具体实施方式

本公开文本提供了用于确定表现出肺炎样症状的患者是否将受益于用抑制军团菌属物种和/或嗜肺军团菌的治疗剂进行的治疗的方法。这些方法是基于通过使用实时PCR分别测定ssrA和16S rRNA靶核酸的存在来检测生物样品中的军团菌属物种和/或嗜肺军团菌。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供适于扩增ssrA靶核酸的第一引物对；提供适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；扩增ssrA靶核酸和16S rRNA靶核酸，如果存在的话；以及检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；其中ssrA靶核酸的存在鉴定出至少一种军团菌属物种的存在，并且16S rRNA靶核酸的存在鉴定出嗜肺军团菌的存在。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文所用，除非另外说明，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数提及物。因此，例如，提及“寡核苷酸”包括多个寡核苷酸分子，并且提及“核酸”是提及一种或多种核酸。

如本文所用，除非另外说明或根据上下文另外明显，否则关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％-10％范围内的数字。

如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增(amplify)”或“扩增(amplification)”是指增加样品中核酸序列群体的表现的方法。扩增反应中在体外产生的特定靶核酸序列的拷贝称为“扩增子”或“扩增产物”。扩增可以是指数的或线性的。靶核酸可以是DNA(例如像基因组DNA和cDNA)或RNA。虽然下文所述的示例性方法涉及使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，但熟练技术人员熟知多种其他方法，如等温法、滚环法等。熟练技术人员应理解，这些其他方法可以代替PCR方法来使用或与PCR方法一起使用。参见例如，Saiki,“Amplificationof Genomic DNA”,PCR Protocols,Innis等人编辑,Academic Press,San Diego,CA 1990,第13-20页；Wharam等人,Nucleic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)。

如本文所用的“扩增混合物”是用于核酸扩增反应的试剂混合物，但是不含引物或样品。扩增混合物包含缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。扩增混合物可以还包含MgCl₂、KCl、非离子型和离子型洗涤剂(包括阳离子型洗涤剂)中的至少一种。

“扩增主混合物”包含用于扩增一种或多种靶核酸的扩增混合物和引物，但是不含待扩增的样品。

如本文关于多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸或靶核酸)所用的术语“互补体”、“互补的”或“互补性”是指Watson/Crick碱基配对规则。如本文所用的核酸序列的互补体是指如下寡核苷酸，其在与核酸序列比对以使一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时，呈“反平行缔合”。例如，序列“5'-A-G-T-3’”与序列“3’-T-C-A-5’”互补。在本文所述的核酸中可以包括天然存在的核酸中通常不存在的某些碱基。这些碱基包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性无需完美；稳定双链体可以含有错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以在考虑多个变量后凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。互补体序列还可以是与DNA序列或其互补体序列互补的RNA序列，并且还可以是cDNA。

如本文所用的术语“基本上互补”意指，两个序列在严格杂交条件下杂交。熟练技术人员应理解，基本上互补的序列无需沿其整个长度杂交。具体地，基本上互补的序列可以包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，定位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3'或5'。

如本文所用，分析物的“循环阈值”(Ct)是如下PCR循环，荧光信号在所述循环跨过指定荧光阈值。Ct取决于扩增反应效率，包括开始模板拷贝数、生物体裂解、PCR扩增、荧光探针的杂交或切割以及检测灵敏度。Ct提供了PCR反应中的靶核酸浓度的相对量度。除了靶核酸浓度以外的许多因素可以影响Ct的绝对值。然而，来自反应混合物或仪器的改变与Ct计算相关的荧光测量的假象将导致Ct值的与模板无关的变化。

如本文所用，术语“检测”是指确定样品中靶核酸的存在。检测不要求方法提供100％灵敏度和/或100％特异性。

如本文所用，术语“直接扩增”是指如下核酸扩增反应，其中在不进行预先纯化、提取或浓缩的情况下从样品中扩增靶核酸。

如本文所用，术语“提取”是指为从样品中存在的其他(非核酸)材料取出核酸而采取的任何动作。术语提取包括机械或化学裂解、添加洗涤剂或蛋白酶或者沉淀并移除非核酸(如蛋白质)。

如本文所用的术语“荧光团”是指吸收特定波长(激发频率)的光，随后发射较长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用的术语“供体荧光团”意指如下荧光团，其在紧密靠近淬灭剂部分时，向淬灭剂贡献或转移发射能量。由于向淬灭剂部分贡献了能量，因此与在不存在紧密定位的淬灭剂部分的情况下发射的光相比，供体荧光团自身将在特定发射频率下发射较少的光。

如本文所用的术语“杂交”是指两个基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的延伸段上至少约65％互补、至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此退火，以通过在互补碱基对之间形成氢键而形成双链体或异源双链体的过程。杂交典型地且优选地是用探针长度的核酸分子(优选地长度为15-100个核苷酸，更优选地长度为18-50个核苷酸)来进行。核酸杂交技术是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性和所形成杂交体的热熔点(T_m)等因素的影响。本领域技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格性，使得具有至少所需互补水平的序列将稳定杂交，而具有较低互补性的序列将不会杂交。关于杂交条件和参数的例子，参见例如Sambrook等人,1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等人1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.。在一些实施方案中，特异性杂交发生在严格杂交条件下。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如，探针或引物)将与靶核酸在合适条件下“杂交”。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一个优选实施方案中，个体、患者或受试者是人。

如本文所用，术语“多重PCR”是指在同一反应容器内同时产生两种或更多种PCR产物或扩增子。每种PCR产物使用不同引物对来引发。多重反应可以还包括每种产物的特异性探针，所述探针用不同的可检测部分标记。

如本文所用，“寡核苷酸”是指在主要以限定间隔包含相同单体单元的主链上具有核酸碱基序列的分子。碱基在主链上的排列方式使得其可以与具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见寡核苷酸具有磷酸糖单元的主链。可以区分不具有2'位羟基的寡脱氧核糖核苷酸与具有2'位羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可以包括如下衍生物，其中羟基中的氢被有机基团(例如，烯丙基)替代。用作引物或探针的寡核苷酸通常长度为至少约10-15个核苷酸，或长度为多达约70、100、110、150或200个核苷酸，更优选地长度为至少约15至25个核苷酸。用作特异性扩增或特异性检测特定靶核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能够与靶核酸特异性杂交。

