阅读说明：本技术 一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒ii型dna疫苗的方法 (Method for preparing baculovirus carp herpesvirus II type DNA vaccine by utilizing freeze drying ) 是由 徐龙行 张星 胡小龙 刘波 贡成良 李坤 于 2021-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的方法。将重组病毒BmNPV-FA-D4ORF接种家蚕,然后将发病家蚕匀浆、冷冻干燥,制作冻干粉,为鲤疱疹病毒II型DNA疫苗；所述冷冻干燥为-80℃预冻过夜,然后进行低压阶梯升温干燥。本发明限定冷冻方法,在现有重组病毒BmNPV-FA-D4ORF接种家蚕,然后将发病家蚕匀浆的基础上,进一步提高了应用效果。(The invention relates to a method for preparing baculovirus carp herpesvirus II type DNA vaccine by freeze drying. Inoculating recombinant virus BmNPV-FA-D4ORF to silkworms, homogenizing the ill silkworms, freezing and drying to prepare freeze-dried powder which is a carp herpes virus II type DNA vaccine; the freeze drying is pre-freezing overnight at-80 ℃, and then carrying out low-pressure stepped heating drying. The invention limits the freezing method, inoculates the silkworm with the existing recombinant virus BmNPV-FA-D4ORF, and then homogenizes the diseased silkworm, thereby further improving the application effect.)

一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒II型DNA疫苗 的方法

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的方法。

背景技术

鱼类免疫的方法有多种，其中注射免疫效果好但是工作量大，口服疫苗损伤小但易受消化的影响，为了解决此问题，现有技术CN2018105344579公开了一种基于杆状病毒载体的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗及其构建方法与应用，具体为以下步骤，（1）将启动子克隆进pFSATBacDual的SmaⅠ/XhoⅠ位点获pFSATBacDual-FA载体；（2）将融合DNA序列克隆进pFSATBacDual-FA的XhoI/KpnI位点，获pFSATBacDual-FA-D4ORF质粒；（3）将pFSATBacDual-FA-D4ORF质粒转化DH10/Bac感受态细胞，然后涂布于LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养，再挑取白色菌落，提取重组Bacmid-FA-D4ORF DNA；（4）将重组Bacmid-FA-D4ORF DNA转染家蚕培养细胞，于26～27℃培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒BmNPV- FA-D4ORF；（5）将重组病毒BmNPV- FA-D4ORF接种家蚕或家蚕培养细胞，发病后，收集家蚕血淋巴或家蚕培养细胞上清，离心纯化得到病毒粒子，为基于杆状病毒载体的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗；或者（6）将重组病毒BmNPV- FA-D4ORF接种家蚕，然后将发病家蚕匀浆、冷冻干燥，制作冻干粉，为基于杆状病毒载体的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗。从实验室角度，步骤（5）的效果较步骤（6）好，但是从生产应用来看，步骤（6）适合推广，因为步骤（6）受外界因素影响小，且易存储，也容易使用。继续研究发现，该现有技术关于干燥处理的部分还需改进。之前，发明人采用-80℃预冻过夜，然后进行低压阶梯升温干燥，获得的冻干粉效果略有提升，但是经过数次重复试验发现，该工艺对产品性能的稳定性还需改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的方法，包括下列步骤：将重组病毒BmNPV- FA-D4ORF接种家蚕，然后将发病家蚕匀浆、冷冻干燥，制作冻干粉，为鲤疱疹病毒II型DNA疫苗；所述冷冻干燥为-80～-50℃预冻过夜，然后进行低压阶梯升温干燥。

本发明中，低压阶梯升温干燥的压力为20Pa～650Pa，优选为50Pa～150Pa；低压阶梯升温干燥的温度为-60℃～20℃，优选为-50℃～-20℃。

优选的，冷冻干燥为-80～-50℃预冻8～12小时；进一步优选-60℃预冻10小时。

本发明中，从节间膜处穿刺接种初化蛹；25℃保护5天，收集重组病毒感染蚕蛹；按1:10加入磷酸盐缓冲液，匀浆；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L；匀浆液经8层沙布过滤后，滤液进行冷冻干燥；冻干粉于4℃低温度保存；冻干粉的含水率小于5%。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明限定冷冻方法，在现有重组病毒BmNPV- FA-D4ORF接种家蚕，然后将发病家蚕匀浆的基础上，得到了疫苗性能保持较好的冻干粉，进一步提高了应用效果，而且重复实验说明该方法稳定性好。本发明没有采用冻干保护剂，防止对疫苗的影响，后续进一步研究冻干保护剂的技术方案。

具体实施方式

本发明在现有技术制备的发病家蚕匀浆基础上，选择新的冷冻干燥工艺，制作冻干粉，扩展了鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的工业应用。下面结合实施例对本发明作进一步描述，其中一些常规方法所示简略：

实施例一 基于杆状病毒载体的鲤疱疹病毒II型DNA疫苗的构建方法及其注射免疫效果

参见CN2018105344579实施例三，前6个步骤与其一致，步骤（7）如下：

（7）用昆虫针醮取P2代重组病毒，从节间膜处穿刺接种初化蛹，25℃保护5天，收集重组病毒感染蚕蛹，按1:10(W/V)加0.01mol/L磷酸盐缓冲液，匀浆。匀浆液经8层沙布过滤后，得到滤液；以上也为CN2018105344579实施例三公开的内容；本实施例的创造性步骤如下：所述滤液进行冷冻干燥，制备蚕蛹冻干粉，冻干粉的含水率小于5%；冻干粉于4℃低温度保存；冷冻干燥工艺为，-60℃预冻10小时，然后在冷冻干燥机中，设计压力为100Pa，-50℃干燥5小时，然后-20℃干燥3小时，得到蚕蛹冻干粉。

（8）以步骤（7）的冻干粉与异育银鲫饲料按1:100（W/W）混匀，饲喂异育银鲫（35-60克/尾）4周，异育银鲫鳃出血病病鱼肾组织1克加10mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液匀浆，以3000转/分离心20分钟，取上清（含鲤疱疹病毒II型），注射接种免疫3周的异育银鲫，24℃水温养殖，统计接种病毒11天前的发病鱼条数，计算免疫保护率。结果显示，口服免疫的保护率达68%。

实施例二

重复实施例一两次，结果显示，口服免疫的保护率分别为67%、68%。说明，本发明方法的稳定性较好。

对比例

将实施例一的冷冻干燥工艺调整为-80℃预冻12小时，然后在冷冻干燥机中，设计压力为50Pa，-60℃干燥5小时，然后调整压力为250Pa，-10℃干燥5小时，得到蚕蛹冻干粉。结果显示，口服免疫的保护率达66%。但是重复两次发现，口服免疫的保护率分别为61%、64%。其稳定性还需改善，从而发明人研发出实施例一的技术方案，其稳定性好，且工业应用简单，虽然冷冻干燥的工艺参数为发明人提出，但是具体冷冻干燥设备为本领域非常常规的设备，因此，本发明的方法重复性好、简单易上手。