具体实施方式

本发明在筛选获得了一种发生了遗传变异的猪伪狂犬病病毒强毒株TRZYT株的基础上，采用已有的方法对TRZYT株的gE基因和gI基因进行缺失来制备弱毒株，所制备的弱毒株能够对所筛选的变异株TRZYT株提供有效的免疫防护。

猪伪狂犬病毒PRV的gE基因是PRV从视网膜、嗅觉上皮细胞、三叉神经节侵入中枢神经组织所必需的。gE基因对猪伪狂犬病毒PRV体毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用，而PRV的gE基因缺失株只能侵入神经系统的第一级，gE基因缺失使得PRV的毒性减弱。

gI基因位于gE基因的前方，其缺失会影响PRV病毒的神经嗜性。PRV缺失gE、gI基因不影响病毒的逆行传播，但是限制病毒在神经元中的顺行传播，从而降低了PRV病毒的毒性。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域的普通技术人员在本发明技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本发明说明书实施例的具体记载。

实施例1：猪伪狂犬病病毒的筛选及鉴定

1、筛选病毒株

2018年11月贵州某发病猪场已注射过猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株疫苗)的猪群发生了猪伪狂犬病的病症，从发病猪群中进行了猪伪狂犬病毒的筛选。具体的筛选步骤如下：

取发病猪的肝脏和淋巴结样品，用pH7.2的0.1M的PBS溶液将样品进行匀浆，反复冻融后，5000r/min离心10min，取上清中加10μL青链霉素，37℃静置1h，经0.22μm滤膜过滤除菌。取滤液10μL加入刚长成单层的Vero细胞(图1)，待出现病变后，收毒，置-80℃反复冻融检测。

2、病毒的检测

使用如下序列的引物对来扩增PRV gE基因片段，采用Oligo 7.0设计引物扩增收集的病毒液，PCR扩增产物进行电泳，其中病毒收集液扩增出了目的条带(图2)；扩增引物的序列信息如下：

F1:5′-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCC-3′；

F2:5′-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAGGC-3′。

将筛选的猪伪狂犬病病毒命名为TRZYT株，经Vero细胞培养驯化，病毒含量达10^7.0TCID₅₀/0.1ml以上。

猪伪狂犬病病毒TRZYT株，于2019年3月15日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17403。

3、病毒的毒力检测

将TRZYT株病毒液(病毒含量为10^7.5TCID₅₀/0.1ml)分装后置于-80℃，于36个月对其滴度进行测定。经测定，病毒含量为10^7.1TCID₅₀/0.1ml。结果表明，该毒株具有较好的稳定性。

10只6周龄BALB/c小鼠随机分成两组，每组5只，一组试用200TCID₅₀稀释毒经颈部皮下进行注射，接种量为0.5mL/只。另一组接种等量的PBS液作为阴性对照。每天观察和记录小鼠的临床症状和死亡情况。结果小鼠接种该病毒液后出现了典型的伪狂犬病症状：发病的小鼠啃咬接种部位，严重的皮肤出血，皮毛脱落，接种120h后，接种病毒组小鼠全部死亡。对照组小鼠无异常变化。表明该毒株为强毒株。

4、动物回归试验

接种4～8日龄PRV抗体阴性仔猪，注射48-72h后出现明显的临床症状，主要表现为体温升高，出现步态不稳、吃乳减少，运动不协调，四肢呈划水状，部分猪只呕吐或者腹泻等症状。解剖可以发现脑膜充血，脑脊髓液量过多，肝、脾等脏器出现坏死；并可以从脑组织中再次分离到PRV病毒株。

5、抗体中和实验

将TRZYT株、猪伪狂犬病病毒QD株(疱疹病毒Ⅰ型Porcine herpesvirus TypeⅠ，保藏编号为CGMCC No.10266，已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)分别经继代和纯化制成灭活疫苗，分别免疫小鼠，免疫剂量2.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫后2周进行采血,分离血清，经50℃灭活后进行中和实验。

将TRZYT株病毒液进行100倍稀释，分别与TRZYT株、猪伪狂犬病病毒QD株制备的血清等体积混合，室温中和1小时后，接种小鼠，接种后观察96-168小时。

结果发现TRZYT株的TRZYT株血清中和组的小鼠都没有出现病症，而猪伪狂犬病病毒QD株血清中和组有30％～40％的小鼠出现猪伪狂犬病病症。即本发明筛选的毒株作为抗原制备的阳性血清对其自身的中和能力明显好于其它毒株制备的阳性血清；表明本发明获得TRZYT病毒株为新的猪伪狂犬病毒变异株。

