一种基于NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法
阅读说明：本技术 一种基于NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法 (Method for screening cinnabar plants based on NtPIF1 gene expression level ) 是由 宋中邦 隋学艺 张谊寒 王亚辉 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法,所述的基因为NtPIF1基因；序列为SEQ ID NO.1；所述的方法包括以下步骤：单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测、套袋自交收种。本发明首次公开利用NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株,且烟草叶片不需进行任何处理直接取样检测,筛选出的植株烤后叶片呈现显著硃砂特征。(The invention relates to a method for screening a cinnabar plant based on the expression level of a NtPIF1 gene, wherein the gene is a NtPIF1 gene; the sequence is SEQ ID NO. 1; the method comprises the following steps: numbering the single plant, sampling leaves, extracting RNA, synthesizing cDNA, detecting gene expression level, bagging and self-crossing. The invention discloses screening of cinnabar plants by using the NtPIF1 gene expression level for the first time, and the tobacco leaves are directly sampled and detected without any treatment, and the screened plant-roasted leaves show obvious cinnabar characteristics.)
技术领域
本发明属于烟草遗传育种技术领域，具体涉及硃砂烟植株的筛选基因、序列及方法技术领域。
背景技术
栽培烟草(Nicotiana tabacum)是源于两个祖先种绒毛状烟草(N.tomentosiformis)和林烟草(N.sylvestris)通过种间杂交加倍而形成的异源四倍体，但其叶片主要生物碱与两个祖先迥异。大部分栽培烟草的绿色和衰老叶片中，尼古丁是主要生物碱，约占生物碱总量的90～95％。绒毛状烟草在绿色及衰老叶片中均积累去甲基尼古丁；而林烟草在绿色叶片中主要积累尼古丁，但在叶片衰老过程中大部分尼古丁转化为去甲基尼古丁。白肋烟是普通烟草的一种类型，其“非转化株”的主要生物碱为尼古丁，但每一世代群体中约有20％单株发生未知突变成为“转化株”，“转化株”中主要生物碱为去甲基尼古丁。烤烟单株也会发生类似突变，其烟叶主要累积去甲基尼古丁，且突变株烤后烟叶表面呈现红色斑点，国外学者称为“Cherry-red”，我国称之为“硃砂烟”。硃砂烟出现概率极低，有研究表明在538个单株中发现3株硃砂烟，概率约为0.56％。硃砂烟具有独特的“糯米香”，是云南地区烟民抽吸水烟筒时深受欢迎的调香原料。采集硃砂烟资源烟叶和常规烟叶进行转录组分析，发现NtPIF1基因在二者之间表达水平差异极其显著，因此可以作为筛选硃砂烟植株的标记基因。
硃砂烟叶作为特色原料，具有广泛的应用前景。但目前硃砂烟生产主要通过收购环节人工挑选具有硃砂特征的田间突变烟叶，导致烟叶产量不稳定，烟叶质量存在诸多缺陷。筛选出能够稳定遗传的硃砂烟资源是硃砂烟规模化开发的前提基础。
发明内容
由于硃砂烟与常规烤烟在生长阶段难以通过外观区分，无法筛选出硃砂烟植株并收种，造成无硃砂烟种子用于农业生产。本发明正是为了解决上述问题缺陷，本发明的目的在于提供一种硃砂烟植株的筛选基因、序列及方法。
本发明采用如下技术方案实现。
硃砂烟植株的筛选基因，本发明所述的基因为NtPIF1基因；序列为SEQ ID NO.1。
基于本发明上述基因筛选硃砂烟植株的方法，所述的方法包括以下步骤：单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测、套袋自交收种。
本发明所述的步骤具体为：
步骤(1)单株挂牌编号：所有待筛烟草单株挂牌，并标记唯一编号；
步骤(2)叶片取样：取烟株幼嫩叶片组织0.1g左右置于液氮保存；
步骤(3)RNA提取及cDNA合成：提取叶片组织总RNA，并反转录成cDNA；
步骤(4)基因表达水平检测：根据NtPIF1基因序列设计特异qPCR引物，以叶片cDNA为模板进行qPCR分析，NtPIF1基因表达水平达到标准即为硃砂烟植株；
步骤(5)根据qPCR结果找到对应编号植株，套袋自交收种，获得稳定的硃砂烟遗传资源。
本发明所述的步骤(4)标准为：达到低于内参基因Actin的1/100，即Target/Reference＜1*10-2。
本发明所述的步骤(4)特异qPCR引物为NtPIF1qF1：CGGAGGTGGCAGCGGTGATGC、NtPIF1qR1：ACGTTCGAAGGAGGAGGAGTC；
NtACTIN基因作为内参，为：
NtACTINq_F_1:CTGAGGTCCTTTTCCAACCA、
NtACTINq_R_1:TACCCGGGAACATGGTAGAG。
本发明所述的步骤(5)获得稳定的硃砂烟遗传资源的标准为8个后代植株，叶片的NtPIF1基因表达水平低于内参基因Actin的1/100，即Target/Reference＜1*10-2；所有单株的烤后叶片均呈现显著的硃砂特征，表明筛选成功。
本发明所述基因的应用，该基因应用于表达水平筛选硃砂烟植株的方法。
本发明所述方法的应用，所述的方法在硃砂烟植株筛选中的应用。
本发明所述方法的应用，所述的特异qPCR引物和NtACTIN内参在硃砂烟植株筛选中的应用。
SEQ ID NO.1
>NtPIF1
