具体实施方式

提供了一种在第一受试者中引发抗HSV-2和/或HSV-1感染的免疫应答的方法，包括将来自用HSV-2免疫的妊娠女性的一定量的产物被动转移至第一受试者，该HSV-2在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失，并且其中，通过在表达单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D的互补细胞中增殖HSV-2，所述HSV-2在表型上与所述HSV-1糖蛋白D互补，其中，产物包含由此诱导的抗体，有效引发第一受试者中的抗HSV-2和/或HSV-1感染的免疫应答，其中，第一受试者是胎儿或新生儿。

在实施方式中，产物包括妊娠女性的血清。

在实施方式中，产物包括妊娠女性的母乳。

在实施方式中，第一受试者是胎儿。

在实施方式中，第一受试者是新生儿。

在实施方式中，第一受试者由第二受试者所生。

在实施方式中，妊娠女性怀有胎儿

在实施方式中，第一受试者和妊娠女性是人类。

在实施方式中，产物包含通过用具有缺失的HSV-2免疫怀孕女性而引发的抗体。在实施方式中，产物包含FcγRIV激活抗体。在实施方式中，产物包含IgG1抗体和IgG2抗体。在实施方式中，产物包含抗-HSV-1IgG或抗-HSV-2IgG。

在实施方式中，方法引发针对第一受试者中的HSV-2的免疫应答。

在实施方式中，方法引发针对第一受试者中的HSV-1的免疫应答。

在实施方式中，产物还包含免疫佐剂。

在实施方式中，产物还包含在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的HSV-2，并且其中，通过在表达单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D的互补细胞中增殖HSV-2，该HSV-2在表型上与HSV-1糖蛋白D互补。

提供了一种抑制新生儿中的围产期HSV-1和/或HSV-2感染的方法，包括向怀有将成为新生儿的胎儿的女性给予一定量的HSV-2，该HSV-2在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失，并且其中，通过在表达单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D的互补细胞中增殖HSV-2，所述HSV-2在表型上与所述HSV-1糖蛋白D互补，有效抑制新生儿中的围产期HSV-1和/或HSV-2感染。

提供了一种抑制从母亲到其新生儿的HSV-1和/或HSV-2病毒传播的方法，包括向母亲给予一定量的HSV-2，该HSV-2在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失，并且其中，所述HSV-2在表型上与单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D互补，有效抑制从母亲到其新生儿的HSV-1和/或HSV-2病毒传播。

在实施方式中，母亲怀有将成为新生儿的胎儿。

在实施方式中，HSV-1感染和/或HSV-1病毒传播受到抑制。

在实施方式中，HSV-2感染和/或HSV-2病毒传播受到抑制。

在实施方中，引发针对HSV-1的免疫应答。

在实施方中，引发针对HSV-2的免疫应答。

在实施方式中，互补细胞是VD60细胞。

在实施方式中，妊娠女性、母亲或第二受试者对于HSV-1是血清阴性的、对于HSV-2是血清阴性的、或对于HSV-1和HSV-2两者均是血清阴性的。

在实施方式中，向妊娠女性或母亲皮下给予在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的HSV-2。

在实施方式中，在初始皮下给予在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的HSV-2之后，向妊娠女性或母亲给予在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的皮下加强剂量的HSV-2。

提供了一种分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列：

MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRARASCKYALLRIPAACLTSKAAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHAPAAPSNPGLIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDDAPPSHQPLFY(HSV-2参照株HG52)。

在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D。

在实施方式中，HSV-1糖蛋白D包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列：

MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALLRIPPSACLSPPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMRRRTQKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY(HSV-1参照株F)。

在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。(例如，对于HSV-2基因组和U_S6基因参见Dolan等人，J Virol.1998年3月；72(3)：2010-2021.(PMCID：PMC109494)“The Genome Sequence of Herpes Simplex Virus Type 2”，通过引证以其全文并入本文)。

在一个实施方式中，其中缺失HSV-2糖蛋白D编码基因的HSV-2是具有如在以下Genbank列出的序列中的一个中所示的基因组(缺失之前)的HSV-2：HSV-2(G)(KU310668)、HSV-2(4674)(KU310667)、B3x1.1(KU310657)、B3x1.2(KU310658)、B3x1.3(KU310659)、B3x1.4(KU310660)、B3x1.5(KU310661)、B3x2.1(KU310662)、B3x2.2(KU310663)、B3x2.3(KU310664)、B3x2.4(KU310665)、B3x2.5(KU310666)。

还提供了一种分离的重组HSV-2的病毒颗粒，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

在一个实施方式中，病毒颗粒还在其脂质双层上包含HSV-1糖蛋白D。在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。

在一个实施方式中，病毒还在其脂质双层上包含HSV-1。在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。

提供了一种在其中包含重组HSV-2基因组的分离细胞，该重组HSV-2基因组不包含HSV-2U_S6基因。

在一个实施方式中，重组HSV-2基因组由于具有使HSV-2糖蛋白D基因从其缺失而是重组的。

在一个实施方式中，细胞是提供不由重组HSV-2基因组编码的表达的HSV 1或2糖蛋白的互补细胞。在一个实施方式中，互补细胞包含编码HSV-1糖蛋白D的异源核酸。在一个实施方式中，细胞在其膜上表达HSV-1糖蛋白D。在细胞的一个实施方式中，HSV-1糖蛋白D由异源核酸编码，该异源核酸是HSV-1糖蛋白D基因或是具有与HSV-1糖蛋白D基因一致的序列的核酸。

还提供了一种疫苗组合物，包含如本文描述的重组HSV-2病毒或如本文描述的病毒颗粒。在一个实施方式中，疫苗包含免疫佐剂。在一个实施方式中，疫苗不包含免疫佐剂。在本文描述的包含重组HSV-2的疫苗、组合物或药物组合物的一个实施方式中，HSV-2是活的。

还提供了一种组合物，包含如本文描述的重组HSV-2病毒或如本文描述的病毒颗粒，其中，该病毒或病毒颗粒的基因组包含至少一个第二基因的缺失，其中，该第二基因是HSV-2病毒复制或毒力所必需的。

一种药物组合物，包含如本文描述的重组HSV-2病毒或如本文描述的病毒颗粒和药学上可接受的载体。

在一个实施方式中，组合物或药物组合物或疫苗被配制为使得其适合于向人类受试者皮下给予。在一个实施方式中，组合物或药物组合物或疫苗配制为使得其适合于向人类受试者阴道内给予。在一个实施方式中，组合物或药物组合物或疫苗配制为使得其适合于向人类受试者肌肉内、鼻内、或粘膜给予。