6、抗原基因的分析

分别对将TRZYT株和QD株的gB、gC、gD、gI基因进行扩增测序，对TRZYT株和QD株的上述四个基因进行分析，结果表明RZYT株和猪伪狂犬病病毒QD株的免疫基因存在氨基上的差异，表明TRZYT株相比于之前的流行株QD株发生了变异(表1)；推测这是QD株作为抗原制备的抗体血清对TRZYT株中和效果不佳的原因所在。

表1：TRZYT株和QD株四种猪伪狂犬病毒的毒力基因的氨基酸序列差异表

攻毒保护试验结果表明，TRZYT株灭活疫苗能对TRZYT株本毒提供完全的免疫保护，而对QD株毒能够提供部分保护。而QD株灭活疫苗能对QD株本毒提供完全的保护，对TRZYT株毒只能够提供部分保护。而Bartha-K61株疫苗对TRZYT株和QD株的保护效果都较差。

这说明TRZYT株和QD株的之间的交叉保护性较差，也说明本发明分离到TRZYT株为猪伪狂犬病病毒的变异株，与经典毒株在攻毒保护上有着显著的差异。

实施例2：猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株的构建

一、构建TRZYT株gE/gI双基因缺失株

从分离的猪伪狂犬病病毒TRZYT株中提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因gE和gI基因的缺失。

参考PRV全基因组序列(BK001744)合成系列引物,分别用来扩增位于US7(gI)基因和US8(gE)基因两侧(含部分gI和gE基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R)。其中L包括部分US6基因和部分gI基因，R包括部分gE基因、全部的US9基因和部分US2基因。

另外同时设计引物扩增EGFP和EGFP真核表达盒,以及用于鉴定基因缺失的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表2。

表2：引物序列信息表

2、gE和gI基因转移载体的构建

以TRZYT株基因组为模板，利用引物gEILF/GEILR和gEIRF/GEIRR，分别扩增出位于gE和gI两侧的序列(含部分gE和gI基因)作为左右重组臂gEIL、gEIR,其中gEIL、gEIR的一端分别带有一个loxP位点。将其克隆到pMD19-T后对其进行PCR和酶切鉴定，鉴定正确后测序，对测序正确的阳性克隆T-gEIL采用Hind III和Pst I进行双酶切,将该片段克隆到同样酶切处理的pBluescript SK载体上，鉴定正确后采用Spe I和Xba I分别对该重组质粒和连有右侧同源臂的重组质粒载体进行双酶切，分别回收含有左侧同源臂的线性化重组质粒和右侧同源臂，将二者进行连接。PCR和酶切进行鉴定。鉴定正确后送测序，测序结果正确的命名为pSKgEILR。

以pCDNA 3.1-EGFP质粒为模板，采用引物EorfF/EorfR扩增EGFP阅读框，连入真核表达载体pVAX1，鉴定正确后采用引物cassetteF/cassetteF扩增出含有EGFP的真核表达盒，连入pMD19-T载体，鉴定正确后命名为pMDEV。

采用Pst I和Spe I对pMDEV进行双酶切，回收真核表达盒，连入同样双酶切的pSKgEILR，鉴定正确后即为gE和gI基因转移载体，命名为pSKgE-EGFP。

3、gE和gI基因缺失株病毒的构建及纯化拯救

3.1、转染

重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待Vero细胞长满90％时进行转染。取TRZYT株基因组3μg，与1μg转移质粒pSKgE-EGFP混合后，按常规方法共转染，详细方法参见Lipofectamine^TM 2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。

3.2、鉴定

TRZYT株基因组与pSKgE-EGFP共转染48h后，观察转染细胞病变形成情况及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/gE^-/gI^-/EGFP。

3.3、缺失株报告基因的剔除

利用Cre-loxP系统介导的位点特异性重组技术剔除报告基因EGFP。取10μg经Cre酶处理过的DNA，采用磷酸钙方法转染Vero细胞，置37℃CO₂培养箱中培养2-3d，待细胞产生80％病变时收获病毒液。将病毒液反复冻融三次后取上清，按2uL/孔接种于24孔板长成单层的Vero细胞，在幵始出现细胞病变时铺上低熔点琼脂糖，荧光显微镜下挑取没有荧光的空斑。如此反复的纯化病毒，直至所有病毒空斑均不带有绿色突光，构建的TRZYT株双基因缺失株命名为PRV TRZYT/gE-/gI-。