如本文所用，“军团菌属物种(Legionella species)”或“军团菌属物种(Legionella sp.)”是指军团菌属的任何微生物生物体。在一些实施方案中，军团菌属物种是致病性的，并且能够在受试者(例如，人)中引起肺炎、军团病、庞蒂亚克热或相关病症。特定的病原体包括例如茴芹军团菌(L.anisa)、伯明翰军团菌(L.birminghamensis)、博兹曼军团菌(L.bozemanii)(血清群1)、博兹曼军团菌(血清群2)、卡迪卡军团菌(L.cardiaca)、彻氏军团菌(L.cherrii)、辛辛那提军团菌(L.cincinnatiensis)、克莱姆森军团菌(L.clemsonensis)、杜莫夫军团菌(L.dumoffii)、菲氏军团菌(L.feeleii)(血清群1)、菲氏军团菌(血清群2)、戈尔曼尼军团菌(L.gormanii)、哈开里军团菌(L.hackeliae)(血清群1)、哈开里军团菌(血清群2)、佐丹军团菌(L.jordanis)、兰辛军团菌(L.lansingensis)、长滩军团菌(L.longbeachae)(血清群1)、长滩军团菌(血清群2)、马氏军团菌(L.maceachernii)、米克戴德军团菌(L.micdadei)、橡树岭军团菌(L.oakridgensis)、巴黎军团菌(L.parisiensis)、嗜肺军团菌(费城1)、嗜肺军团菌(诺克斯维尔1)、嗜肺军团菌(贝尼多姆030E)、嗜肺军团菌(法国5811)、嗜肺军团菌(艾伦镇1)、嗜肺军团菌(OLDA)、嗜肺军团菌(牛津4032E)、嗜肺军团菌(贝灵翰姆)、嗜肺军团菌(希舍姆1)、嗜肺军团菌(坎普尔顿1)、嗜肺军团菌(托乌什(Togus)1)、嗜肺军团菌(布卢明顿2)、嗜肺军团菌(洛杉矶)、嗜肺军团菌(波特兰1)、嗜肺军团菌(达拉斯1E)、嗜肺军团菌(剑桥1)、嗜肺军团菌(芝加哥1)、嗜肺军团菌(芝加哥8)、嗜肺军团菌(康科德3)、嗜肺军团菌(IN-23-G1-C2)、嗜肺军团菌(莱顿1)、嗜肺军团菌(797-PA-H)、嗜肺军团菌(570-CO-H)、嗜肺军团菌(82A3105)、嗜肺军团菌(1169-MN-H)、嗜肺军团菌(兰辛3)、红光军团菌(L.rubrilucens)、圣赫伦斯军团菌(L.sainthelensi)(血清群1)、圣赫伦斯军团菌(血清群2)、图森军团菌(L.tucsonensis)和瓦茨瓦尔西军团菌(L.wadsworthii)。

如本文所用的“阳性对照核酸”或“内部阳性扩增对照”是已知以一定量或水平存在于样品中的核酸。在一些实施方案中，在所公开的用于检测样品中致病性军团菌属物种的存在的方法中，阳性对照核酸并不天然存在于样品中，而是在使反应-样品混合物进行实时聚合酶链式反应之前添加到样品中的。

如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，其在置于诱导与靶核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时能够用作核酸序列合成的起始点，所述条件即在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中的不同核苷酸三磷酸和聚合酶存在下以及合适温度下。引物中的一个或多个核苷酸可以例如通过添加甲基、生物素或地高辛部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰。引物序列无需反映模板的准确序列。例如，非互补核苷酸片段可以附接至引物的5'端，引物序列的其余部分与所述链基本上互补。如本文所用的术语引物包括可以合成的所有引物形式，包括肽核酸引物、锁核酸引物、经硫代磷酸酯修饰的引物、经标记的引物等。如本文所用的术语“正向引物”意指退火到双链DNA(dsDNA)的反义链的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正义链。

引物典型地长度为至少10、15、18或30个核苷酸，或长度为多达约100、110、125或200个核苷酸。在一些实施方案中，引物优选地长度在约15至约60个核苷酸之间，最优选地长度在约25至约40个核苷酸之间。在一些实施方案中，引物长度为15至35个核苷酸。对于最佳的杂交或聚合酶链式反应扩增，没有标准长度。用于特定引物应用的最佳长度可以以H.Erlich,PCR Technology,Principles and Application for DNA Amplification,(1989)中所述的方式容易地确定。

“引物延伸反应”是指如下合成反应，其中寡核苷酸引物与靶核酸杂交，并且通过个别互补核苷酸的聚合酶依赖性3'加成产生靶核酸的互补拷贝。在一些实施方案中，引物延伸反应是PCR。

如本文所用，术语“引物对”是指可以一起用于扩增目标核酸的给定区域的正向和反向引物对(即左侧和右侧引物对)。

如本文所用的“探针”是指与靶核酸经由杂交相互作用的核酸。探针可以与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平通常将基于探针的功能取决于许多因素。可以以本领域熟知的多种方式中的任一种标记或不标记或者修饰探针。探针可以与靶核酸特异性杂交。探针可以是DNA、RNA或RNA/DNA杂交体。探针可以是寡核苷酸、人工染色体、成碎片的人工染色体、基因组核酸、成碎片的基因组核酸、RNA、重组核酸、成碎片的重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环杂环的寡聚体或核酸的缀合物。探针可以包含经修饰的核碱基、经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间连接。可以使用探针来检测甲基化靶核酸的存在或不存在。探针典型地长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。

如本文所用的“探针元件”是指核苷酸的延伸段，其(a)与引物缔合，其中所述延伸段与引物核酸序列连接或与引物核酸序列相邻定位，并且(b)在严格条件下与待检测的靶核酸序列特异性杂交。

如本文所用，术语“引物-探针检测系统”是指用于实时PCR的方法。在一些实施方案中，所述系统是基于Taqman的PCR系统和/或基于SCORPION的PCR系统。在一些实施方案中，引物-探针检测系统包含至少一种正向引物、至少一种反向引物和至少一种寡核苷酸探针。在一些实施方案中，寡核苷酸探针是可检测地标记的。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含可检测标记和淬灭剂部分。

如本文所用的术语“淬灭剂部分”意指紧密靠近供体荧光团的分子，其吸收供体产生的发射能量，并且使能量以热量形式耗散或发射波长长于供体发射波长的光。在后一种情况下，淬灭剂被视为受体荧光团。淬灭部分可以经由靠近(即碰撞)淬灭或通过或荧光共振能量转移(“FRET”)来起作用。通过FRET淬灭通常用于探针中，而靠近淬灭用于分子信标和Scorpion^TM型探针中。淬灭剂的非限制性例子包括TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。

如本文所用的“反应-样品混合物”是指含有扩增主混合物和样品的混合物。

如本文所用，术语“样品”是指从患者或分离的微生物获得的临床样品。在优选实施方案中，从生物来源获得样品(即“生物样品”)，如从受试者收集的组织、体液或微生物。样品来源包括但不限于粘液、痰液(处理或未处理)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗液(BW)、血液、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如，活检材料)。优选的样品来源包括BAL、BW和/或咽拭子或鼻洗液。

如本文关于本发明技术的方法所用的术语“灵敏度”是方法在异质序列群体中检测预选序列变体的能力的量度。如果给定样品中预选序列变体以样品中序列的至少F％存在，方法可以以C％的预选置信度、S％的次数检测到预选序列，则所述方法对F％的变体具有S％的灵敏度。举例而言，如果给定样品中预选变体序列以样品中序列的至少5％存在，方法可以以99％的预选置信度、10次有9次检测到预选序列(F＝5％；C＝99％；S＝90％)，则所述方法对5％的变体具有90％的灵敏度。示例性灵敏度包括至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％。