还提供了一种引发受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者以有效引发受试者中免疫应答的量给予一定量的(i)如本文描述的重组HSV-2病毒；(ii)如本文描述的其病毒颗粒；(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种治疗受试者中的HSV-2感染或治疗受试者的由HSV-1、HSV-2或共感染引起的疾病的方法，包括向受试者给予一定量的(i)如本文描述的重组HSV-2病毒；(ii)如本文描述的其病毒颗粒；(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。在一个实施方式中，方法包括治疗由HSV-1、HSV-2或共感染引起的HSV-1或HSV-2病理。在方法的一个实施方式中，由HSV-1、HSV-2或共感染引起的疾病是生殖器溃疡。在方法的一个实施方式中，由HSV-1、HSV-2或共感染引起的疾病是疱疹、口腔疱疹、疱疹性瘭疽(herpes whitlow)、生殖器疱疹、疱疹湿疹、外伤性疱疹(herpesgladiatorum)、HSV角膜炎、HSV视网膜炎、HSV脑炎、或HSV脑膜炎。

在本文关于治疗或接种HSV-1、HSV-2或共感染(即，用HSV-1和HSV-2两者感染)的方法的一个实施方式中，在治疗HSV-1感染、治疗HSV-2感染、治疗共感染的分离的、单独的实施方式中，各自提供了一种针对HSV-1感染接种疫苗、针对HSV-2感染接种以及针对共感染接种。

还提供了一种针对HSV-1、HSV-2或共感染接种向受试者进行疫苗接种的方法，包括向受试者以有效针对HSV-1、HSV-2或共感染对受试者进行疫苗接种的量给予一定量的(i)如本文描述的重组HSV-2病毒；(ii)如本文描述的其病毒颗粒；(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种使受试者对HSV-1、HSV-2或共感染免疫的方法，包括向受试者以有效使受试者对HSV-1、HSV-2或共感染免疫的量给予一定量的(i)如本文描述的重组HSV-2病毒；(ii)如本文描述的其病毒颗粒；(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

在方法的一个实施方式中，向受试者给予皮下或阴道内初始剂量，并且皮下或阴道内给予第二剂量。在方法的一个实施方式中，向受试者给予尽可能多的皮下或阴道内初始剂量，以引发抗-HSV抗体和T细胞。

还提供了一种产生重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的病毒颗粒的方法，该重组单纯疱疹病毒-2在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失并且在其脂质双层上包含HSV-1或HSV-2糖蛋白D，该方法包括在允许重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)复制的条件下，用重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)感染包含编码HSV-1或HSV-2糖蛋白D的异源核酸的细胞，并且回收由细胞产生的HSV-2病毒颗粒，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

在一个实施方式中，细胞在其膜上表达HSV-1或HSV-2糖蛋白D。

还提供了一种具有与野生型HSV-2的基因组相同的序列的重组核酸，除了重组核酸不包含编码HSV-2糖蛋白D的序列。在一个实施方式中，重组核酸是DNA。在一个实施方式中，重组核酸是RNA。

还提供了一种用于治疗或预防受试者中的HSV-1、HSV-2或共感染的分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含单纯疱疹病毒-1(HSV-1)或单纯疱疹病毒-2(HSV-2)糖蛋白D。在分离的重组HSV-2的一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。

还提供了一种用于治疗或预防受试者中的HSV-1、HSV-2或共感染的分离的重组HSV-2的病毒颗粒，该病毒颗粒在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。在一个实施方式中，病毒颗粒还包含在其脂质双层上的HSV-1或HSV-2糖蛋白D。在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。

在描述的病毒或病毒颗粒的实施方式中，HSV-1、HSV-2或共感染引起生殖器溃疡。

提供了一种分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含表面糖蛋白，该表面糖蛋白是单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含非HSV-2病毒表面糖蛋白。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含细菌表面糖蛋白。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2还在其脂质双层上包含寄生虫表面糖蛋白，其中，寄生虫是哺乳动物的寄生虫。

在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。在一个实施方式中，表面糖蛋白由已插入到重组HSV-2的基因组中的转基因编码。在一个实施方式中，表面糖蛋白通过用具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的重组HSV-2感染细胞而存在于其脂质双层上，其中，该细胞被转染或已被转染，以在其细胞膜上表达该表面糖蛋白，并且其中，包含存在于脂质双层上的表面糖蛋白的重组HSV-2由细胞产生。在一个实施方式中，病毒糖蛋白来自HIV、肠道病毒、RSV、流感病毒、副流感病毒、猪冠状呼吸道病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、布尼亚病毒、CMV、或丝状病毒。在一个实施方式中，糖蛋白是HIV gp120。在一个实施方式中，丝状病毒是埃博拉病毒。在一个实施方式中，病毒是HIV、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、衣原体(chlamydia)、溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)、海分枝杆菌(M.marinum)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、M.absenscens、淋病奈瑟菌(Neisseria gonnorhea)、或密螺旋体(Treponeme)。在一个实施方式中，密螺旋体是苍白密螺旋体(Treponeme palidum)。

还提供了一种分离的重组HSV-2的病毒颗粒，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

在一个实施方式中，分离的重组HSV-2的病毒颗粒还在其脂质双层上包含表面糖蛋白，其为单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2的病毒颗粒还在其脂质双层上包含非HSV-2病毒表面糖蛋白。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2的病毒颗粒还在其脂质双层上包含细菌表面糖蛋白。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2的病毒颗粒还在其脂质双层上包含寄生虫生表面糖蛋白，其中，寄生虫是哺乳动物的寄生虫。在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。在一个实施方式中，表面糖蛋白由已插入到病毒颗粒的重组HSV-2的基因组中的转基因编码。在一个实施方式中，表面糖蛋白通过用具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失的重组HSV-2感染细胞而存在于其脂质双层上，其中，该细胞被转染或已被转染，以在其细胞膜上表达该表面糖蛋白，并且其中，包含存在于脂质双层上的表面糖蛋白的重组HSV-2由细胞产生。在一个实施方式中，病毒颗粒已由此回收。在一个实施方式中，病毒糖蛋白来自HIV、肠道病毒、RSV、流感病毒、副流感病毒、猪冠状呼吸道病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、布尼亚病毒、CMV、或丝状病毒。在一个实施方式中，糖蛋白是HIV gp120。在一个实施方式中，丝状病毒是埃博拉病毒。在一个实施方式中，病毒是HIV、结核分枝杆菌、衣原体、溃疡分枝杆菌、海分枝杆菌、麻风分枝杆菌、M.absenscens、淋病奈瑟菌、或密螺旋体。在一个实施方式中，密螺旋体是苍白密螺旋体。

