具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。

实施例中部分名词释义：

lncRNAs：长链非编码RNA

PCR反应：聚合酶链式反应

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

一种用于治疗神经轴突损伤的调控靶点，其特征在于：包括一lncRNAs及调控下游的PI3K-Akt信号通路，所述lncRNAs为SEQ ID NO.1所示的RNA。所述SEQ ID NO.1所示的RNA的序列号为lncRNAs编号为ENSMUST00000156081的RNA。

本申请还提供了一种用于治疗神经轴突损伤的药物，其特征在于：包括一lncRNAs及调控下游的PI3K-Akt信号通路的激活剂，所述lncRNAs为SEQ ID NO.1所示的RNA。在一实施方式中，所述激活剂包括IGF-1或SC79。

本申请还提供了一种lncRNAs的应用，所述lncRNAs为SEQ ID NO.1所示的RNA，所述lncRNAs作为分子靶点，调控周围及中枢神经损伤后，神经轴突的再生的应用。

以下为本申请的验证实验：

实施例1：考察ENSMUST00000156081的表达及对DRG神经元轴突生长的影响：

S1：DRG样本RNA提取及荧光实时定量PCR反应（qRT-PCR）

制备小鼠坐骨神经夹伤模型后，取术后0h, 3h, 9h, 1d及 4d坐骨神经夹伤侧的L4-L5背根神经节（DRG）组织，通过TRIZOL法进行组织RNA的提取。

RNA 逆转录合成 cDNA：使用Takara RR047A逆转录试剂盒消化基因组 DNA，将 1μg RNA逆转成cDNA。QRT-PCR实验中用GAPDH基因作为内参，作2~3个复孔。后续分析结果，去除掉误差较大的、溶解曲线不单一及扩增曲线异常的数据，再用2-ΔΔCT方法进行分析统计。qRT-PCR结果如图显示，与0d相比，坐骨神经损伤后DRG中的ENSMUST00000156081的表达在3h时迅速上升后逐渐恢复。

S2：ENSMUST00000156081对DRG神经元轴突生长的影响：

(1) 分离培养DRG神经元：

准备解剖液放入小皿中，加入抗生素后置于冰上预冷。腹腔麻醉小鼠，用手术剪从尾部沿脊椎向头部剪开皮肤，小心剔出整根脊柱，从颈部开始打开椎板，用显微镊拽出所有DRG组织放入解剖液中。取出全部DRG组织后弃去解剖液，用细胞级别PBS淋洗组织2遍，洗去多余组织和血迹。弃去PBS，加入2ml胶原酶(3mg/ml)，将组织及消化液转移至5ml离心管中。用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min。离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min左右至组织分散均匀，即可放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱。待组织消化至无明显组织块，即可向离心管中加入3ml消化终止液终止消化。用枪吹打1min左右即可过筛网(70μm)，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中，1200rpm×5min，弃去上清。向离心管中加入4ml提前预热的BSA溶液，重悬细胞，900rpm离心5min，小心吸弃漂浮的杂细胞。再重复上述步骤。加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到预包被多聚赖氨酸的细胞培养板中，十字混匀细胞后放入5%CO₂，37℃培养箱中培养。

(2) DRG神经元siRNA体外转染：

待DRG神经元细胞接种到培养板后，同时加入对照siRNA（NC）及ENSMUST00000156081的特异siRNA（Si1及Si2）与脂质体转染混合液，轻轻摇匀后置于培养箱中培养12左右。更换新鲜神经元培养基，转染48h后，用0.025%的胰酶消化细胞重悬并重新接种至24孔培养板中，接种后12~18h内收取细胞。

(3) 体外神经元轴突生长实验：

弃去细胞培养基，加入预热后的1×PBS润洗细胞。弃去1×PBS，加入预冷的4%多聚甲醛，冰上固定20min。弃去甲醛后，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。清洗结束后弃去PBS，轻轻滴加封闭液，每孔200μl，室温静置40min。弃去封闭液，轻轻滴加用一抗稀释液稀释Anti-β-Tublin Ⅲ antibody(1:1000），每孔200μl，4℃ 静置孵育过夜。弃去一抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。弃去PBS，轻轻滴加用二抗稀释液稀释的Alexa fluor 647goat anti-rabbit(1:1000)，每孔200μl，室温静置孵育2h。此过程避光。弃去二抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。此过程避光。清洗结束后，将圆玻片挑出孔，将有细胞一面朝下覆盖在滴有封片液的载玻片上，置于湿盒中存放在4℃中。注意过程中不要产生气泡。此过程避光。