如本文关于寡核苷酸引物所用的术语“特异性”意指，在比对所述寡核苷酸与待扩增的核酸时，引物的核苷酸序列与所述核酸的一部分具有至少12个碱基的序列同一性。对核酸具有特异性的寡核苷酸引物是在严格杂交或洗涤条件下能够与目标靶标杂交并且基本上不与非目标核酸杂交的引物。更高水平的序列同一性是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少85％-95％、更优选地至少98％的序列同一性。可以使用采用本领域熟知算法的市售计算机程序以默认设置来确定序列同一性。如本文所用，具有“高序列同一性”的序列至少在约50％的所比对核苷酸位置处、优选地至少在约60％的所比对核苷酸位置处、更优选地至少在约75％的所比对核苷酸位置处具有相同的核苷酸。

如本文所用，“特异性”是方法辨别真实存在的预选序列变体与测序假象或其他密切相关序列的能力的量度。它是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可能由以下引起：在样品制备期间引入目标序列中的错误、测序误差或密切相关序列(如假基因或基因家族成员)的疏忽测序。如果在应用于N_总个序列的样品集时，其中X_真实序列是真实变体并且X_非真实是非真实变体，方法选择了非真实变体中的至少X％为非变体，则所述方法具有X％的特异性。例如，如果在应用于1,000个序列的样品集时，其中500个序列是真实变体并且500个是非真实变体，方法选择了500个非真实变体序列中的90％为非变体，则所述方法具有90％的特异性。示例性特异性包括至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％。

如本文所用的术语“严格杂交条件”是指至少像以下一样严格的杂交条件：在50％甲酰胺、5x SSC、50mM NaH₂PO4(pH 6.8)、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5xDenhart's溶液中在42℃下杂交过夜；用2x SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤；并且用0.2x SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤。在另一个例子中，严格杂交条件应当不允许两个在20个连续核苷酸的延伸段上相差超过两个碱基的核酸杂交。

如本文所用，“PCR检测系统”是指用于实时PCR的方法。在这种方法中，在扩增主混合物中包括与经扩增的核酸区段杂交的探针。探针在探针任一端上包含彼此足够靠近的供体和淬灭剂荧光团，使得淬灭剂吸收供体的荧光。然而，在探针与经扩增的区段杂交时，Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性切割探针，从而允许供体荧光团发射可以被检测到的荧光。

如本文所用的术语“靶核酸”或“靶序列”是指待分析样品中待检测和/或定量的目标核酸序列。靶核酸可以由以下构成：染色体区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分或针对其设计探针或引物的核酸序列。靶核酸可以包括一个或多个野生型序列、突变、缺失、插入或重复、串联重复元件、目标基因、目标基因区域或所述区域的任何上游或下游区域。靶核酸可以代表特定基因的可替代序列或等位基因。靶核酸可以源自基因组DNA、cDNA或RNA。

生物样品收集和制备

本发明技术的方法和组合物可用于通过测定从受试者获得的生物样品中对应于ssrA基因和16S rRNA基因的靶核酸序列来检测致病性军团菌属物种。用于致病性军团菌属物种检测的样品还可以包括在适当的培养基上生长以形成菌落的细菌分离物的培养物，其中所述培养物是从受试者获得的生物样品制备的。

本文所公开的方法可用于检测和定量源自无菌和/或非无菌部位的生物样品中的致病性军团菌属物种。“无菌部位”包括体液如全血、血浆、无细胞血浆、尿液、脑脊液、滑液、胸膜液、心包液、眼内液、组织活检或气管内抽吸物。如本文所用，“无细胞血浆”是指含有按体积计少于1％细胞的血浆。“非无菌部位”包括痰液、粪便、皮肤拭子、腹股沟拭子、鼻拭子和咽拭子。在一些实施方案中，生物样品包括鼻咽(NP)抽吸物或拭子或者鼻洗液。在其他实施方案中，生物样品包括在适当的培养基上生长以形成菌落的分离细菌的培养物。样品还可以包括细菌分离物。

在一些实施方案中，所述样品在含有VCM或M4培养基的无菌小瓶中运输或储存。VCM培养基包含汉克平衡盐、牛血清白蛋白、L-半胱氨酸、明胶、蔗糖、L-谷氨酸、HEPES缓冲液、万古霉素、两性霉素B、粘菌素和任选的酚红。M4培养基包含明胶、万古霉素、两性霉素B和粘菌素。

生物样品可能被怀疑含有致病性军团菌属物种和/或一种或多种致病性军团菌属物种的核酸。另外，生物样品可以从被怀疑感染了一种或多种致病性军团菌属物种的受试者获得。可以使生物样品与用于微流体/微电子离心平台的扩增主混合物接触。

在一些实施方案中，所公开的方法采用未经处理的生物样品，从而产生直接的、简化的样品到结果过程。在其他实施方案中，如果用于根据本领域技术人员熟知的任何方法从生物样品纯化的经分离的核酸(DNA或RNA)，本文所公开的检测方法将是有效的。如果需要，可以通过离心等收集或浓缩样品。可以诸如通过酶处理、热表面活性剂处理、超声处理或其组合，对样品的细胞进行裂解。可替代地，可以使用市售核酸提取试剂盒来处理生物样品。

在一些实施方案中，在与生物样品接触之前，扩增主混合物中存在一个或多个引物对，所述扩增主混合物还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。ssrA基因和16S rRNA基因的扩增优选地以多重形式发生。可替代地，还可以使用用于每个靶序列的个别PCR反应。可以使生物样品与所述一个或多个引物对和/或与扩增主混合物在直接扩增盘中接触以形成反应-样品混合物。例如，可以使生物样品与扩增主混合物在直接扩增盘(如FocusDiagnostics,Inc.(美国加利福尼亚州赛普拉斯)出售的直接扩增盘)中接触，作为SIMPLEXA直接实时PCR测定的一部分，以与3M^TM集成循环仪协同工作。直接扩增盘是圆形薄盘，含有多个指定区域，每个指定区域含有用于接收扩增主混合物的孔和用于接收未经处理的患者样品的关联孔。在添加扩增主混合物和样品时或在添加后，在直接扩增盘中产生样品-反应混合物。

在一些实施方案中，生物样品是从受试者分离的。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是牛、马、猪、猫、犬、鼠、猿猴、大鼠或人。在一些实施方案中，受试者是人。在特定实施方案中，受试者是具有一种或多种肺炎样症状的人类患者。

实时PCR

可以通过本领域熟知的多种方法中的任一种(如凝胶电泳、柱色谱、与探针杂交、测序、熔融曲线分析或“实时”检测)来检测靶核酸的扩增。

为了进行实时检测，可以可检测地标记引物和/或探针，以允许在掺入引物时或在探针例如杂交并且扩增时在能够监测反应期间的荧光变化的仪器中发现荧光差异。用于核酸扩增的实时检测方法是熟知的，并且包括例如系统、Scorpion^TM引物系统和将嵌入染料用于双链核酸。