还提供了一种分离的细胞，在其中包含如本文描述的病毒或本文描述的病毒颗粒，其中，该细胞在人类中不存在。在细胞的一个实施方式中，细胞包含编码HSV-1糖蛋白D的异源核酸。在细胞的一个实施方式中，该细胞在其膜上表达HSV-1糖蛋白D。

在细胞的一个实施方式中，HSV-1糖蛋白D由异源核酸编码，该异源核酸是HSV-1糖蛋白D基因或是具有与HSV-1糖蛋白D基因一致的序列的核酸。

一种疫苗组合物，包含如本文描述的病毒或如本文描述的病毒颗粒。在疫苗组合物的一个实施方式中，该疫苗组合物包含免疫佐剂。

还提供了一种组合物，包含如本文描述的病毒或如本文描述的病毒颗粒，其中，该病毒或病毒颗粒的基因组包含至少一个第二基因的缺失，其中，该第二基因是HSV-2病毒复制所必需的。在一个实施方式中，组合物包含来自哺乳动物的血清，或源自来自哺乳动物的血清，其中提前向哺乳动物引入病毒或病毒颗粒以引发免疫应答。

还提供了一种药物组合物，包含如本文描述的病毒或如本文描述的病毒颗粒和药学上可接受的载体。

还提供了一种引发受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者以有效引发受试者中的免疫应答的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种治疗受试者中的HSV-2感染或治疗受试者中的由HSV-2感染引起的疾病的方法，包括向受试者以有效治疗受试者中的HSV-2感染或治疗由HSV-2感染引起的疾病的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种针对HSV-2感染对受试者进行疫苗接种的方法，包括向受试者以有效针对HSV-2对受试者进行疫苗接种的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种使受试者对HSV-2感染免疫的方法，包括向受试者以有效使受试者对HSV-2感染免疫的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

HSV-2和HSV-1疾病是本领域已知的，并且也在本文中描述。HSV-2和HSV-1疾病的治疗和预防各自单独涵盖。还涵盖HSV-2和HSV-1共感染的治疗或预防。预防理解为意指如与未治疗的受试者相比，改善了用本文描述的病毒、病毒颗粒、疫苗或组合物治疗的受试者中有关疾病或感染发展程度。

还提供了一种产生重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的病毒颗粒的方法，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失并且在其脂质双层上包含HSV-1糖蛋白D，该方法包括在允许重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)复制的条件下，用重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)感染包含编码HSV-1糖蛋白D的异源核酸的细胞，并且回收由细胞产生的在其脂质双层上包含HSV-1糖蛋白D的重组HSV-2病毒颗粒，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

还提供了一种产生重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的病毒颗粒的方法，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失并且在其脂质双层上包含非HSV-2表面糖蛋白，该方法包括在允许重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)复制的条件下，用重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)感染包含编码非HSV-2表面糖蛋白的异源核酸的细胞，并且回收由细胞产生的在其脂质双层上包含非HSV-2表面糖蛋白的重组HSV-2病毒体，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

还提供了一种具有与HSV-2的基因组相同的序列的重组核酸，除了该序列不包含编码HSV-2糖蛋白D的序列。

还提供了一种用于治疗或预防受试者中的HSV-2感染的分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

还提供了一种用于在受试者中治疗或预防HSV-1感染的分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

还提供了一种用于在受试者中治疗或预防HSV-2感染的分离的重组HSV-2的病毒颗粒，在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失。

还提供了一种治疗受试者的HSV-1感染、或HSV-1和HSV-2共感染或治疗受试者的由HSV-2感染或HSV-1和HSV-2共感染引起的疾病的方法，包括向受试者以有效治疗受试者的HSV-2感染或治疗由HSV-2感染引发的疾病的量、或有效治疗受试者的HSV-1和HSV-2共感染或治疗由HSV-1和HSV-2共感染引发的疾病的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)本文描述的药物组合物。

还提供了一种针对HSV-1感染、或HSV-1和HSV-2共感染对受试者进行疫苗接种的方法，包括向受试者以有效针对HSV-1感染、或HSV-1和HSV-2共感染对受试者进行疫苗接种的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

还提供了一种使受试者对HSV-1感染、或HSV-1和HSV-2共感染免疫的方法，包括向受试者以有效使受试者对HSV-1感染、或HSV-1和HSV-2共感染免疫的量给予一定量的(i)如本文描述的病毒；(ii)如本文描述的病毒颗粒，(iii)如本文描述的疫苗；(iv)如本文描述的组合物；或(v)如本文描述的药物组合物。

在本文用于免疫、接种或引发免疫应答的方法的一个实施方式中，可以实现病毒颗粒或病毒或由此诱导的抗体或免疫因子从一位受试者至另一位受试者的被动转移。相关产物可以在从一位受试者获得后并且给予至第二位受试者之前进行处理。在本文描述的本发明的一个优选实施方式中，受试者是哺乳动物受试者。在一个实施方式中，哺乳动物受试者是人类受试者。

提供了一种在第一受试者中引发针对HSV-2和/或HSV-1感染的免疫应答的方法，包括将来自用HSV-2免疫的第二受试者的一定量的产物被动转移至受试者，该HSV-2在其基因组中具有全部HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失，并且其中，通过在表达单纯疱疹病毒-1(HSV-1)糖蛋白D的互补细胞中增殖HSV-2，该HSV-2在表型上与HSV-1糖蛋白D互补，其中，产物包含HSV-2或由此诱导的抗体或免疫因子，有效地引发针对HSV-2和/或HSV-1感染的免疫应答。