请参阅图1，图1A通过qRT-PCR 验证坐骨神经损伤模型中DRG组织中ENSMUST00000156081的表达变化（GAPDH为内参），ENSMUST00000156081的表达在神经损伤后逐渐减少；图1B.神经元轴突染色实验检测干扰ENSMUST00000156081对神经元轴突生长的影响。图1C为神经元轴突最长的统计图。可以通过图1中看出ENSMUST00000156081干扰后显著抑制神经元轴突的生长。

实施例2：干扰 ENSMUST00000156081的表达对坐骨神经损伤后轴突再生的影响（体内坐骨神经轴突生长实验）：

(1) 体内DRG注射siRNA：

实验用8周龄雄性C57BL/6小鼠由实验动物中心提供。手术前首先进行腹腔麻醉，再将背部髂骨附近进行被毛消毒，接着用手术剪暴露皮肤，用眼科剪沿着髂骨切开肌肉组织，换骨剪剪除突起的棘突，沿着坐骨神经向上寻找暴露出L4、L5 DRG组织，将包装了siRNA（包括对照siRNA（NC）及ENSMUST00000156081的特异siRNA（Si1及Si2））用微量进样器匀速注入DRG中。

(2)坐骨神经夹伤：

在DRG注射2天后再进行坐骨神经夹伤。首先进行腹腔麻醉，再将左侧后肢被毛消毒。用手术剪暴露皮肤，再用眼科剪钝性分离覆盖住坐骨神经的肌肉与基膜，使用夹伤钳夹住坐骨神经近端，夹伤处2mm宽，夹伤持续20s，夹伤结束后将坐骨神经收回肌肉下，最后将伤口缝合。注意术后护理。

(3) 组织灌流与脱水：

夹伤3d后取坐骨神经组织。现配4%甲醛溶液置于冰上预冷待用。首先进行腹腔麻醉，将动物固定好后用手术剪向心脏方向剪开腹部皮肤，暴露出横膈膜后沿边缘剪开即可暴露心脏，剥开盖在心脏上的脂肪组织暴露出动脉，将针管从心尖位置插入伸至动脉中，开启生理盐水灌流再用眼科剪剪开右心耳，待体内所有血液被生理盐水置换出来后打开甲醛灌流，观察到大鼠四肢均僵硬后可进行取材操作。注意暴露心脏前操作不能剪到内脏否则影响灌流效果。

(4) 坐骨神经免疫化学染色：

取出的组织浸泡在4%甲醛溶液中，8h后弃去甲醛溶液，用1×PBS清洗掉残留的甲醛，最后换成30%蔗糖溶液进行组织脱水。观察组织在蔗糖溶液中下沉即视为脱水完成，将组织取出置于解剖镜下，用显微镊修剪除去多余肌肉组织，然后小心捋直放置在附有蔗糖溶液的冻台上，再加入蔗糖溶液进行速冻，冻台制作好之后存放在-20℃待切片处理。切片前准备用PLL包被好的载玻片，按实验所需设定好切片的厚度后即可开始切片。切片完成后置于50 ℃烘箱中烘干2h，烘干后密封好可储存在-80 ℃中。染色前1h将组织切片从-80 ℃中取出，放置室温中复温1h。选取无皱褶，形态完整，不含气泡的组织放入盛有1×PBS的洗槽中，置于摇床上低速清洗15min。从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍后用组化笔圈隔组织，在圈中加入适量免疫染色封闭液，置于湿盒中室温静置1h。加封闭液前尽量保持组织湿润否则影响染色效果。弃去封闭液，擦拭掉组织边的水渍，在组化圈内滴加用一抗稀释液稀释的SCG10 (1:400)，置于湿盒中4℃静置过夜。第二天，将湿盒置于室温静置1h。弃去一抗，将切片置于盛有1×PBS的洗槽中，于摇床上低速清洗3次，15min/次。从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍，避光条件下，在组化圈内滴加用二抗稀释液稀释的Alexa fluor647 goat anti-rabbit (1:1000)，置于避光湿盒中室温孵育2h。弃去二抗，将切片置于盛有1×PBS的洗槽中，于摇床上低速清洗3次，15min/次。避光条件下，从洗槽中取出切片，擦干组织外的水渍，在组化圈内滴加荧光封片液，用专用盖玻片封片后存放于湿盒中，注意过程中不要产生气泡。