在实时定量PCR中，在靶DNA的标准稀释液和含有未知量靶DNA的样品两者中连续测量扩增产物的积累。通过将标准样品中的初始模板浓度与产生特定阈值浓度的产物所需的PCR^TM循环(Ct)数相关联来构建标准曲线。在测试样品中，在相同的Ct之后测量靶PCR^TM产物积累，这允许从标准曲线内插靶DNA浓度。

在一些实施方案中，通过与特异性探针杂交来检测经扩增的核酸。可以使用与经扩增的靶序列的一部分互补的探针寡核苷酸来检测经扩增的片段。在一些实施例中，可以实时检测杂交。在一个替代实施方案中，未实时检测杂交。可以同时检测(即在同一个反应容器中，如多重PCR)或单独检测(即在单独的反应容器中)每个靶序列中的经扩增的核酸。在某些实施方案中，使用两种或更多种可辨别标记(例如，经由不同的可检测部分，如颜色)的基因特异性寡核苷酸探针同时检测多个靶核酸，其中一种探针与第一靶序列杂交，并且另一种探针与第二靶序列杂交。

在一些实施方案中，用不同的可辨别可检测部分标记不同引物对。因此，例如，HEX和FAM荧光染料可以存在于多重PCR中的不同引物对上并且与所得扩增子缔合。在其他实施方案中，用一种可检测部分标记正向引物，而用不同的可检测部分标记反向引物，例如将FAM染料用于正向引物并且将HEX染料用于反向引物。使用不同的可检测部分可用于区分长度相同或长度极类似的经扩增的产物。

对于序列经修饰的核酸，靶标可以独立地选自顶部链或底部链。因此，所有待检测的靶标都可以包含顶部链、底部链或顶部链与底部链靶标的组合。

一种用于实时PCR的通用方法使用荧光探针，如探针、分子信标和Scorpion引物-探针。与检测经扩增的最终产物的量的其他形式的定量PCR相比，实时PCR以更高特异性、灵敏度和再现性对模板的初始量进行定量。实时PCR不检测扩增子的尺寸。Scorpion^TM和技术中采用的探针是基于荧光淬灭原理并且涉及供体荧光团和淬灭部分。

使用能够检测PCR扩增产物积累的任何合适的仪器来进行实时PCR。最通常地，所述仪器能够检测来自一种或多种荧光标记的荧光。例如，仪器(例如，ABI实时PCR系统序列检测器)上的实时检测在每个PCR循环期间监测荧光并且计算报告信号的测量值或Rn值。阈值循环或Ct值是荧光与阈值相交的循环。可以通过序列检测系统软件或手动确定阈值。

在一些实施方案中，所采用的探针被可检测地标记，并且通过检测每种扩增产物的探针标记来完成检测。淬灭剂可以进一步与可检测标记缔合，这防止在探针的靶标扩增之前检测到所述标记。探针是此类探针的例子。

探针(Heid等人,Genome Res.6:986-994,1996)使用Taq聚合酶的荧光5'核酸外切酶活性来测量DNA样品中靶序列的量。探针是含有通常在5'碱基处或附近的供体荧光团和典型地在3'碱基处或附近的淬灭部分的寡核苷酸。淬灭剂部分可以是染料，如TAMRA；或者可以是非荧光分子，如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等人,16Nature Biotechnology 49-53(1998)。在被辐照时，受激发的荧光供体通过FRET而非发荧光将能量转移到附近的淬灭部分。因此，供体与淬灭剂紧密靠近防止供体荧光在探针完整时发射。

探针被设计成退火到PCR产物的内部区域。在聚合酶复制探针结合于其上的模板时，其5'核酸外切酶活性切割探针。这终止了淬灭剂的活性(无FRET)，并且供体荧光团开始发射荧光，所述荧光在每个循环中与探针切割率成比例地增加。通过监测报告染料荧光的增加来检测PCR产物的积累。如果淬灭剂是受体荧光团，则可以通过监测受体荧光团荧光的减少来检测PCR产物的积累。

在某些实施方案中，使用双功能引物-探针检测系统(例如，Scorpion^TM引物)来进行实时PCR。在Scorpion引物的情况下，使用单个分子实现序列特异性引发和PCR产物检测。Scorpion引物维持呈未杂交状态的茎-环构型。荧光团附接至5'端并且被与3'端偶联的部分淬灭，但是在某些实施方案中，可以转换这种安排。茎和/或环的3'部分还含有与引物的延伸产物互补并且经由不可扩增单体与特异性引物的5'端连接的序列。在引物部分延伸之后，特异性探针序列能够结合经延伸的扩增子内的其互补体，从而打开发夹环。这防止荧光被淬灭，并且观察到信号。通过反向引物和Scorpion^TM引物的引物部分扩增特定靶标，从而产生延伸产物。由于通过Scorpion^TM引物的探针元件与延伸产物结合引起的荧光团与淬灭剂分离，所以产生了荧光信号。

在一些实施方案中，所公开的方法中采用的探针包含被设计成检测具有遗传变异的DNA序列区段的短荧光标记DNA序列或由其组成，如French等人,Mol Cell Probes,5(6):363-74(2001)(通过引用以其整体并入本文)中披露的探针。是这类探针的例子。

在所述方法的一些实施方案中，扩增反应中每个引物对的至少一个引物或至少一个探针包含可检测部分。可替代地，可检测部分可以在附接至引物的探针上，如与引物-探针一起。在一些实施方案中，可检测部分或标记是荧光团。合适的荧光部分包括但不限于以下荧光团：4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸基茋-2,2'二磺酸、吖啶和衍生物(吖啶、吖啶异硫氰酸酯)、Alexa Fluor(Alexa350、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647(Molecular Probes))、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯(萤虫黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、R-6G、530/550、FL、亮黄、Cal Fluor Red(CFR610)、香豆素和衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))、四氯四溴荧光素钠(cyanosine)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5',5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、二亚乙基三胺五乙酸盐、4,4'-二异硫氰酸基二氢-茋-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸基茋-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)、EclipseTM(Epoch BiosciencesInc.)、曙红和衍生物(曙红、曙红异硫氰酸酯)、赤藓红和衍生物(赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯)、乙锭、荧光素和衍生物(5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET))、荧光胺、IR144、IR1446、镧系磷光体、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副玫瑰苯胺、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、Oregon碘化丙锭、芘和衍生物(芘、芘丁酸酯、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯)、7、9、21、35(Molecular Probes)、活性红4(亮红3B-A)、罗丹明和衍生物(6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物、Quasar以及

基于特定荧光团的荧光光谱来选择合适的淬灭剂。有用的淬灭剂包括例如BlackHole^TM淬灭剂BHQ-1、BHQ 2和BHQ-3(Biosearch Technologies,Inc.)以及ATTO系列淬灭剂(ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO612Q；Atto-Tec GmbH)。