在实施方式中，产物包括第二受试者的血清。

在实施方式中，第二受试者是妊娠女性。

在实施方式中，第一受试者是胎儿或新生儿。在实施方式中，第二受试者怀有第一受试者。

在实施方式中，产物包含通过用HSV-2免疫第二受试者引发的抗体。

还提供了一种分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，该重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失并且还包含病原体的异源抗原。在一个实施方式中，异源抗原是蛋白质、肽、多肽、或糖蛋白。在一个实施方式中，异源抗原相对于HSV-2是异源抗原，但是是在相关“病原体”上或相关“病原体”中发现的抗原。在本文描述了病原体、病毒和细菌。在一个实施方式中，病原体是哺乳动物的细菌病原体或哺乳动物的病毒病原体。在一个实施方式中，抗原或编码病原体的转基因实际上不从病原体中取出或物理移除，但仍然具有与病原体抗原或编码核酸序列相同的序列。在一个实施方式中，分离的重组HSV-2在其脂质双层上包含病原体的异源抗原。在分离的重组HSV-2的一个实施方式中，病原体是细菌或病毒的。在一个实施方式中，病原体是哺乳动物的寄生物。在一个实施方式中，HSV-2糖蛋白D编码基因是HSV-2U_S6基因。在一个分离的重组HSV-2的实施方式中，异源抗原由已插入重组HSV-2的基因组中的转基因编码。

还提供了一种在受试者中诱导抗原性靶标的抗体依赖性的细胞介导细胞毒性(ADCC)的方法，包括向受试者以有效诱导抗原性靶标的抗体依赖性的细胞介导细胞毒性(ADCC)的量给予分离的重组单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，该重组单纯疱疹病毒-2在其基因组中具有HSV-2糖蛋白D编码基因的缺失并且在其脂质双层上还包含异源抗原。

表达适当的转基因的重组HSV-2ΔgD^-/+gD-/+会选择性地诱导保护免受病原体的皮肤或粘膜感染的抗体和细胞免疫应答。

在一个实施方式中，异源抗原是表面抗原。

在一个实施方式中，转基因编码来自HIV、结核分枝杆菌、衣原体、溃疡分枝杆菌、海分枝杆菌、麻风分支杆菌、M.absenscens、淋病奈瑟菌或密螺旋体的抗原。在一个实施方式中，密螺旋体是苍白密螺旋体。在一个实施方式中，转基因是结核分枝杆菌生物被膜编码基因。在一个实施方式中，转基因是HIV gp120编码基因。

在一个实施方式中，异源抗原是抗原性靶标的表面抗原。在一个实施方式中，异源抗原是寄生虫抗原。在一个实施方式中，异源抗原是细菌抗原或病毒抗原。

在一个实施方式中，抗原性靶标是病毒并且是拉沙病毒、人类免疫缺陷病毒、RSV、肠道病毒、流感病毒、副流感病毒、猪冠状呼吸道病毒、狂犬病毒、布尼亚病毒、或丝状病毒。

在一个实施方式中，抗原性靶标是细菌并且是结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、海洋分枝杆菌、麻风分支杆菌、M.absenscens、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、或苍白密螺旋体。

在一个实施方式中，分离的重组HSV-2转基因是结核分枝杆菌生物被膜的基因，或其中，转基因是HIV gp120编码基因。

在本文描述方法的优选实施方式中，受试者是人类。在本文描述方法的一个实施方式中，受试者尚未被HSV-1、HSV-2感染或共感染。在本文描述方法的一个实施方式中，受试者已被HSV-1、HSV-2感染或共感染。

如在本文描述，共感染意指HSV-1和HSV-2的共感染。

除非本文另外说明或上下文明显矛盾，否则本文描述的各种要素的所有组合均在本发明的范围内。

将从以下实验详述更好地理解本发明。但是，本领域的技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅是说明如后附的权利要求中更充分地描述的本发明。

实验详述

实施例1

此处公开了HSV-2的gD(U_S6)基因的以遗传方式基因工程化缺失突变体以及在小鼠感染模型中对HSV-2阴道内攻击评价的其安全性、免疫原性和疫苗功效。将gD基因替换为编码绿色荧光蛋白(gfp)的DNA片段，并且将表达HSV-1gD的Vero细胞(VD60细胞)用该构建体转染，并筛选形成绿色空斑的同源重组病毒。分子分析显示已经工程化精确的重组，其在互补的VD60细胞中复制至高滴度但是在非互补的细胞上增殖时无感染性。用10⁷Pfu/小鼠的互补的无gD病毒(对于基因型gD缺失，但是通过在VD60细胞上生长而表型上互补的病毒，本文中命名为HSV-2ΔgD^-/+)阴道内攻击野生型小鼠或SCID小鼠未显示毒力，而剂量低至10⁴pfu/小鼠的亲本野生型病毒是100％致死的。另外，用HSV-2ΔgD^-/+免疫小鼠产生了对抗HSV-2临床分离株阴道内攻击的完全保护。测量HSV-2ΔgD^-/+激发的稳健体液免疫力和细胞免疫力，并且得出结论：体内的生产性感染需要gD，并且这种必需糖蛋白缺失的减毒株激发了抗HSV-2的保护性免疫。因此，HSV-2ΔgD^-/+是预防或治疗生殖器疱疹的有前景的疫苗。

由HSV-2ΔgD-/+引发的保护的机制和相关物。生成无gD-2病毒，并且证明其在免疫功能健全和免疫受损的小鼠中高度减毒并且作为疫苗候选物测试时，诱导对抗HSV-2阴道内攻击的保护性免疫应答。用HSV-2ΔgD-/+皮下免疫将诱导对抗两种HSV血清型(HSV-2和HSV-1)阴道内攻击的保护作用所需要的体液免疫应答和细胞免疫应答。

HSV-2ΔgD-/+启动顿挫感染：构建U_s6缺失的HSV-2毒株，以评估其对细胞感染期间发生的早期信号传导事件的贡献[41]。除非在其内源启动子(例如，在一个实施方式中，gD-1启动子)控制下在编码U_s6的gD互补细胞系(例如，编码D-1的VD60细胞[40，41])上培育，否则这种病毒不能够感染宿主细胞。实际上，从非互补细胞分离的HSV-2ΔgD颗粒不感染上皮细胞(图1)或神经元细胞(SK-N-SH，未显示)。然而，如果在VD60细胞中增殖，则获得表型互补的病毒(AgD-/+)，其完全能够感染作为野生型HSV-2共同靶标的细胞。然而，用AgD-/+感染后，从这些细胞中不产生感染性粒子或病毒空斑(pfu)并且病毒没有从感染细胞扩散至未感染的细胞，这反映这些过程中需要gD；因此其是顿挫性感染。