请参阅图2，图2A.坐骨神经轴突染色实验检测体内干扰ENSMUST00000156081对坐骨神经轴突生长的影响。图2B为坐骨神经轴突最长长度的统计图；通过图2可以看出干扰ENSMUST00000156081后显著抑制坐骨神经轴突的生长。

实施例3：PI3K-Akt信号通路的激活在ENSMUST00000156081调控神经元轴突再生的影响：

S1：ENSMUST00000156081下游靶点的筛选：

对干扰的DRG神经元（Si1及Si2）及对照组（NC）进行提取总RNA，进行基因转录组测序。对差异表达的基因进行GO pathway分析，发现其主要影响PI3K-Akt信号通路。将该通路中4个差异表达基因进行qRT-PCR验证，发现干扰DRG中ENSMUST00000156081的表达，PI3K-Akt信号通路中的4个基因（Fgf2、Tlr4、Itgav及Tnxb）表达明显降低。

S2：ENSMUST00000156081对DRG神经元中PI3K-Akt信号通路的影响：

对干扰ENSMUST00000156081表达的DRG神经元（Si1及Si2）及对照组（NC）进行提取总蛋白后进行Western Blot实验，结果如图显示，与对照相比，干扰ENSMUST00000156081后DRG中的Akt的磷酸化水平显著降低。

S3： PI3K-Akt信号通路的激活在ENSMUST00000156081调控神经元轴突再生的影响：

待DRG神经元细胞接种到培养板后，同时加入对照siRNA（NC）及ENSMUST00000156081的特异siRNA（Si2）与脂质体转染混合液，轻轻摇匀后置于培养箱中培养12左右。更换新鲜神经元培养基，转染48h后，用0.025%的胰酶消化细胞重悬并重新接种至24孔培养板中，加入IGF-1及SC79,培养12~18h内收取细胞进行染色。

请参阅图3，图3A. 为qRT-PCR检测干扰神经元中ENSMUST00000156081后PI3K-Akt信号通路靶基因的表达示意图。图3B为Western Blot检测干扰神经元中ENSMUST00000156081后Akt的磷酸化水平示意图。图3C为神经元轴突染色实验检测PI3K-Akt信号通路的激活对干扰ENSMUST00000156081调控神经元轴突生长的影响示意图。图3D为神经元轴突最长的统计图。可以看出，PI3K-Akt信号通路的激活部分消除ENSMUST00000156081干扰后对神经元轴突的生长的抑制作用。

实施例4：ENSMUST00000156081对胚胎大脑皮质神经元轴突生长的影响

S1： 分离培养胚胎大脑皮质神经元：

准备解剖液放入小皿中，加入抗生素后置于冰上预冷。腹腔麻醉后取出E16小鼠，用手术剪剪开脑部，取出大脑皮层组织后置于解剖液，用细胞级别PBS淋洗组织2遍，洗去多余组织和血迹。弃去PBS，加入2ml胶原酶(3mg/ml)，将组织及消化液转移至5ml离心管中。用显微剪充分剪碎组织后放入细胞培养箱中，消化90min。离心弃去胶原酶，加入1ml胰酶消化液，用枪吹打1min左右至组织分散均匀，即可放进细胞培养箱消化10min，每5min拿出吹打均匀再放回培养箱。待组织消化至无明显组织块，即可向离心管中加入3ml消化终止液终止消化。用枪吹打1min左右即可过筛网(70μm)，滤掉多余组织并收集细胞悬液至新的5ml离心管中，1000rpm×5min。加入提前预热的神经元培养基，吹打细胞均匀后接种到预包被多聚赖氨酸的细胞培养板中，十字混匀细胞后放入5% CO₂，37℃培养箱中培养。