在所述方法的一些实施方案中，使反应-样品混合物经受实时聚合酶链式反应(PCR)条件，在所述条件下，存在于生物样品中的每个靶核酸发生扩增，并且检测和测量所述一种或多种扩增产物。在一些实施方案中，在不进行单独的前端标本制备的情况下将生物样品直接加载到直接扩增盘中，之后在同一盘中对靶分析物进行实时PCR检测和区别。在某些实施方案中，扩增是在直接扩增盘(8孔盘，来自Focus Diagnostics,Inc.)中进行的。在一些实施方案中，使用SIMPLEXA直接测定在直接扩增盘来进行实时PCR扩增，并且使用集成热循环仪(如由3M(美国明尼苏达州圣保罗)出售的3M^TM集成循环仪)来进行检测。3M^TM集成循环仪可以接收直接扩增盘并且能够在每个盘上进行多个测定。这种设备可以以>5℃/秒加热并且以>4℃/秒冷却。循环参数可以改变，这取决于待延伸的扩增产物的长度。在某些实施方案中，在样品中可以包括内部阳性扩增对照(IPC)，利用寡核苷酸引物、探针和/或引物-探针。

检测靶核酸的替代方法

可替代地，靶核酸的检测可以通过测量反应终点来进行。在终点检测中，可以通过如下方式来检测所述一个或多个扩增子：首先对扩增子进行尺寸分离，然后检测经尺寸分离的扩增子。可以通过凝胶电泳、柱色谱、毛细管电泳或本领域已知的其他分离方法来完成不同尺寸扩增子的分离。

可以将可检测标记掺入核酸中，与核酸缔合或与核酸缀合。标记可以通过不同长度的间隔臂附接，以减少潜在的位阻或对其他有用或所需特性的影响。参见例如，Mansfield,9Mol.Cell.Probes 145-156(1995)。可以通过共价或非共价方式(例如通过转录，如通过使用Klenow聚合酶进行随机引物标记，或切口平移，或扩增或如本领域已知的等效方式)将可检测标记掺入核酸中。例如，使核苷酸碱基与可检测部分(如荧光染料)缀合，然后在核酸合成或扩增期间掺入核酸中。

帮助检测靶核酸的其他有用标记的例子包括放射性同位素(例如，³²P、³⁵S、³H、¹⁴C、¹²⁵I、¹³¹I)、电子致密试剂(例如，金)、酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如，胶体金)、磁性标记(例如，Dynabeads^TM)、生物素、地高辛或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。其他标记包括能够分别与相应受体或寡核苷酸互补体形成复合物的配体或寡核苷酸。可以将标记直接掺入待检测的核酸中，或者可以使标记附接至与待检测的核酸杂交或结合的探针(例如，寡核苷酸)或抗体。

在其他实施方案中，可以使用荧光核苷酸类似物来标记核酸，参见例如Jameson,Methods.Enzymol.278:363-390(1997)；Zhu,Nucl.Acids Res.22:3418-3422(1994)。美国专利号5,652,099和6,268,132也描述了用于经由酶或化学合成掺入核酸(例如，DNA和/或RNA)或寡核苷酸中以产生荧光寡核苷酸的核苷类似物。美国专利号5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁和四苯并三氮杂卟啉试剂。

在一些实施方案中，可以将可检测地标记的探针用于杂交测定中，所述测定包括但不限于RNA印迹、DNA印迹、微阵列、斑点或槽印迹以及原位杂交测定(如荧光原位杂交(FISH))，以检测生物样品内的靶核酸序列。某些实施方案可以采用用于测量多核苷酸基因产物(如mRNA)的表达的杂交方法。本领域中已经充分开发出用于进行多核苷酸杂交测定的方法。杂交测定程序和条件将根据应用而改变，并且根据已知通用结合方法加以选择，所述方法包括以下文献中所提到的方法：Maniatis等人Molecular Cloning:ALaboratoryManual(第2版Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Berger和Kimmel Methods inEnzymology,第152卷,Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif,1987)；Young和Davis,PNAS.80:1194(1983)。

本发明技术的军团菌属筛选测定

在本公开文本的各个实施方案中，引物和探针在本文所述的方法中用于扩增和检测致病性军团菌属物种的靶核酸序列。在某些实施方案中，靶核酸可以包括来自所有军团菌属物种的ssrA基因和来自嗜肺军团菌的16S rRNA基因。另外，引物还可以用于扩增一个或多个对照核酸序列。

本发明技术的引物和探针在本文所述的方法中用于扩增和检测对应于ssrA基因的包含SEQ ID NO:7的靶核酸和对应于16S rRNA基因的包含SEQ ID NO:8的靶核酸。在一个实施方案中，所述方法涉及采用特异性针对ssrA和16S rRNA基因的引物对。本文所述的靶核酸可以利用用于每个靶标的个别标记单独检测或以多重形式检测。

用于扩增和检测对嗜肺军团菌具有特异性的标记物基因的全部或片段的特异性引物、探针和引物-探针包括针对嗜肺军团菌中存在但在其他军团菌属物种中不存在的序列的那些。检测嗜肺军团菌特异性基因有助于辨别含有嗜肺军团菌的样品与可能含有另一种军团菌属致病性物种的样品。

合适的标记物基因是16S rRNA基因(参见例如，GenBank登录号NC_002942.5)，并且如下所示。

AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCATTGTCTAGCTTGCTAGACAGATGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATATGCCTTGAAGAGGGGGACAACTTGGGGAAACTCAAGCTAATACCGCATAATGTCTGAGGACGAAAGCTGGGGACCTTCGGGCCTGGCGCTTTAAGATTAGCCTGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGGGCCTACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGTTATATGAAAATAATTAGTGGCGCAGCAAACGCGATAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATACAGTGAATTTTGCAGAGATGCATTAGTGCCTTCGGGAACACTGATACAGGTGCTGCAT GGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGC ATGTGATGGTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGATACAGAGGGCGGCGAAGGGGCGACCTGGAGCAAATCCTTAAAAGTCGGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGGGGACGTTTACCACGGTGT(SEQ ID NO:8)

使用本文所公开的方法产生的16S rRNA扩增子的核酸序列加下划线。

在一些实施方案中，16S rRNA靶核酸包含5’TACCTACCCTTGACATACAGTGAATTTTGCAGAGATGCATTAGTGCCTTCGGGAACACTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG 3’(SEQ ID NO:9)或其片段。

用于扩增和检测16S rRNA元件的示例性引物和经标记的探针序列包括：

ssrA基因编码tmRNA结合蛋白并且存在于所有军团菌属物种中。ssrA的非限制性示例性核苷酸序列提供于GenBank登录号AE017354.1下(bp 3213808至3214278)并且如下所示。使用本文所公开的方法产生的ssrA扩增子的核酸序列加下划线：

