25KD，GAPDH为37KD)，200mA转膜1h后，5％脱脂牛奶室温孵育，4℃孵育COMMD10抗体(Abcam)及GAPDH抗体(Proteintech)过夜。HRP标记的抗兔及抗鼠二抗(杭州弗德生物有限公司)室温孵育1h后，ECL超敏化学发光试剂(南京凯基生物科技发展有限公司)对条带进行检测。

结合图10，该纳米粒能够有效转染肝癌细胞，提高肝癌细胞中COMMD10基因和相应蛋白的表达量。

实验例3

对COMMD10基因表达对肝癌细胞的作用进行测试：

1)构建稳定低表达COMMD10的HepG2肝癌细胞株

HepG2细胞(购自中国科学院上海细胞研究所细胞库)密度长至70-80％，以2×10⁴/孔接种于24孔板，无抗生素培养基生长过夜。COMMD10低表达及对照组慢病毒各取10⁸TU/ml，均用0.5ml ENi.S.液稀释，加入8mg/ml Polybrene液，转染12h。10％血清浓度DMEM培养48h后，加入0.5mg/ml Puromycin持续筛选10天。

2)稳定低表达COMMD10的HepG2肝癌细胞株的效率验证

结合图11，结果发现，构建的稳定低表达COMMD10 HepG2肝癌细胞株(shCOMMD10)的COMMD10基因及相应蛋白的表达水平均比对照组(Vector)明显降低，相应的稳定株构建成功。

3)COMMD10低表达诱导肝癌HepG2细胞放疗抵抗

用稳定感染Vector和shCOMMD10病毒的HepG2细胞经消化制成单细胞悬液后，按照预定数量接种于六孔板中，设0、2、4、6、8Gy剂量组，每个剂量组3个复孔。照射后将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱内继续培养10-14天。当培养板中出现肉眼可见克隆时，终止培养。PBS清洗2遍，甲醇固定，苏木素染色。显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数。计算克隆形成率和存活分数，并用多靶单击模型拟合曲线。

结合图12，结果表明，COMMD10低表达HepG2肝癌细胞的存活分数明显增加，诱导放疗抵抗。

4)COMMD10对肝癌细胞凋亡的影响

将细胞均匀铺在六孔板中，通过lipo2000转染COMMD10的对照及敲低干扰片段，转染6h后将细胞培养液换成新鲜培养液。转染48h后，将收集到的细胞用FITC-Annexin V/PI凋亡试剂盒(南京凯基生物有限公司)染色细胞。用流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡情况。

结合图13，结果表明，干扰COMMD10表达后肝癌细胞凋亡明显减少。

5)构建裸鼠皮下瘤放疗模型

把已构建好的稳定感染Vector和shCOMMD10病毒的HepG2肿瘤细胞注射到裸鼠背部。观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积长到150mm³大小随机分为照射组(IR)和非照射组(NoIR)两大组，各大组均包含Vector、shCOMMD10两小组。在第14天和第21天照射组(IR)裸鼠在同时间照射6Gy X射线，实验期间每3天测量一次肿瘤大小。

结合图14-图17，结果表明，到实验终点41天时，在非照射组(No IR)中，shCOMMD10组(1351.72±100.13)肿瘤体积较Vector组(325.11±63.68)明显增大，shCOMMD10/Vector比值为4.16。而在照射组(IR)中，shCOMMD10组(927.33±91.47)与Vector组(129.87±45.47)肿瘤体积比值比非照射组(No IR)进一步增大(shCOMMD10/Vector比值为7.14)。说明COMMD10低表达能够促进裸鼠放疗后皮下瘤生长，诱导肝癌细胞HepG2放疗抵抗。

综上所述，COMMD10基因的表达与肝癌细胞生长、增殖呈负相关性，COMMD10基因低表达，能够提升肝癌细胞的活性、诱导肝癌细胞放疗抵抗；COMMD10基因高表达，能够降低肝癌细胞的活性及抑制其增殖。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。