3.4、PRV TRZYT/gE-/gI-株的鉴定

提取PRV TRZYT/gE-/gI-基因组DNA，用引物gEIF/gEIR和引物gBF/gBR进行PCR扩增，鉴定拯救的病毒基因内部片段是否缺失，设亲本株、PRV/gE^-/gI^-/EGFP基因组DNA作为对照。

以TRZYT株病毒为模板，成功获得gE和gI基因转移载体；随后将其与PRV基因组同源重组，成功拯救并纯化出含有EGFP标记基因的gE和gI基因缺失株病毒；采用Cre重组酶去除EGFP标记基因后，成功拯救并纯化出不含有EGFP标记基因的gE和gI基因缺失株病毒，命名为PRV TRZYT/gE-/gI-株。

4、重组病毒的遗传稳定性检测

将筛选获得的初代PRV TRZYT/gE-/gI-重组病毒在Vero细胞上连续传代，每5代提取感染细胞总DNA，进行缺失部分基因的PCR检测。

将筛选获得的PRV TRZYT/gE-/gI-初代重组病毒在Vero细胞上连续传代，每5代提取感染细胞总DNA，缺失部分基因的PCR检测结果表明基因的大小均为缺失片段后的大小，表明该重组病毒稳定性好。

5、PRV TRZYT/gE-/gI-毒种安全性试验

用PBS将抗原稀释10倍，肌肉接种100克小鼠四只，每只0.2mL，观察14天，其反应或死亡的不得超过两只。

毒种安全性试验结果表明该疫苗对小鼠是安全的，无伪狂犬特异性症状，不影响生长发育。因此本发明获得的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗(PRV TRZYT/gE-/gI-)是安全的，可以用来制备疫苗。

6、PRV TRZYT/gE-/gI-的免疫效力检测

将6周龄的BALB/C小鼠随机分成3组，每组5只并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV TRZYT/gE-/gI-和DMEM。对照组每只注射100μL DMEM，其它两组后肢肌肉注射10⁴TCID₅₀病毒剂量的疫苗。免疫后每日观察小鼠的临床症状，有无精神萎靡、厌食、瘙痒、震颤等，21d再次称重，并于14d、21d尾静脉采血，分离血清，用TRZYT株全病毒包被的ELISA板检测血清抗体水平。免疫后21d用TRZYT株攻毒，以10⁴TCID₅₀的剂量接种各试验组及对照组，采用后肢肌肉注射，接种病毒后连续观察14d。

免疫后21d，Bartha-K61、PRV TRZYT/gE-/gI-组及DMEM对照组小鼠平均增重分别为4.4g、4.1g、4.5g，增重差异不大，说明缺失株对小鼠的增重无抑制作用。免疫后14d时仍未检到抗体，21d时PRV TRZYT/gE-/gI-组抗体水平明显升高，其他组仍没有明显变化。表明PRV TRZYT/gE-/gI-缺失株可诱导小鼠产生明显的免疫反应。免疫21d后用TRZYT株攻毒，PRV TRZYT/gE-/gI-组保护率明显高于Bartha-K61组。

二、构建QD株gE/gI双基因缺失株

按照构建TRZYT的gE/gI双基因缺失株的方法来构建猪伪狂犬病病毒QD株(CGMCCNo.10266)的gE/gI双基因缺失株。

以PRV QD株病毒为模板获得gE和gI基因转移载体；随后将其与PRV基因组同源重组，拯救并纯化出含有EGFP标记基因的gE和gI基因缺失株病毒；采用Cre重组酶去除EGFP标记基因后，拯救并纯化出不含有EGFP标记基因的gE和gI基因缺失株病毒(命名为PRVQD/gE^-/gI^-株)。

将筛选获得的PRVQD/gE^-/gI^-株初代重组病毒在Vero细胞上连续传代，每5代提取感染细胞总DNA，缺失部分基因的PCR检测结果表明基因的大小均为缺失片段后的大小，表明该重组病毒稳定性好。