ATGTGGGCAGAAGTATTATCCAGCGATGCCTTTGCGCGCTTTGAGGAGGAAGGTATTTTCAACCCCAAAACTGGACATGACTTTTTAAAATCCATTCTGGAGGTAGGCGGCTCAAGAAAAGCAGCCGATGCTTTTGTTGAATTCAGAGGAAGACCCGCGACGATTGATGCCTTGCTGCGCCATAACGGGATTTTATAAAAACAGGACTTGCGCCCCCCAATCCTCTCGGTAAAACATTTTTTGCCTTGACCTTGGGGTTTTCCGTAAGTCCTGAAAATATATTCGGTATGCTGGCGGGATTTTGCTTACATGCCGGCATTTTATGTTATAATTAAAGTGTACAGAATGGGGGGCGACCTGGCTTCGACGTGG GTTGCAAAACCGGAAGTGCATGCCGAGAAGGAGATCTCTCGTAAATAAGACTCAATTAAATATAAATGCAAACGAT GAAAACTTTGCTGGTGGGGAAGCTATCGCTGCCTAATAAGCACTTTAGTTAAACCATCACTGTGTACTGGCCAATA AACCCAGTATCCCGTTCGACCGAGCCCGCTTATCGGTATCGAATCAACGGTCATAAGAGATAAGCTAGCGTCCTAATCTATCCCGGGTTATGGCGCGAAACTCAGGGAATCGCTGTGTATCATCCTGCCCGTCGGAGGAGCCACAGTTAAATTCAAAAGACAAGGCTATGCATGTAGAGCTAAAGGCAGAGGACTTGCGGACGCGGGTTCGATTCCCGCCGCCTCCACCAATTCATTATCCGATACAGTCCAATACCGGGTCTTTCCCAAATACCTGAATCTTCTACACATCTTGTTTATTCCAAACAAACATGATCAAATCACCTCTTTTTGAGGTATGTATGGACTTAGCAGTTGAAGATACTACAGCATGGTCGGAAGCTATTTTTGGTTCAGTTGCTTTAGGGGATAAACGACTTACTCGTCGGTTAATTCAAATAGGCAAACAATTATCATCGACGCCTGGTGGTTCTCTTTCAGGAAGTTGTGGAGGGCAGGATGCGCTTATAGAAGGTAGTTATCGTTTTTTACGAAACAAACGAGTCACAGCGAATCAAATTGCAGAGGGTGGTT(SEQ ID NO:7)

在一些实施方案中，ssrA靶核酸包含5’TCGACGTGGGTTGCAAAACCGGAAGTGCATGCCGAGAAGGAGATCTCTCGTAAATAAGACTCAATTAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGCTGGTGGGGAAGCTATCGCTGCCTAATAAGCACTTTAGTTAAACCATCACTGTGTACTGGCCAATAAACCCAGTATCCCGTTCGACCGAGCCCGCTTATCGGTATCGAATCAACGGTCATA 3’(SEQ ID NO:10)或其片段。

用于扩增和检测ssrA靶序列的示例性引物和经标记的探针序列包括：

在一些实施方案中，ssrA检测测定不检测非军团菌属物种的细菌。例如，在一些实施方案中，ssrA测定包含对军团菌属物种具有特异性而不扩增源自以下中的一种或多种的核酸的PCR引物和探针：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、RSV B、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、甲型流感病毒(Influenza A)、乙型流感病毒(Influenza B)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)和肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)。

使用所公开的方法定性检测和区别军团菌属物种和嗜肺军团菌可以利用引物对、经标记的探针和实时PCR在具有集成循环仪系统的直接扩增盘上扩增和检测ssrA和16SrRNA基因。使用这种方法，通过荧光标记的探针在同一反应中特异性扩增并同时检测靶基因组DNA。

在一些实施方案中，本文使用的一种或多种引物和/或探针是简并引物或探针，意指如下寡核苷酸序列混合物，其中一些位置含有多个可能的碱基，从而得到覆盖给定蛋白质序列的所有可能的核苷酸组合的具有类似序列的引物群体。简并核苷酸由R指定。简并引物的非限制性例子是SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，将包含源自嗜肺军团菌原种生物体的核酸的阳性对照用于筛选测定。例如，合适的对照DNA可从Microbiologics(目录号0211P)获得。在一些实施方案中，将阳性对照在缓冲液(如TE缓冲液或水)中稀释。在一些实施方案中，在缓冲液中的稀释度是约1:1,000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000或1:10,000,000。

在一些实施方案中，将包含外源核酸的扩增或提取对照用于筛选测定。在一些实施方案中，扩增或提取对照样品不包含源自军团菌属物种的核酸。例如，合适的对照DNA可从Diasorin(目录号151599)获得。在一些实施方案中，将扩增或提取对照在缓冲液(如TE缓冲液或水)中稀释。在一些实施方案中，在缓冲液中的稀释度是约1:1,000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000或1:10,000,000。在一些实施方案中，在扩增靶核酸之前，将扩增或提取对照样品与生物样品混合。

在一些实施方案中，对照核酸序列包含5’TAACCCCGCGATAAAGACAGAAGATTATGCATACGAGATCAAAGGAGCCGGCCTTTTCTCTAGAGATCTCTTATTTTCCTTGAAGTCACCTGTTTATGTTAAAGCAGGTGAGCAGGTATACATTCAGTACGATCTGAACAAAAGCAATGCAGAACTTGCTCTCGACTATGGTTTTGTGGAATCAAACCCTAAACGGAACTCATATACTTTAACAATAGAGATACCAGAATCAGACCCATTCTTTGGGGATAAGTTGGATATTGCTGAGAGTAACAAGATGGGTGAGACCGGATACTTTGACATAGTAGACGGCCAGACTCTTCCCGCTGGTATGCTT CAGTACCTTCGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTATCTTCAATAACACCATATGGG GTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGAACTCATATGCCGTGTTGTCAGAGATGCCTGCAAATCTGCTCTGTCTGGTTTTGATACGACCATTGAAGAGGATGAGAAGCTTCTGGACAAAGGAAAGCTTGAGCCTAGGTTGGAAATGGCTCTCAAG 3’(SEQ ID NO:13)，并且使用包含5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ IDNO:17)的正向引物、包含5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的反向引物和包含5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)的可检测地标记的核酸探针来扩增对照核酸序列。

在一些实施方案中，对照靶核酸包含5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTATCTTCAATAACACCATATGGGGTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGAACTCATATGCCGTGTTGTCAGAGATGCCTGCAA 3’(SEQ ID NO:20)。

在一些实施方案中，将不包含源自军团菌属物种的核酸的阴性对照用于筛选测定。合适的阴性对照的非限制性例子包括无核酸酶水、无菌无核酸酶水和TE缓冲液。

因此，在一些方面，本文提供了用于检测生物样品中至少一种军团菌属物种的存在的方法，所述方法包括以下，由以下组成或基本上由以下组成：(a)提供适于扩增ssrA靶核酸的第一引物对；提供适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；扩增ssrA靶核酸和16SrRNA靶核酸，如果存在的话；以及检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；其中ssrA靶核酸的存在鉴定出至少一种军团菌属物种的存在，并且16S rRNA靶核酸的存在鉴定出嗜肺军团菌的存在。

