具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1咖啡豆醇和咖啡油醇抗菌活性检测

1、试验方法：

(1)白色念珠菌菌株的活化：

将白色念珠菌标准菌株SC5314(名称亦为ATCC MYA-2876)于LB固体培养基活化(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)，置于30℃培养箱培养过夜。

(2)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314菌丝的影响：

挑取LB固体平板上(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB、0.2％葡萄糖) 中，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至 OD₆₀₀＝0.1。取500μL菌液于1.5mL EP管中，加入咖啡豆醇和咖啡油醇，终浓度为30μg/mL；同时设置DMSO对照；DMSO对照组中DMSO按咖啡豆醇和咖啡油醇处理组的相同体积加入到菌液中得到。震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育， 6h后，离心5000rpm，10min，弃上清，加入40μL GMM培养液重悬菌体，于 Zeiss Axioplan 2显微镜下观察菌丝的形成，取不同视野拍摄照片，并计算菌丝形成率。

(3)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314粘附性的影响：

(a)人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃、5％CO₂条件下过夜培养。

(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以0.5×10³个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。

(c)挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB、 0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀。随后用细胞维持液(含1％v/v FBS的DMEM)调节将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.5。将咖啡豆醇母液和咖啡油醇母液(母液用DMSO配制)分别用DMSO稀释成浓度为6mg/mL、3 mg/mL、1.5mg/mL、0.75mg/mL的稀释药液，然后将咖啡豆醇稀释液、咖啡油醇稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:199配比混合，震荡混匀，得到测试液A，咖啡豆醇和咖啡油醇在测试液A中的终浓度分别为30μg/mL、15μg/mL、 7.5μg/mL、3.75μg/mL。按100μL/孔加入步骤(b)已培养细胞的96孔板中，每个处理设置4个重复；同时设置只加DMSO的处理，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:199配比混合，得到测试液B。将96孔板静置于37℃中孵育，1.5h后弃掉培养液，每孔加入100μL浓度为0.5％(w/v)的结晶紫溶液，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddH₂O洗10次，加入100μL浓度为体积百分比75％的乙醇溶液，室温放置30min，测定OD₅₇₀，用GraphPad Prism 6 软件处理数据。

(4)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314生物膜形成的影响：

挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB， 0.2％葡萄糖)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀。随后用GMM培养液将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1，得到含菌的GMM培养液。将咖啡豆醇母液和咖啡油醇母液用DMSO稀释成浓度为6mg/mL、3mg/mL、1.5mg/mL、0.75mg/mL 的稀释药液，然后将咖啡豆醇稀释液、咖啡油醇稀释液分别与含菌的GMM培养液按体积比1:199配比混合，震荡混匀，得到测试液D，咖啡豆醇和咖啡油醇在测试液D中的终浓度分别为30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL。按100μL/孔加入96孔板中，每个处理设置4个重复，同时设置只加DMSO的对照组。将96孔板静置于37℃中孵育，8h后弃掉培养液，加入100μL浓度为 0.5％w/v的结晶紫，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰ddH₂O洗10次，加入100μL 75％乙醇，室温放置30min，测定OD₅₇₀，用GraphPadPrism 6软件处理数据。

(5)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314生长影响测定：

挑取菌株SC5314单菌落接种于GMM培养液(6.7g/L YNB、0.2％葡萄糖)，30℃、200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.05。将咖啡豆醇母液和咖啡油醇母液用DMSO稀释成浓度为6mg/mL、3mg/mL、1.5 mg/mL、0.75mg/mL的稀释药液，然后将咖啡豆醇稀释液、咖啡油醇稀释液分别与含菌的GMM培养液按体积比1:199配比混合，按300μL/孔的量加入到100孔板中，每个处理设置3个重复，同时设置只加DMSO的处理。置于生长曲线测定仪中，30℃、200rpm，每2h测定一次OD₆₀₀值，20h后观察实验结果，GraphPadPrism 6处理数据。

(6)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314细胞毒力的影响：

(a)人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37℃、5％CO₂条件下过夜培养。

(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以1.5×10⁴个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。

(c)白色念珠菌准备：挑取新鲜SC5314接种于GMM培养液(6.7g/L YNB， 0.2％葡萄糖)中，于30℃、200rpm条件下振荡培养过夜；用细胞维持液(含1％ FBS的DMEM)调节至OD₆₀₀＝1.0，再用细胞维持液稀释10倍(≈10⁸CFU/mL)，得到含菌的细胞维持液。

(d)细胞毒力测定：

a)测定咖啡豆醇和咖啡油醇本身对细胞的毒性作用：将咖啡豆醇和咖啡油醇分别用DMSO稀释到6mg/mL，加入细胞维持液中，咖啡豆醇和咖啡油醇的终浓度分别为30μg/mL，得到测试液E；同时，设置对照组，取相同体积的DMSO，得到测试液F。按100μL/孔，将测试液E和测试液F分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。

b)测定咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌对细胞的毒力作用：将咖啡豆醇和咖啡油醇分别用DMSO稀释成浓度为6mg/mL、3mg/mL、1.5mg/mL、0.75 mg/mL的稀释药液，然后将咖啡豆醇稀释液和咖啡油醇稀释液分别与含菌的细胞维持液按体积比1:199配比混合，得到测试液G，咖啡豆醇和咖啡油醇在测试液 G中的终浓度分别为30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL，测试液G中， DMSO的体积含量基本是相同的；同时设置只加DMSO(二甲基亚砜)作为对照，其中，以DMSO和含菌的细胞维持液按体积比1:199配比混合，得到测试液H。按100μL/孔，将测试液G、H分别加入准备好的A549细胞中，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养8h，每处理4个重复。

c)参照Promega公司CytoToxNonRadioactive Cytotoxicity Assay操作方法测定细胞LDH活性，随后用GraphPad Prism 6处理数据。