毒种安全性试验结果表明该疫苗对小鼠是安全的，无伪狂犬特异性症状，不影响生长发育，可以用来制备疫苗。

实施例3制备猪伪狂犬病毒弱毒株疫苗

以Vero细胞作为培养细胞，按常规的方法猪伪狂犬病毒培养方法,以PRV TRZYT/gE-/gI-病毒株、PRV QD/gE-/gI-株分别感染细胞,当细胞病变(CPE)达90％左右时收获病毒，置-80℃反复冻融三次，测定病毒的TCID₅₀。根据收获病毒液的毒价，进行适当的稀释，稀释后的PRV TRZYT/gE-/gI-病毒液、PRV QD/gE-/gI-株病毒液与保护剂的体积比为1:1:1.5，充分混合，其中蔗糖终浓度为20％，明胶终浓度为4.8％。每瓶装2.5mL，并置冻干机中进行冻干。疫苗中PRV TRZYT/gE-/gI-病毒、PRV QD/gE-/gI-病毒的含量不低于10⁷TCID₅₀/0.1ml。

制备的冻干疫苗微黄色海绵状疏松圆块，样品易与瓶身脱离且加入水后能够迅速溶解。随机抽检样品均无细菌、霉菌生长，无支原体生长，外源病毒检测呈阴性。疫苗剩余水分约为2％，所有抽检样品真空度合格。

安全检验试验经10倍剂量注射后小鼠无不良反应，且全部健活。小鼠效力检测实验显示对照组小鼠全部死亡，免疫小鼠全部键活。

疫苗使用TRZYT和QD株进行攻毒，攻毒结果表明制备的疫苗对TRZYT和QD株的保护率明显高于市售的Bartha-K61疫苗，结果表明本发明的疫苗在临床上的免疫效果明显优于现在广泛使用的Bartha-K61疫苗。且本发明疫苗对猪伪狂犬病病毒区域流行株免疫效果好于其它疫苗。

序列表

<110> 铜仁职业技术学院

<120> 一种猪伪狂犬病毒弱毒株冻干疫苗

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 914

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Ala Gly Gly Gly Leu Trp Arg Gly Pro Arg Gly His Arg Pro

1 5 10 15

Gly His His Gly Gly Ala Gly Leu Gly Arg Leu Trp Pro Ala Pro His

20 25 30

His Ala Ala Ala Ala Arg Gly Ala Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Ala Ala Thr Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala

50 55 60

Ala Ser Ala Ser Pro Ala Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asp Gly Phe

65 70 75 80

Ser Ala Glu Glu Ser Leu Glu Glu Ile Asp Gly Ala Val Ser Pro Gly

85 90 95

Pro Ser Asp Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Leu Asp Ala Arg Thr

100 105 110

Ala Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro

115 120 125

Pro Pro Ser Gly Ser Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ala Cys

130 135 140

Pro Glu Tyr Ser Gln Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Leu

145 150 155 160

Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His Ile Tyr Tyr

165 170 175

Lys Asn Val Ile Val Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala

180 185 190

Ile Thr Asn Arg Phe Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gln Glu Ile

195 200 205

Thr Asp Val Ile Asp Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr

210 215 220

Val Arg Asn Asn His Lys Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro

225 230 235 240

Val Glu Val Asp Leu Arg Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg

245 250 255

Gly Trp His Thr Thr Asn Asp Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala Gly

260 265 270

Phe Tyr His Thr Gly Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu

275 280 285

Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp

290 295 300

Ile Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Ala His Gly

305 310 315 320

Glu His Ile Gly Tyr Ala Pro Gly Arg Phe Gln Gln Val Glu His Tyr

325 330 335

Tyr Pro Ile Asp Leu Asp Ser Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr

340 345 350

Arg Asn Phe Leu Arg Thr Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala

355 360 365

Pro Lys Thr Arg Arg Val Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu

370 375 380

Glu Met Ile Arg Asp Glu Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser

385 390 395 400

Arg Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gln Leu Asp Leu

405 410 415

Gln Arg Val His Leu Gly Asp Cys Val Leu Arg Glu Ala Ser Glu Ala

420 425 430

Ile Asp Ala Ile Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Asn Thr His Val Leu Ala

435 440 445

Gly Asp Lys Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala

450 455 460

Phe Arg Pro Leu Ile Ser Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Glu

465 470 475 480

Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ser Pro Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu

500 505 510

Pro Pro Ala Val Asn Gly Thr Gly His Leu Arg Ile Thr Thr Gly Ser

515 520 525

Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Ala His

530 535 540

Val Asn Asp Met Leu Ser Arg Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln

545 550 555 560

Asn Lys Asp Arg Thr Leu Trp Gly Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser

565 570 575

Ala Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gln Arg Val Ser Ala Arg Met Leu