军团菌属感染的治疗

本文公开了用于确定表现出肺炎样症状的患者是否将受益于用抑制军团菌属物种和/或嗜肺军团菌的治疗剂进行的治疗的方法。

因此，本文提供了用于选择表现出肺炎样症状的受试者以用抑制嗜肺军团菌的治疗剂进行治疗的方法，所述方法包括以下，由以下组成或基本上由以下组成：(a)使从所述受试者分离的样品与适于扩增ssrA靶核酸的第一引物对接触；(b)使所述样品与适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对接触；(c)扩增ssrA靶核酸和16S rRNA靶核酸，如果存在的话；和(d)检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；以及(e)如果检测到16S rRNA靶核酸的扩增产物，则选择所述受试者以用抑制嗜肺军团菌的治疗剂进行治疗。

本文还提供了治疗患有嗜肺军团菌感染的受试者的方法，所述方法包括向通过包括以下、由以下组成或基本上由以下组成的方法选择的受试者施用抑制嗜肺军团菌的治疗剂，由其组成或基本上由其组成：(a)使从所述受试者分离的样品与适于扩增ssrA靶核酸的第一引物对接触；(b)使所述样品与适于扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对接触；(c)扩增ssrA靶核酸和16S rRNA靶核酸，如果存在的话；和(d)检测在步骤(c)中产生的一种或多种扩增产物；以及(e)如果检测到16S rRNA靶核酸的扩增产物，则选择所述受试者以用抑制嗜肺军团菌的治疗剂进行治疗。

在本文提供的方法的一些实施方案中，所述第一引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第一引物对包含第一正向引物，所述第一正向引物包含5’TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’(SEQ ID NO:1)或其互补体。根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一引物对包含第一反向引物，所述第一反向引物包含5’TATGACCGTTGATTCGATACC 3’(SEQ ID NO:2)或其互补体。在一些实施方案中，所述第二引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第二引物对包含第二正向引物，所述第二正向引物包含5’TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’(SEQ ID NO:4)或其互补体。在一些实施方案中，第二引物对包含第二反向引物，所述第二反向引物包含5’CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’(SEQ ID NO:5)或其互补体。

在一些实施方案中，所述方法还包括使生物样品与能够与扩增产物或其互补体特异性杂交的一种或多种寡核苷酸探针接触。在一些实施方案中，寡核苷酸探针是可检测地标记的。在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基-荧光素、雅吉瓦黄、德克萨斯红、TYE 563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯-6-羧基荧光素。在一些实施方案中，寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。在一些实施方案中，淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。在一些实施方案中，寡核苷酸探针与ssrA扩增产物特异性杂交，并且其中寡核苷酸探针包含5’TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’(SEQ ID NO:3)或其互补体。在一些实施方案中，寡核苷酸探针与16S rRNA扩增产物特异性杂交，并且其中寡核苷酸探针包含5’CCAGCATGTGATGGTGGGGACTCTA 3’(SEQ ID NO:6)或其互补体。

在一些实施方案中，所述方法还包括将外源对照DNA与生物样品混合。在一些实施方案中，所述方法还包括使生物样品与适于扩增外源对照靶核酸的第三引物对接触，以及扩增外源对照靶核酸。在一些实施方案中，外源对照靶核酸包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，所述第三引物对由包含5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ ID NO:17)的第三正向引物和包含5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的第三反向引物组成。在一些实施方案中，所述方法还包括使生物样品与第三寡核苷酸探针接触，其中所述第三寡核苷酸探针是可检测地标记的并且包含5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)。

在本文提供的方法的一些实施方案中，实时PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行的。

在本文提供的方法的一些实施方案中，生物样品是支气管肺泡灌洗液样品、支气管洗液样品、痰液样品、鼻咽(NP)抽吸物或洗液样品、鼻拭子或细菌分离物。

抑制军团菌属物种和/或嗜肺军团菌的治疗剂的例子包括氟喹诺酮、碳青霉烯、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(例如，新诺明(Bactrim)、复方新诺明(Septra))和嗜肺军团菌特异性抗体。在一些实施方案中，氟喹诺酮选自环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、罗伐沙星、加替沙星、格帕沙星、替马沙星、洛美沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。在某些实施方案中，碳青霉烯选自亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南、比阿培南、拉祖培南(PZ-601)、泰比培南、来那培南、头茂培南和西恩培南(噻烯霉素)。

抑制军团菌属物种和/或嗜肺军团菌的治疗剂的例子包括全细胞(wP)军团菌属物种和/或嗜肺军团菌疫苗、无细胞军团菌属物种和/或嗜肺军团菌疫苗、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(例如，新诺明、复方新诺明)、泰利霉素和大环内酯类抗生素。在一些实施方案中，大环内酯类抗生素选自阿奇霉素(希舒美)、克拉霉素(比阿辛)、红霉素(E-Mycin、Eryc、Ery-Tab、PCE、琥乙红霉素、依洛宋)和罗红霉素。

抑制军团菌属物种和/或嗜肺军团菌的另外的治疗剂的例子包括甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(例如，新诺明、复方新诺明)、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、罗伐沙星、加替沙星、格帕沙星、替马沙星、洛美沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。

肺炎样症状包括但不限于胸痛、意识错乱、心理意识改变、咳嗽、喀痰、疲劳、发热、出汗、颤抖、寒战、低于正常体温、恶心、呕吐、腹泻、呼吸急促、肺部炎症和肺部有液体。

在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是牛、马、猪、猫、犬、鼠、猿猴、大鼠或人。在一些实施方案中，受试者是人。在特定实施方案中，受试者是具有一种或多种肺炎样症状的人类患者。

结果解释

在对样品-反应混合物进行实时PCR并检测和测量与经扩增的ssrA、16S rRNA和对照靶序列相关的荧光信号后，本发明技术的方法还提供了用于确定一种或多种相关的致病性军团菌属物种的存在的算法，其通过匹配来自经扩增的靶核酸序列的循环阈值(Ct)来提供最终结果。

在一些实施方案中，对于包括40个循环的反应，阳性Ct是小于或等于约35、约36、约37、约38、约39或约40的Ct。在一些实施方案中，对于包括40个循环的反应，阴性Ct是大于约35、约36、约37或约38、约39的Ct、或者约40的Ct。在一些实施方案中，对于包括45个循环的反应，阳性Ct是小于或等于约40、约41、约42、约43、约44或约45的Ct。在一些实施方案中，对于包括45个循环的反应，阴性Ct是大于约40、约41、约42、约43或约44的Ct、或者约45的Ct。在一些实施方案中，对于包括50个循环的反应，阳性Ct是小于或等于约45、约46、约47、约48、约49或约50的Ct。在一些实施方案中，对于包括50个循环的反应，阴性Ct是大于约45、约46、约47、约48或约49的Ct、或者约50的Ct。

军团菌属物种算法规定：

阴性对照

阳性对照

因此，可以根据以下情况确定致病性军团菌属物种在生物样品中的存在或不存在：

试剂盒和组合物

本公开文本还提供了用于检测对应于致病性军团菌属物种的靶核酸序列的试剂盒。

因此，本文提供了用于检测生物样品中至少一种军团菌属物种的存在的试剂盒，所述试剂盒包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：(a)扩增ssrA靶核酸的第一引物对；(b)扩增16S rRNA靶核酸的第二引物对；(c)能够与ssrA靶核酸的区段特异性杂交的第一寡核苷酸探针；以及(d)能够与16S rRNA靶核酸的区段特异性杂交的第二寡核苷酸探针；其中所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针是可检测地标记的。