HSV-2ΔgD-/+在鼠感染模型中是安全的：在野生型小鼠和重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中通过皮下或阴道内接种高剂量评估AgD-/+的体内安全性。在整个实验期间，用10⁷pfu的ΔgD-/+(在互补细胞上滴定)阴道内接种的小鼠未表现出病毒所致病变的任何迹象，而用低1000倍的野生型病毒(10⁴pfu)接种的动物死于HSV-2疾病并且在接种后第8天开始死亡(图2A)。在整个实验期间，用10⁷pfu的AgD-/+阴道内接种的小鼠未表现出病毒诱导的上皮或神经系统疾病的任何迹象(图2B和图2C)。通过空斑测定或DRG与Vero细胞(未显示)的共培养确定，从生殖道组织或DRG未回收感染性病毒。

SV-2ΔgD-/+引发针对HSV-2的全身性抗体和粘膜抗体：用ΔgD-/+皮下接种和加强免疫(皮下-皮下)或用这种候选疫苗株(10⁶pfu/小鼠)皮下接种并且阴道内加强免疫(皮下-阴道内)的小鼠引发了针对HSV-2的体液免疫应答，如血清和阴道洗液中的抗HSV-2抗体增加证明的(图3A和3B)。用未感染的VD60细胞裂解物(称为对照)免疫对照动物。使用感染的细胞裂解物作为抗原(对未感染的细胞裂解物的应答作为背景扣除)，通过ELISA测量抗体。值得注意地，抗体应答的量级随免疫途径而不同。实际上，皮下-皮下免疫引发了比皮下-阴道内免疫显著更多的针对HSV-2的血清抗体和阴道洗液抗体。这项研究结果表明，阴道洗液抗体或许代表了来自血液的IgG渗出液并且表明皮下-皮下是激发针对HSV-2的高水平全身和局部IgG抗体的更适宜途径。另外，用ΔgD-/+(10⁶pfu/小鼠)皮下接种和加强免疫(皮下-皮下)的小鼠激发了中和性抗HSV-2，如用病毒和来自这些小鼠的血清在Vero细胞单层上的体外中和作用所证明的(图3C)。

HSV-2ΔgD-/+引发HSV-2-特异性T细胞活化：在接种之前，将gB498-505特异性转基因CD8+T细胞(gBT-1)转移至C57BL/6小鼠中。免疫接种的小鼠用10⁶pfu的ΔgD-/+或用VD60细胞裂解物(对照)接种。将脾在加强免疫后第14天收获并且使用计数珠(CountBright^TM，Life technologies)，通过流式细胞术定量(图4A)。在同一天，将脾对记忆细胞表面标志物进行染色并且通过流式细胞术进行分析(图4B)。最后，将同一天收获的脾细胞用激动剂gB498-505-肽在体外再刺激6小时并且进行胞内细胞因子染色法以测量这些细胞的IFN-γ产生。与对照小鼠相比，用ΔgD-/+免疫增加了接种小鼠中的IFN-γ产生(图4C)。对照小鼠中的应答假定反映了转移后幼稚小鼠中gBT-1T细胞的持久性。通过使用gB498-505-肽在体外再刺激(未显示)的脾细胞的上清液的多重细胞因子分析，获得了类似结果。这些结果显示，疫苗诱导了T细胞反应。

用HSV-2ΔgD-/+免疫的小鼠受到保护对抗阴道内HSV-2致死性攻击：用HSV-2ΔgD-/+皮下-皮下或皮下-阴道内接种的动物在等同于LD₉₀(5x10⁴pfu/小鼠)的阴道内致死剂量攻击后出现体重减少并且幸免于攻击，而用VD60对照裂解物免疫的小鼠至第10天死于疾病(图5A和图5B)。该疫苗还提供对10倍LD₉₀(5xl0⁵ pfu/小鼠，数据未显示)的完全保护作用。这种保护作用与上皮疾病评分显著降低(图5C)和完全不存在病变迹象(图5D)相关。如前描述的进行评分[44]。另外，在阴道攻击后第2天，与对照小鼠相比，在AgD-/+-免疫小鼠的阴道洗液中回收到显著较少的病毒，这表明存在快速清除(图5E)。另外，在第4天阴道洗液中(图5E)或在攻击后第5天分离的阴道组织或DRG中(图5F)未回收到感染性病毒。后者表明疫苗阻止病毒在DRG中抵达和/或复制。

在强毒HSV-2攻击后，用HSV-2AgD-/+免疫防止了感染部位处的炎症：与用VD60裂解物(对照)接种的动物相比，用HSV-2ΔgD-/+接种和用强毒HSV-2阴道内攻击的小鼠在感染部位显示显著较少的炎性细胞因子。实际上，接种的小鼠在感染后第2天和第7天在阴道洗液中分泌比对照小鼠显著更少的TNF-α(图6A)、IL-6(图6B)和IL-1β(图6C)。值得注意地，增加的炎性细胞因子水平与HSV-2和HIV共感染时生殖器处增加的HIV复制和脱落(shedding)相关[45，46]。在体外也观察到类似的现象[47]。

用HSV-2ΔgD-/+免疫将T细胞招募至感染部位和相关的淋巴结(LN)。用强毒HSV-2攻击后，用ΔgD-/+皮下-皮下免疫的小鼠显示骶淋巴结(LN)中活化的抗HSV-2gBT-I CD8+T细胞(图7A)和CD4+T细胞(图7B)的百分数增加。用强毒HSV-2攻击后，用ΔgD-/+按皮下-阴道内方式免疫的小鼠显示阴道中抗HSV-2gBT-I CD8+T细胞(图7C)和CD4+T细胞(图7D)的数目增加，表明用ΔgD-/+接种将抗HSV-2CD8+T细胞和活化的CD4+T细胞(可能抗HSV-2)招募至感染部位和相关淋巴结。

在其他实验中，发现用HSV-2-ΔgD^-/+gD-1免疫在C57BL/6和Balb/C中赋予对抗强毒HSV-2阴道攻击的保护作用。此外，HSV-2阴道内攻击的ΔgD^-/+gD-1免疫小鼠在攻击后5天在阴道或神经组织中没有可检出的HSV-2。不同于HSV-2病态结合的小鼠，发现HSV-2ΔgD-/+gD-1皮下-皮下抗体识别多种HSV-2蛋白(gD和gB两者)。来自接种动物的血清抗体显示了对HSV-1和HSV-2的体外中和作用。另外，来自ΔgD-/+gD-l接种小鼠的血清在体外引发了HSV-2感染细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