580 585 590

Gly Asp Val Met Ala Ile Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val

595 600 605

Tyr Val Gln Asn Ser Met Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr

610 615 620

Ser Arg Pro Leu Val Thr Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val Ile Glu

625 630 635 640

Gly Gln Leu Gly Asp Asp Asn Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp Leu Ile

645 650 655

Glu Pro Cys Thr Gly Asn His Arg Arg Tyr Phe Lys Leu Gly Gly Gly

660 665 670

Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro

675 680 685

Glu Thr Ile Ser Thr Arg Val Thr Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp

690 695 700

Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp

705 710 715 720

Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His

725 730 735

Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn

740 745 750

Val Val Leu Leu Arg Gly Ile Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp

755 760 765

Val Gly Ala Ala Val Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val

770 775 780

Ile Ser Ala Val Gly Gly Met Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe Gly

785 790 795 800

Ala Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Phe

805 810 815

Leu Ala Tyr Arg His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Asn Pro Met Lys Ala

820 825 830

Leu Tyr Pro Val Thr Thr Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Val Glu Glu

835 840 845

Asp Asp Val Asp Glu Ala Lys Leu Asp Gln Ala Arg Asp Met Ile Arg

850 855 860

Tyr Met Ser Ile Val Ser Ala Leu Glu Gln Gln Glu His Lys Ala Arg

865 870 875 880

Lys Lys Asn Ser Gly Pro Ala Leu Leu Ala Ser Arg Val Gly Ala Met

885 890 895

Ala Thr Arg Arg Arg His Tyr Gln Arg Leu Glu Asn Glu Asp Pro Asp

900 905 910

Ala Pro

<210> 2

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Ala Arg Ala Met Leu Ala Leu Leu Ala Leu Tyr Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ile Ala Ala Ala Pro Ser Ser Thr Thr Ala Leu Gly Thr Thr

20 25 30

Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Ser Ala Gly Glu Leu Ser Pro

35 40 45

Ser Pro Pro Ser Thr Pro Glu Pro Val Ser Gly Thr Thr Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Thr Pro Ala Ala Val Ser Thr Pro Arg Val Pro Pro Pro Ser

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Lys Pro Gln Arg Asn Gly Asn Arg Thr Arg Val His

85 90 95

Gly Asp Lys Ala Thr Ser His Gly Arg Lys Arg Ile Val Cys Arg Glu

100 105 110

Arg Leu Phe Ser Ala Arg Val Gly Asp Ala Val Ser Phe Gly Cys Ala

115 120 125

Val Val Pro Arg Ala Gly Glu Thr Phe Glu Val Arg Phe Cys Arg Arg

130 135 140

Gly Arg Phe Arg Ser Pro Asp Ala Asp Pro Glu Tyr Phe Asp Glu Pro

145 150 155 160

Pro Arg Pro Glu Leu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asn

165 170 175

Ala Ser Leu Ala His Ala Asp Ala Leu Ala Ser Ala Val Val Val Glu

180 185 190

Gly Glu Arg Ala Thr Val Ala Asn Val Ser Gly Glu Val Ser Val Arg

195 200 205

Val Ala Ala Ala Asp Ala Glu Thr Glu Gly Val Tyr Thr Trp Arg Val

210 215 220

Leu Ser Ala Asn Gly Thr Glu Val Arg Ser Ala Asn Val Ser Leu Val

225 230 235 240

Leu Tyr His Gln Pro Glu Phe Gly Leu Ser Ala Pro Pro Val Leu Phe

245 250 255

Gly Glu Pro Phe Arg Ala Val Cys Val Val Arg Asp Tyr Tyr Pro Arg

260 265 270

Arg Ser Val Arg Leu Arg Trp Phe Ala Asp Glu His Pro Val Asp Ala

275 280 285

Ala Phe Val Thr Asn Ser Thr Val Ala Asp Glu Leu Gly Arg Arg Thr

290 295 300

Arg Val Ser Val Val Asn Val Thr Arg Ala Asp Val Pro Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ala Asp Asp Ala Asp Ala Leu Ala Pro Ser Leu Arg Cys Glu Ala