在本文提供的试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒还包含扩增对照靶核酸的第三引物对。在一些实施方案中，所述第一引物对能够与包含与SEQ ID NO:7或其互补体至少85％-95％相同的核苷酸的ssrA靶核酸特异性杂交。在一些实施方案中，所述第二引物对能够与包含与SEQ ID NO:8或其互补体至少85％-95％相同的核苷酸的16S rRNA靶核酸特异性杂交。

在本文提供的试剂盒的一些实施方案中，所述第一引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第一引物对包含第一正向引物，所述第一正向引物包含5’TCGACGTGGGTTGCRAAACG 3’(SEQ ID NO:1)或其互补体。在一些实施方案中，所述第一引物对包含第一反向引物，所述第一反向引物包含5’TATGACCGTTGATTCGATACC 3’(SEQ ID NO:2)或其互补体。在一些实施方案中，所述第二引物对包含至少一种简并引物。在一些实施方案中，所述第二引物对包含第二正向引物，所述第二正向引物包含5’TACCTACCCTTGACATACAGTG 3’(SEQ ID NO:4)或其互补体。在一些实施方案中，所述第二引物对包含第二反向引物，所述第二反向引物包含5’CTTCCTCCGGTTTGTCAC 3’(SEQ ID NO:5)或其互补体。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含5’TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’(SEQ ID NO:3)或其互补体。在一些实施方案中，所述第二核酸探针包含5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)或其互补体。

在本文提供的试剂盒的一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基-荧光素、雅吉瓦黄、德克萨斯红、TYE 563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯-6-羧基荧光素。在一些实施方案中，至少一种寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含两种淬灭剂。在一些实施方案中，淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。

本发明技术的试剂盒包含至少两种寡核苷酸，其可以用作用于扩增ssrA和16SrRNA靶核酸序列以确定生物样品中致病性军团菌属物种的存在的引物或引物-探针。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有浓度为250nM或更低的至少一种靶标特异性核酸探针的液体培养基。使用这样的试剂盒，以所需量提供探针以根据本发明技术进行可靠的多重检测反应。在一些实施方案中，靶标特异性核酸探针是可检测地标记的。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含进行测定或反应(如扩增和/或检测对应于致病性军团菌属物种的靶核酸序列)所需的缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性且缺乏5'→3'核酸外切酶活性或5'→3'和3’→5'两种核酸外切酶活性的酶、酶辅因子(如镁或锰)、盐、链延伸核苷酸(如脱氧核苷三磷酸(dNTP)、经修饰的dNTP、核酸酶抗性dNTP或经标记的dNTP)。

在一个实施方案中，本发明技术的试剂盒还包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列，以在实验运行期间确保测定的完整性。试剂盒可以还含有用于比较生物样品与参考核酸样品(例如，具有ssrA和16S rRNA中的一种或多种的已知拷贝数的样品)中的ssrA和16S rRNA中的一种或多种的拷贝数的工具。所述试剂盒还可以包含使用说明书、用于自动化分析的软件、容器、包装(如意图用于商业销售的包装)等。

所述试剂盒可以还包含以下中的一种或多种：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂以及检测工具。通常针对意图使用试剂盒的特定扩增/检测技术对缓冲液和/或试剂进行优化。在试剂盒中也可以包括使用这些缓冲液和试剂进行所述程序的不同步骤的方案。

所述试剂盒另外可以包含测定定义扫描卡和/或在测定中使用寡核苷酸的说明书，如打印说明书或电子说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含扩增反应混合物或扩增主混合物。在试剂盒中包括的试剂可以含于一个或多个容器(如小瓶)中。

在扩增主混合物中可以包括对DNA内部对照的扩增和检测具有特异性的引物、探针和/或引物-探针作为靶引物对，以监控潜在PCR抑制。靶标和内部对照的扩增和检测所需的试剂可以配制为全合一(all-in-one)扩增主混合物，其可以作为单一反应等分试样提供于试剂盒中。

在一个方面，本文提供了包含可检测地标记的寡核苷酸探针、由其组成或基本上由其组成的组合物，所述寡核苷酸探针包含5’TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’(SEQID NO:3)。在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基-荧光素、雅吉瓦黄、德克萨斯红、TYE 563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯-6-羧基荧光素。在一些实施方案中，寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。在一些实施方案中，淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。

在另一个方面，本文提供了包含可检测地标记的寡核苷酸探针的组合物，所述寡核苷酸探针包含5’TAAATATAAATGCAAACGATGAAAACTTTGC 3’(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，荧光标记选自荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基-荧光素、雅吉瓦黄、德克萨斯红、TYE563、ROX、TEX 615、TYE 665、TYE 705和六氯-6-羧基荧光素。在一些实施方案中，寡核苷酸探针还包含至少一种淬灭剂。在一些实施方案中，淬灭剂选自TAMRA、Black Hole淬灭剂、Deep Dark淬灭剂、ZEN、Iowa B lack FQ、Iowa Black RQ和DABCYL。

实施例

实施例1：使用实时PCR检测致病性军团菌属物种

从患者收集支气管肺泡灌洗液样品。在提取之前，将内部阳性对照DNA靶标添加到外部裂解缓冲液中。使用“DNA/病毒NA SV 2.0”试剂盒，使用MagNA Pure 96仪器提取DNA。将洗脱体积设置为50。

产生包含以下试剂的军团菌属PCR主混合物，并且将其在-10℃至-90℃下储存：

使用以下条件进行实时PCR：i)将样品在50℃下预热120秒，1个循环；ii)将聚合酶在95℃下活化10分钟，1个循环；以及iii)在95℃下变性15秒并在60℃下退火35秒，40个循环。

通过荧光标记的探针在同一反应中特异性扩增并同时检测靶基因组DNA。检测Ct，并且根据以下算法分析结果：

实施例2：军团菌属多重测定的交叉反应性。

为了进行交叉反应性测定，对照鼻拭子标本将掺入下面列出的一种测试生物体(每种生物体n＝5)。

将对每个样品进行军团菌属多重测定。在每种情况下，Ct值≤40被解释为军团菌属交叉反应性的阳性结果，Ct值≤40被解释为军团菌属交叉反应性的阳性结果，并且Ct值≤40被解释为军团菌属交叉反应性的阳性结果。

预期上述任何微生物物种都将不会观察到交叉反应性。

等同物

本发明技术并不受限于本申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。如本领域技术人员应清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述应清楚，除了本文列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变旨在落入本发明技术的范围内。应理解，本发明技术并不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。

术语“包含”、“包括”、“含有”等应当以广阔且无限制的方式来理解。另外，本文所采用的术语和表达已经用作描述性而非限制性的术语，并且不旨在使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效形式，但是应认识到在所要求保护的本公开文本的范围内各种修改是可能的。

另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。

如本领域技术人员应理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文所公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何所列范围均可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员应同样理解，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教导内容不一致。