总之，在野生型(wt)小鼠和SCID小鼠中，HSV-2ΔgD-/+gD-l是减毒的并且是完全安全的。重组HSV-2ΔgD-/+gD-l保护免受致死性HSV-2阴道内感染和HSV-2/HSV-1皮肤感染。在两种不同的小鼠品系中观察到保护。没有可检测的感染和消除性免疫。还观察到HSV-2特异性CD8+T细胞和全身性和粘膜HSV抗体的诱导。IgG2a和IgG2b是主要的抗HSV同种型。还观察到FcyRIII/II依赖的ADCC。出乎意料地，免疫血清的被动转移保护了幼鼠，且FcRn和FcyR敲除小鼠不受免疫血清保护。

讨论

世界卫生组织估计，全球超过5亿人感染单纯疱疹病毒类2型(HSV-2)，每年约两千万个新病例[1]。感染风险随年龄而增加，并且因为病毒在频繁的亚临床或临床再激活情况下建立潜伏期，所以感染的影响是终生的。令人警觉地，HSV-2显著地增加获得和传播HIV的风险[2-4]。ASV-2的流行率在全球各地区间不定，从日本的8.4％波动直至撒哈拉以南非洲地区的70％(其中HIV流行率呈流行的地区)[5，6]。在美国，HSV-2流行率是约16％并且HSV-1的流行率已经下降到约54％。美国(和其他欧洲国家)的HSV-1流行率日益降低与生殖器型HSV-1的增加相关，这由最近令人失望的糖蛋白D(gD)亚单位疫苗试验的结果所证明，在描述的试验中大部分生殖器疱疹疾病病例由HSV-1引起[7-9]。尽管与HSV-2相比，HSV-1与复发较少和生殖道病毒散播较少相关，但是两种血清型在围产期传播并且引起新生儿疾病；新生儿疾病与高发病率和死亡率相关，甚至采用阿昔洛韦治疗也是如此[10-12]。与生殖器疱疹相关的发病率、其与HIV流行的协同作用及其直接的医疗费用(单在美国就超过五亿美元)凸显开发安全和有效疫苗的必要性[13]。

由结合佐剂的病毒包膜糖蛋白组成的亚单位制剂已经统治HSV-2疫苗领域几乎20年并且大部分临床试验以这种策略为核心[8，14-19]。尽管亚单位制品安全并且引发中和抗体，但是这些制剂在临床试验中提供较低的抗HSV-2感染或疾病功效[8，14]。出乎意料地，HSV-2gD亚单位疫苗提供针对生殖器型HSV-1的保护，但是不提供针对HSV-2的保护[8，20]。后续研究发现，血清HSV-2gD抗体水平与针对HSV-1的保护相关，从而显示HSV-2保护所需的抗体滴度可能高于抗HSV-1保护所需的抗体滴度[21]。相反，细胞介导的免疫力(响应于重叠性gD肽的胞内细胞因子应答)与对任一种血清型的保护不相关[21]。该疫苗激发CD4⁺T细胞应答，但不激发CD8⁺T细胞应答，然而在接种的感染女性和未感染女性之间不存在CD4⁺T细胞应答的差异[21]。未测量生殖道或其他粘膜抗体应答。其中从基因组缺失gH的HSV-2候选疫苗在血清阳性受试者内实施的临床试验中没有降低病毒复发的频率，不过未评价疫苗对抗首发感染的功效[29]。

临床研究显示，尽管诱导中和血清抗体，HIV感染患者中的HSV-2再活化的速率增加与gD亚单位疫苗不能引发任何CD8⁺T细胞应答结合表明有效的疫苗也必须引发保护性T细胞应答[28，30-32]。研究显示HSV-1反应性T细胞在人三叉神经节中的选择性保留进一步强调了T细胞的重要性。CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞被周围神经元识别，并且虽然靶向的病毒蛋白存在异质性，但在多种HLA-A和HLA-B等位基因背景下，多个三叉神经节T细胞识别出被膜蛋白、病毒颗粒子蛋白16(VP16)；这些发现表明被膜蛋白可能是重要的免疫原[33]。类似地，还在潜在感染HSV-2的人的研究中确定了针对被膜蛋白的细胞毒性T细胞[34]。在HSV再活化后，CD8⁺T细胞(包括CD8αα⁺T细胞)在生殖器皮肤和粘膜中在真皮-表皮连接处持续存在，表明它们在免疫控制中发挥作用[35]。

本文公开了一种以遗传方式缺失天然HSV-2gD的工程化HSV-2病毒。HSV-2gD基因编码病毒进入和细胞-细胞扩散必需的包膜糖蛋白。糖蛋白D还与肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)(免疫调节开关，也称作疱疹病毒进入介体(HVEM))结合。因为HVEM携带针对多于一种配体的对接位点并且信号转导依据这些分子与HVEM顺式或反式结合而不同，gD可以对免疫细胞具有调节作用[36，37]。实际上，最近的研究表明gD与天然配体竞争该受体并调节对病毒的细胞因子应答[38，39]。将gD基因替换为编码绿色荧光蛋白(gfp)的DNA片段，并且针对用这种构建体转化的表达HSV-1gD(例如，gD-1启动子下的gD-1)的互补Vero细胞(VD60细胞[40])筛选形成绿色空斑的同源重组病毒。突变病毒在Vero细胞系中复制至高滴度(当在互补细胞上传代时，命名为HSV-2ΔgD^-/+)，但是在非互补细胞中是无感染性的(当从非互补细胞分离时，命名为HSV-2ΔgD^-/-)。将这种病毒进行纯化并且在体外进行表征[41]。与野生型亲本病毒引起的致死性感染相比，免疫功能健全小鼠或免疫受损(SCID)小鼠的阴道内或皮下接种显示无毒力。免疫(皮下初免随后皮下或阴道内单次加强免疫给予)产出对抗强毒性HSV-2阴道内攻击的100％保护作用。稳健的体液及细胞免疫力由HSV-2ΔgD^-/+激发，并且得出结论：U_s6(gD-2)是体内生产性感染所需要的。这种活的减毒株将提供对抗HSV的消除性免疫力。还可以使用被动式血清或血清产物转移。

