一种江豚环境dna检测试剂的制备方法
阅读说明：本技术 一种江豚环境dna检测试剂的制备方法 (Preparation method of reagent for detecting DNA (deoxyribonucleic acid) of environment of finless porpoise ) 是由 杨朝 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法,包括如下试剂：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)；1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml；在10 lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4℃；溶液Ⅱ：0.2N NaOH,2%SDS；2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml,使用前临时配置；溶液Ⅲ：醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8,5M KAc 300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH2O至500ml,4℃保存备用。本发明设计的江豚环境DNA检测试剂制备方法,能够检测水质中存在的江豚DNA信息,并且使用的方法比较的简单,属于检测DNA中常用的手段,但能够起到不一样的检测效果,而且检测能够减少对溶液中DNA的机械剪切破坏,防止和抑制DNase对DNA的降解。(The invention discloses a preparation method of a reagent for detecting DNA in a finless porpoise environment, which comprises the following reagents: solution I: 50mM glucose, 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0); 12.5ml of 1M Tris-HCl (pH 8.0), 10ml of 0.5M EDTA (pH 8.0), 4.730g of glucose, and ddH2O to 500 ml; autoclaving at 10 lbf/in2 for 15min, storing at 4 deg.C; solution II: 0.2N NaOH, 2% SDS; 1ml of 2N NaOH, 1ml of 10% SDS, and 10ml of ddH2O, wherein the mixture is prepared temporarily before use; solution III: potassium acetate (KAc) buffer, pH 4.8, 5M KAc 300ml, glacial acetic acid 57.5ml, ddH2O to 500ml, stored at 4 ℃ for further use. The preparation method of the finless porpoise environment DNA detection reagent designed by the invention can detect finless porpoise DNA information existing in water quality, is simpler in use method, belongs to a common means for detecting DNA, can achieve different detection effects, can reduce mechanical shearing damage to DNA in a solution, and can prevent and inhibit DNA degradation by DNase.)
技术领域
本发明涉及DNA检测试剂领域，特别涉及一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法。
背景技术
江豚是一种小型齿鲸，被列为国家二级保护动物，是一个相对独立的淡水亚种。近年来，江豚由于航运、过度及非法捕捞，种群数量快速衰退，现已被世界自然保护联盟物种生存委员会(IUCNSSC)列为“极度濒危”(CR)物种，检测和保护江豚迫在眉睫，江豚环境DNA是环境中生物有机体释放在环境中的DNA片段，主要来源于脱落的皮肤细胞、尿液、粪便、体液或其他身体分泌物，环境DNA技术是利用各种分子手段识别环境DNA中所包含的信息。
但现在的江豚环境DNA检测试剂，使用时容易对溶液中DNA的机械剪切破坏，还增加DNase对DNA的降解，并且不能准确的检测江豚环境的DNA。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法，包括如下试剂：
溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）；1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml；在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃；
溶液Ⅱ：0.2N NaOH，2% SDS；2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配置；
溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8，5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml，4℃保存备用；以及
TE、苯酚/氯仿/异戊醇、乙醇、5×TBE、溴化乙锭（EB）、RNase A（RNA酶A）、6×loading buffer（上样缓冲液）和1% 琼脂糖凝胶。
优选的，TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)；1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml；15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
优选的，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。
优选的，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。
优选的，5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml；15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
优选的，溴化乙锭（EB）：10mg/ml。
优选的，RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
优选的，6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
优选的，2% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml，轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明设计的江豚环境DNA检测试剂制备方法，能够检测水质中存在的江豚DNA信息，并且使用的方法比较的简单，属于检测DNA中常用的手段，但能够起到不一样的检测效果，而且检测能够减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，防止和抑制DNase对DNA的降解。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式，这里使用的“第一”、“第二”仅用于区别同一技术特征，并不对该技术特征的顺序和数量等加以限定。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法，包括如下试剂：
溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）；1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml；在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃；
溶液Ⅱ：0.2N NaOH，2% SDS；2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配置；
溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8，5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml，4℃保存备用；以及
TE、苯酚/氯仿/异戊醇、乙醇、5×TBE、溴化乙锭（EB）、RNase A（RNA酶A）、6×loading buffer（上样缓冲液）和2% 琼脂糖凝胶。
TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)；1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5MEDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml；15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。
5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml；15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
溴化乙锭（EB）：10mg/ml。
RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
2% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml，轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
一种江豚环境DNA检测试剂的制备方法，具体步骤如下：
A、挑取江豚环境水质放入LB固体培养基上，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜12-14hr；
B、取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽；
C、将培养物沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀；
D、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）；
E、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀；
F、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min；
G、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min；
H、1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干；
I、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用；
最后观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加，DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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