S2： 胚胎大脑皮质神经元siRNA体外转染：

待胚胎大脑皮质神经元细胞接种到培养板后，同时加入对照siRNA（NC）及ENSMUST00000156081的特异siRNA（Si1及Si2）与脂质体转染混合液，轻轻摇匀后置于培养箱中培养12左右。更换新鲜神经元培养基，转染48h后，用0.025%的胰酶消化细胞重悬并重新接种至24孔培养板中，接种后12~18h内收取细胞。

S3：体外神经元轴突生长实验：

弃去细胞培养基，加入预热后的1×PBS润洗细胞。弃去1×PBS，加入预冷的4%多聚甲醛，冰上固定20min。弃去甲醛后，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。清洗结束后弃去PBS，轻轻滴加封闭液，每孔200μl，室温静置40min。弃去封闭液，轻轻滴加用一抗稀释液稀释Anti-β-Tublin Ⅲ antibody(1:1000），每孔200μl，4℃ 静置孵育过夜。弃去一抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。弃去PBS，轻轻滴加用二抗稀释液稀释的Alexa fluor 647goat anti-rabbit(1:1000)，每孔200μl，室温静置孵育2h。此过程避光。弃去二抗，用1×PBS润洗，室温洗3次，5min/次。此过程避光。清洗结束后，将圆玻片挑出孔，将有细胞一面朝下覆盖在滴有封片液的载玻片上，置于湿盒中存放在4℃中。注意过程中不要产生气泡。此过程避光。

请参阅图4，图4A.神经元轴突染色实验检测干扰ENSMUST00000156081对胚胎大脑皮质神经元轴突生长的影响。图4B为胚胎大脑皮质神经元轴突最长的统计图。通过图4可以看出ENSMUST00000156081干扰后显著抑制胚胎大脑皮质神经元轴突的生长。

上述验证表明了体内外干扰ENSMUST00000156081基因的表达均能显著抑制神经元轴突的生长。进一步通过ENSMUST00000156081干扰后的差异基因的功能分析，寻找ENSMUST00000156081调控下游关键PI3K-Akt信号通路，通过生物大分子（IGF-1）或小分子化合物（SC79）激活PI3K-Akt信号通路检测其在ENSMUST00000156081干扰后对神经元轴突再生的影响。上述实验验证了ENSMUST00000156081可以通过调节PI3K-Akt信号通路进而影响神经元轴突的生长，从而成为神经损伤修复的重要分子靶点。

以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> 治疗神经轴突损伤的调控靶点及药物、lncRNAs的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> DNA/RNA

<213> 长链非编码RNA(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gtacaagtcc aggcgtggac gagtgtgctt agagatactg gtgtcttctt tttctctgtt 60

gctatcttgt ttttgtttgt ggtttttgtc atgagacaca gacactgtat gtcagaggtc 120

tggttttggt cccaaggagt tgactgatta tcttggtttg gttttaggcc ggtctcaggt 180

tctggggcct tcccatggag acaggtccat ttgggttggt catagtgaca gtaagcttct 240

ctggaaatcg catgtaagat gccctgtatt ggtcttgctt gtgtttgtca tttctgtggt 300

actgtgattc tatagtggtt gcctgaaaaa cggtttctgt gtgtgtcttt tttgtctctt 360

tgtgttcgga cttggactga tgactgacga ctgtttttaa gttatgcctt ctgaaataag 420

cctaaaaatc ctgtcagatc cctatgctga ccacttcctt tcagatcaac agctgccctg 480

cctcccactc caactccaga gagcagccag cgggtcacag tggtcccgtc catggacctg 540

gagcctaggg ggaaaatgag cttaaaaatc cggagcaaaa gaggggtggt ccctgagaag 600

tcagtggcct gaatgttgtg gctgctg 627