实施例2

进一步证实了疫苗对临床HSV-1和HSV-2分离株的保护能力，如感染部位的局部免疫应答。典型地，HSV主要感染生殖器或口腔有核表皮细胞，这是由于人皮肤或粘膜皮肤层中的破裂(75)。为了更接近地模拟人HSV感染，皮肤划痕模型用于这些研究，其显示与人相似的病毒动力学和组织病理学(76)。

结果

用低剂量ΔgD-2的免疫针对致死性阴道内和皮肤攻击具有保护作用。用ΔgD-2的5x10⁶ PFU(在互补VD60细胞上测定的滴度)作为疫苗接种物进行先前研究。进行剂量递减研究以确定在较低接种剂量下的保护作用。将C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)皮下(sc)初免，并且在21天后用ΔgD-2的5x10⁶ PFU、5x10⁵ PFU或5x10⁴ PFU加强免疫。三周后，将小鼠阴道内或通过皮肤划痕用LD₉₀(5x10⁵ PFU)的HSV-2(4674)(先前描述的临床分离株)来攻击(77)。所有HSV-2ΔgD-2免疫的小鼠存活(每组5/5)，而所有对照接种的小鼠(用VD60细胞裂解物免疫)死于疾病(图8A，图8B)。虽然用最低剂量(5x10⁴)接种的小鼠显示出轻度上皮疾病，但是没有观察到神经疾病的迹象，并且所有动物在阴道内和皮肤攻击模型中到第14天完全恢复。加强免疫但未初免后一周，在所有接种疫苗的小鼠的血清中检测到HSV抗体(通过ELISA测量)，并且抗体滴度随给予更高疫苗剂量而增加(图8C)。

用ΔgD-2免疫的小鼠保护免受毒性HSV-1和HSV-2临床分离株的高病毒攻击。为了评估ΔgD-2疫苗是否预防不同的HSV-1和HSV-2菌株，从纽约州布朗克斯的蒙特菲奥雷临床病毒学实验室获得5株HSV-1(表示为B3x1.1-B3x1.5)和5株HSV-2(表示为B3x2.1-B3x2.5)临床分离株，以及一株南非HSV-2临床分离株(SD₉₀)。分离株在Vero细胞上生长，并且在测序和表型分型之前传代不超过三次。Illumina测序显示，菌株表现出丰富的遗传多样性，B3x1.5与其他B3x1菌株之间的两两距离高达6.3％，并且B3x2.2与其他B3x2菌株之间的两两距离为5.0％。通过使用皮肤划痕模型用1x10⁵ PFU的HSV-1株或5x10⁴ PFU的HSV-2株攻击Balb/C小鼠，将每种临床株的体内毒力与实验室株进行比较。临床分离株表现出一系列的毒力，B3x1.1、B3x1.3、B3x2.3和SD90在幼年小鼠中诱发了发病率最高的更快的疾病。在阴道内攻击模型中观察到类似的结果，其中相同的4个分离株展现出最具毒性的疾病(未显示)。感兴趣的是，通过在Vero细胞上的体外单步和多步生长曲线，没有观察到分离株之间的差异。

为了评估是否ΔgD-2对不同的分离物有保护作用，用5x10⁶ PFU/只小鼠ΔgD-2对C57BL/6或Balb/C小鼠初免并加强免疫(或VD60裂解物作为对照免疫原)，并且然后使用皮肤划痕模型用LD90剂量的4种更具毒性的临床分离物(表1)进行攻击。所有ΔgD-2接种的小鼠在攻击中存活(n＝7只C57BL/6小鼠/组；图3A，并且n＝5只Balb/C小鼠/组，图9B)。虽然一些小鼠表现出轻度上皮疾病，其在第4天达到峰值，但大多数动物在攻击后第8天完全恢复。在任何时间点在任何小鼠中没有检测到神经疾病的迹象。

表1：疫苗功效研究中使用的HSV株

注释：^*在Balb/C小鼠皮肤攻击模型中引起90％发病率的空斑形成单位

为了进一步评估免疫应答的稳健性，C57BL/6小鼠中的攻击剂量增加到10x和100x的LD₉₀剂量的SD90和10x的LD90剂量的B3x1.1。所有ΔgD-2接种的小鼠存活(图9D)，没有神经疾病的迹象。在攻击后第5天，ΔgD-2接种的小鼠的在皮肤活检中检测的病毒显著减少，其中大多数未检测到病毒空斑(图10A，n＝3只小鼠/组)。与病毒的快速清除一致，皮肤活检的组织病理学揭示，与ΔgD-2接种的小鼠和模拟(未接种的，未感染的)处理的小鼠两者中的＜10％上皮坏死和溃疡相比，在对照接种的小鼠中覆盖75％-95％的上皮的溃疡和坏死。此外，在ΔgD-2接种的小鼠(n＝5只小鼠/每个攻击剂量和株)中，在攻击后第14天分离的DRG中分别没有通过空斑测定(图10B)或qPCR(图10C)检测到的复制病毒或潜伏病毒。类似地，当将来自接种ΔgD-2的小鼠(用SD90的LD₉₀攻击后第5天分离)的DRG与Vero细胞共培养3周时，未检测到再活化病毒。相比之下，从所有对照(VD60细胞裂解物)接种的小鼠(在安乐死时分离的DRG)中回收病毒DNA和可再活化病毒(图10D，n＝5只小鼠/组)。

HSV-2ΔgD-2在攻击之后将HSV-2特异性IgG2抗体和免疫细胞招募到皮肤中：为了表征在皮肤中对疫苗和病毒攻击的免疫应答，在攻击后21天和攻击后2或5天获得活检，并且针对组织学进行处理和/或匀浆，并且然后使用HSV-2(4674)或HSV-1(17)感染的细胞裂解物作为抗原通过ELISA评估HSV特异性Ab的存在。ΔgD-2免疫的小鼠具有加强后皮肤中检测到的低水平的HSV特异性Ab，其早在攻击后第2天快速增加(图11A)。与SD90相比，B3x1.1引起更高滴度的Ab应答。如预期的，在攻击后第2天或第5天在对照接种疫苗的小鼠的皮肤中未检测到HSV特异性Ab(图11A和图11B)。从皮肤回收的Ab主要是IgG[1:24,000滴度，(图11B)]，没有可检测的抗HSV IgA或IgM(数据未示出)，并且富含IgG2(IgG2a和IgG2b的相等诱导)HSV特异性抗体(所有HSV IgG的约80％)(图11C)。