(7)测定咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314小鼠口腔侵染的影响：

(a)小鼠饲养：购于广东省实验动物中心的6～8周龄的雄性BALB/c小鼠，于华南农业大学实验动物中心饲养。随机分配8只/组，称重记录并给每只小鼠做好标记。

(b)白色念珠菌菌悬液制备：将白色念珠菌标准菌株SC5314于LB固体培养基活化(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L)，即置于30℃培养箱培养过夜。取单菌落接种于GMM培养液(6.7g/L YNB、0.2％葡萄糖)中，30℃、200rpm摇床过夜培养。4℃、3000rpm离心5min，预冷的无菌PBS洗涤2次，血细胞计数法计数，制备成浓度为3×10⁶CFU/mL的菌悬液。取5mL菌悬液备用。制备取5mL PBS在其中加入25μL咖啡豆醇稀释液(浓度为6mg/mL，溶质为DMSO)至咖啡豆醇的终浓度为30μg/mL，取5mL PBS，在其中加入25μLDMSO。

(c)小鼠口腔侵染实验：小鼠感染前一天称重并每只注射0.1mL/10g的氢化可的松(22.5mg/mL，接种前，先用10％的水合氯醛麻醉小鼠，被麻醉的小鼠平放在37℃恒温环境中，用无菌棉球浸透菌悬液3min后放在小鼠舌头下90min；同时设置空白对照组，空白对照组使用PBS溶液浸透无菌球棉后放在小鼠舌头下 90min。然后第1、3、5天给每只小鼠灌100μL/10g的咖啡豆醇稀释液(浓度为 6mg/mL，溶质为DMSO)；同时设置阳性对照组，阳性对照组使用含有DMSO 的PBS进行灌胃。第6天处死小鼠，把小鼠舌头进行解剖并进一步进行病理切片观察。

2、实验结果

(1)咖啡豆醇和咖啡油醇抑制白色念珠菌菌株SC5314菌丝的形成

图1是在显微镜下观察的白色念珠菌菌丝形成的照片图，其中按咖啡豆醇和咖啡油醇处理组相同体积的DMSO加入到菌液，在37℃培养作为对照组，以排除DMSO对白色念珠菌菌丝形成的影响。通过照片计算菌丝形成的抑制率：一个样品拍3张照(3个照片3个重复值)，统计照片上的菌丝，以DMSO形成的菌丝为100％。结果如图2所示，咖啡豆醇和咖啡油醇分别对白色念珠菌SC5314有明显的菌丝抑制作用，经过终浓度为30μg/mL的咖啡豆醇或咖啡油醇处理后，白色念珠菌基本没有菌丝形成。

(2)咖啡豆醇和咖啡油醇抑制白色念珠菌菌株SC5314的粘附性

如图3所示，以DMSO为参照，经终浓度为30μg/mL的咖啡豆醇和咖啡油醇分别处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯上的粘附性，降低了50％以上。表明咖啡豆醇和咖啡油醇分别显示出了对白色念珠菌SC5314的粘附性有一定抑制作用。

(3)咖啡豆醇和咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314生物膜形成的影响：

如图4所示，以DMSO为参照，经咖啡豆醇或咖啡油醇(30μg/mL)处理后的白色念珠菌在聚苯乙烯上的生物膜形成，降低了90％以上。表明咖啡豆醇或咖啡油醇对白色念珠菌SC5314的生物膜形成有很好的抑制作用。

(4)高浓度的咖啡豆醇对白色念珠菌菌株SC5314的细胞生长具有轻微的抑制作用，低浓度的咖啡豆醇和咖啡油醇没有抑制作用；

结果显示，以DMSO为对照，咖啡豆醇的浓度为30μg/mL时对白色念珠菌菌株SC5314的生长有轻微的抑制作用(图5A)，咖啡油醇没有抑制作用(图5B)。该结果表明咖啡豆醇或咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314的治疗作用并不是主要通过杀死细菌细胞实现的，因此不易产生耐药性。

(5)咖啡豆醇或咖啡油醇对白色念珠菌菌株SC5314的细胞毒力有很好的抑制作用

我们通过检测LDH的释放量来检测细胞毒力，在检测白色念珠菌的细胞毒力时，我们将在白色念珠菌SC5314中加入了DMSO组的LDH释放量作为100％，并由此来规范其他加入咖啡豆醇或咖啡油醇组的LDH释放比例。结果如图6所示，数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。

细胞毒力实验结果显示，以DMSO为对照，在没有白色念珠菌的条件下，咖啡豆醇或咖啡油醇在30μg/mL的浓度时对细胞没有毒性，如图6A所示。

而在加入白色念珠菌SC5314的条件下，以DMSO为对照，图6B显示咖啡豆醇或咖啡油醇对抑制SC5314对细胞的侵染有很好的保护作用；咖啡豆醇或咖啡油醇在30μg/mL的浓度时，白色念珠菌的毒力降低到30％以下。

(6)咖啡豆醇对白色念珠菌菌株SC5314的小鼠口腔侵染有很好的抑制作用

我们通过观察小鼠舌头上白色念珠菌形成情况，发现白色念珠菌对照组的小鼠舌头形成一层厚厚的白色念珠菌菌丝层，而在PBS空白对照组和咖啡豆醇处理组，小鼠舌头没有菌丝形成；病理切片(如图7)显示白色念珠菌对照组小鼠舌头细胞上层有白色念珠菌菌丝层，而PBS空白对照组和咖啡豆醇处理组则没有。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。