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本发明的有益效果为，本发明首次公开利用NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株，且烟草叶片不需进行任何处理直接取样检测，筛选出的植株烤后叶片呈现显著硃砂特征。
下面结合附图和
具体实施方式
本发明做进一步解释。
附图说明
图1转录组分析图。
图2LG2.1367基因表达水平验证图。
图3NtPIF1基因表达水平验证图。
图4植株叶片NtPIF1基因表达水平检测图。
图5筛选出的植株烤后叶片表型图。
图6子代植株叶片NtPIF1基因表达水平检测图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的一种硃砂烟植株的筛选基因、序列及方法；包括单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测、套袋自交收种，具体步骤如下：
(1)单株挂牌编号：所有待筛烟草单株挂牌，并标记唯一编号。
(2)叶片取样：取烟株幼嫩叶片组织0.1g左右置于液氮保存。
(3)RNA提取及cDNA合成：提取叶片组织总RNA，并反转录成cDNA。
(4)基因表达水平检测：根据NtPIF1基因序列设计特异qPCR引物，以叶片cDNA为模板进行qPCR分析，NtPIF1基因表达水平低于内参基因Actin的1/100(Target/Reference＜1*10-2)即为硃砂烟植株。
(5)根据qPCR结果找到对应编号植株，套袋自交收种，即可获得稳定的硃砂烟遗传资源。
所述的NtPIF1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的NtPIF1基因，其叶片表达水平作为指标在硃砂烟植株筛选中的应用。
实施例1
取烟草种质资源中硃砂烟资源及对照(设3个生物学重复)的中部叶片，利用Illumina HiSeq平台进行转录组测序，将下机数据进行过滤得到Clean Data，与参考基因组进行序列比对，得到的Mapped Data。利用DESeq2软件进行样品组间的差异表达分析，获得硃砂烟与对照之间的差异表达基因集。差异基因的筛选条件为|log2Fold Change|>＝1，且FDR<0.05。共获得差异表达基因435个，其中在硃砂烟中表达水平上升基因330个，表达水平下降基因105个(图1)。随机挑选若干在硃砂烟中表达水平上升的候选基因利用qPCR验证转录组结果。转录组分析中，硃砂烟LG2.1367基因表达水平显著下降，但qPCR检测结果表明LG2.1367基因在硃砂烟和对照中表达水平无显著差异(图2)。转录组分析中，硃砂烟NtPIF1基因表达水平显著下降，qPCR检测结果与转录组结果一致(图3)，表明NtPIF1基因可以作为筛选硃砂烟的候选靶基因。
实施例2
选择田间正常生长、未被病毒感染的烟株，取幼嫩叶片组织约0.1g，立即置于液氮保存备用。提取烟草叶片总RNA，反转录获得cDNA第一链(PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser，Takara)。采用SYBR Green法(SYBR Green l Master Mix，Roche)对目标基因进行荧光实时定量PCR(qRT-PCR)分析(LightCycler 480，Roche)，NtACTIN基因作为内参，定量引物如下：
NtPIF1qF1：CGGAGGTGGCAGCGGTGATGC
NtPIF1qR1：ACGTTCGAAGGAGGAGGAGTC
NtACTINq_F_1:CTGAGGTCCTTTTCCAACCA
NtACTINq_R_1:TACCCGGGAACATGGTAGAG
如图4所示，植株_9的NtPIF1基因表达水平低于内参基因Actin的1/100(Target/Reference＜1*10-2)，即该植株为硃砂烟。该单株挂牌后烘烤，烤后叶片呈现显著的硃砂特征(图5)，感官评吸表明其硃砂烟香气特征明显。
实施例3
收获植株_9种子后播种，漂浮盘上随机选择10株取幼嫩叶片组织约0.1g，立即置于液氮保存备用。提取烟草叶片总RNA，反转录获得cDNA第一链(PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser，Takara)。采用SYBR Green法(SYBR Green l MasterMix，Roche)对目标基因进行荧光实时定量PCR(qRT-PCR)分析(LightCycler 480，Roche)，NtACTIN基因作为内参，定量引物如下：
NtPIF1qF1：CGGAGGTGGCAGCGGTGATGC
NtPIF1qR1：ACGTTCGAAGGAGGAGGAGTC
NtACTINq_F_1:CTGAGGTCCTTTTCCAACCA
NtACTINq_R_1:TACCCGGGAACATGGTAGAG
如图6所示，植株_9的8个后代植株(CR60_1-8)叶片的NtPIF1基因表达水平低于内参基因Actin的1/100(Target/Reference＜1*10-2)，所有单株的烤后叶片均呈现显著的硃砂特征，表明筛选出的单株可以稳定遗传。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方属于数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种基于NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法
<160> 5
<210> 1
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaatcattcagttcctgagtttgatatggatgatgactacactattcctacgtcttctggtcttacca
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aggttacaataaacccggcagcagcaaagaagttggaaatccagggaatcctcaatctggttga
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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