325 330 335

Val Trp Tyr Arg Asp Ser Val Ala Ser Gln Arg Phe Ser Glu Ala Leu

340 345 350

Arg Pro His Val Tyr His Pro Ala Ala Val Ser Val Arg Phe Val Glu

355 360 365

Gly Phe Ala Val Cys Asp Gly Leu Cys Val Pro Pro Glu Ala Arg Leu

370 375 380

Ala Trp Ser Asp His Ala Ala Asp Thr Val Tyr His Leu Gly Ala Cys

385 390 395 400

Ala Glu His Pro Gly Leu Leu Asn Val Arg Ser Ala Arg Pro Leu Ser

405 410 415

Asp Leu Asp Gly Pro Val Asp Tyr Thr Cys Arg Leu Glu Gly Met Pro

420 425 430

Ser Gln Leu Pro Ile Phe Glu Asp Thr Gln Arg Tyr Asp Ala Ser Pro

435 440 445

Thr Ser Val Ser Trp Pro Val Val Thr Ser Met Ile Thr Val Ile Ala

450 455 460

Gly Ile Ala Ile Leu Ala Ile Val Leu Val Ile Met Ala Thr Cys Val

465 470 475 480

Tyr Tyr Arg Arg Ser Ala Leu

485

<210> 3

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu

1 5 10 15

Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala

20 25 30

Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser

35 40 45

Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp

50 55 60

Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu

65 70 75 80

Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val

85 90 95

Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile

100 105 110

Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg Cys Arg Arg

115 120 125

Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro

130 135 140

Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn

145 150 155 160

Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu

165 170 175

Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala

180 185 190

Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp

195 200 205

Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe

210 215 220

Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys

225 230 235 240

Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala

245 250 255

Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg

260 265 270

Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro

275 280 285

Ala Pro Pro Gly Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg

305 310 315 320

Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala

325 330 335

Glu Pro Phe Pro Pro Arg Thr Thr Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His

340 345 350

Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val

355 360 365

Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr

370 375 380

Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro

385 390 395 400

Gly Pro

<210> 4

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Met Met Val Ala Arg Asp Val Thr Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Val Gly Gly Val

20 25 30

Leu Phe Arg Gly Ala Gly Val Ser Val His Val Ala Gly Ser Ala Val

35 40 45

Leu Val Pro Gly Asp Ala Pro Asn Leu Thr Ile Asp Gly Thr Leu Leu

50 55 60

Phe Leu Glu Gly Pro Ser Pro Ser Asn Tyr Ser Gly Arg Val Glu Leu

65 70 75 80

Leu Arg Leu Asp Pro Lys Arg Ala Cys Tyr Thr Arg Glu Tyr Ala Ala

85 90 95

Glu Tyr Asp Leu Cys Pro Arg Val His His Glu Ala Phe Arg Gly Cys

100 105 110

Leu Arg Lys Arg Glu Pro Leu Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Val Glu

115 120 125

Ala Arg Arg Leu Leu Phe Val Ser Arg Pro Ala Ser Gly Asp Ala Gly

130 135 140

Ser Tyr Val Leu Arg Val Arg Val Asn Gly Thr Thr Asp Leu Phe Val

145 150 155 160

Leu Thr Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Arg Pro Val Pro Thr Ser Pro

165 170 175

Pro Ala Asp Glu Cys Arg Pro Val Val Gly Ser Trp His Asp Ser Leu

180 185 190

Arg Val Val Asp Pro Ala Glu Asp Ala Val Phe Thr Thr Gln Pro Pro

195 200 205

Pro Glu Pro Glu Pro Pro Thr Thr Pro Ala Pro Pro Arg Gly Thr Gly

210 215 220

Ala Thr Pro Glu Pro Arg Ser Asp Glu Glu Glu Glu Gly Asp Ala Glu

225 230 235 240

Thr Thr Thr Pro Thr Leu Thr Pro Ala Pro Gly Thr Leu Asp Ala Asn

245 250 255

Gly Thr Met Val Leu Asn Ala Ser Val Val Ser Arg Val Leu Leu Ala

260 265 270

Ala Ala Asn Ala Thr Ala Gly Ala Arg Gly Pro Gly Lys Ile Ala Met

275 280 285

Val Leu Gly Pro Thr Ile Val Val Leu Leu Ile Phe Leu Gly Gly Ile

290 295 300

Ala Cys Val Ala Arg Arg Cys Ala Arg Asn Arg Ile Tyr Arg Pro Arg

305 310 315 320

Pro Gly Arg Gly Ser Ala Val His Ala Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro

325 330 335

Pro Asn Pro Val Ala Gly Ala Pro Val Pro Gln Pro Lys Met Thr Leu

340 345 350

Ala Glu Leu Arg Gln Lys Leu Ala Thr Ile Ala Glu Glu Gln

355 360 365