鼠IgG2抗体结合FcγR(78)。由ΔgD-2疫苗介导的ADCC引发的Ab和研究通过测量针对HSV包被的珠的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)进行扩展。与来自用细胞裂解物包被的对照免疫的小鼠或珠的血清相比，来自加强免疫后1周获得的ΔgD-2接种的小鼠的血清引起更高的HSV特异性吞噬作用并且诱导更大的IFN-γ分泌(图11D)。

在攻击后第5天获得的ΔgD-2免疫和对照疫苗接种小鼠或未免疫、未感染小鼠(模拟)的皮肤活检也通过免疫组织化学和/或用于免疫细胞应答的免疫荧光评估。与对照免疫的小鼠相比，ΔgD-2-免疫的小鼠具有CD3+T细胞(平均值±SD 8.0％±2.1与2.5％±0.7，p＜0.001；图12A，12D)和B220+B细胞(3.8％±1.1与2.4％±1.1，p＝0.09；图12B，12E)的显著增加。通过染色CD4或CD8来进一步表征T细胞；与对照免疫的小鼠相比，ΔgD-2中的CD4+群体显著增加，但非CD8+群体没有显著增加(p＜0.05)(图12F和12G)。相反，与对照免疫的小鼠相比，ΔgD-2中的Iba1+单核细胞/巨噬细胞(图12C和12H)和Ly6G+嗜中性细胞(图13)减少。

与炎性细胞的减少和病毒的快速清除一致，与攻击后第5天与对照免疫的小鼠相比，在ΔgD-2中的皮肤匀浆中检测到的炎性细胞因子/趋化因子的减少(图14)。SV-1和HSV-2感染的小鼠在第2天的TNFα(图14A)、IL-1β(图14B)和IL-6(图14C)水平高于非免疫的模拟感染小鼠。然而，在ΔgD-2中到第5天的水平降低，但在对照免疫的小鼠中没有降低。对于趋化因子CXCL9(图14D)和CXCL10(图14E)获得了相似的结果。有趣的是，IL-33的水平始终高于正常人ΔgD-2免疫小鼠与对照免疫小鼠在两个时间点进行比较(图14F)。

讨论

本研究进一步证实，用HSV-2ΔgD-2进行疫苗接种提供了针对一组遗传多样性HSV-1和HSV-2临床分离株的完全保护并且防止潜伏期的建立。在反映人类原发性疾病的优化皮肤模型中确认疫苗功效。ΔgD-2引起快速招募到皮肤中的高滴度抗体，导致甚至在用100倍最强毒力株SD90的LD₉₀攻击后第5天清除病毒。保护作用ΔgD-2对广泛的HSV-1和HSV-2临床分离株的作用使其区别于其他候选疫苗(如HSV-2ΔUL5/ΔUL29，未能完全保护免受临床分离株SD90)或gD亚单位疫苗以及其他只针对一种或两种实验室病毒株进行过测试的疫苗。

由ΔgD-2提供的广泛保护可能反映了引发的免疫应答的独特性质。诱导的Ab富含IgG2亚型(所有HSV特异性IgG的约80％)具有低水平中和活性(未示出)，在攻击后第2天在皮肤活检中以达到1:24,000的滴度快速招募到皮肤中，并且介导Fc效应子功能(78)，包括ADCP(在此示出)和ADCC。对ΔgD-2的抗体应答是剂量依赖性的，与病毒清除的速度相关(如通过疾病评分证明的)并且可能促成疫苗完全预防潜伏建立的能力。尽管用较低剂量ΔgD-2免疫引发血清中HSV特异性抗体的较低滴度，但保护所有小鼠免于致死攻击。这些发现表明较低水平的抗体可能足以用于FcγR-效应子功能。一种不同的HSV-2病毒株gD的连接素-1结合域发生改变(gD27)，与重组佐剂gD相比，其血清中和Ab的滴度也较低，但相反，其对小鼠阴道内攻击的保护作用大于重组gD蛋白(59)。没有评估其他抗体功能，如ADCC或ADCP。然而，这些发现进一步支持以下观点：中和Ab滴度在小鼠、棉鼠(80)或人类中不是保护的预测相关物。

虽然在对照组和接种组中均观察到以细胞因子和趋化因子增加为特征的快速炎症反应ΔgD-2免疫小鼠后第2天后攻击，但是在第5天在接种疫苗的小鼠中炎症应答消退，这与病毒的快速清除一致。相反，对照组接种疫苗的小鼠炎症持续存在，与疾病进展相一致。后者的特征是持续升高的细胞因子/趋化因子(IL-1β、IL-6、CXCL9和CXCL10)和持续存在的单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞，在对照接种小鼠的整个上皮和真皮层内观察到这些细胞因子/趋化因子。相比之下，在接种ΔgD-2的小鼠的皮肤中在第5天观察到更高百分比的CD4+T细胞和B220+B细胞，可能反映了细胞记忆应答。

感兴趣的是，与对照组比较，IL-33是来自ΔgD-2免疫的小鼠在皮肤中呈上升趋势的唯一细胞因子。IL-33的确切作用是未知的。先前的研究表明，rIL-33给予促进中小鼠皮肤伤口愈合，并且与先天淋巴细胞的活化和单核细胞向2型巨噬细胞的分化有关(81,82)。小鼠全身给予IL-33与FcgR2b的增加有关，这可能与炎症的减轻有关(88).，在小鼠皮肤中观察到IL-33的增加ΔgD-2免疫小鼠促进伤口愈合和炎症消退。

临床分离株在鼠皮肤(和阴道)模型中表现出不同的毒力，尽管体外生长动力学相似(76,84)。然而，感兴趣的是，尽管在HSV-1分离株中发现的遗传多样性水平与先前研究中描述的相似，但在Bronx中收集的HSV-2分离株中发现的遗传多样性显著高于先前报道中描述。这里观察到的更大差异可能反映了Bronx社区的不同地理起源。尽管存在这种异源性，所有测试的分离株都受到ΔgD-2疫苗的完全保护，这可能反映了多抗原应答。此外，观察到与临床相关的抗HSV-1和HSV-2的完全保护作用，因为HSV-1已成为发达国家生殖器疾病的更常见原因。这里观察到的普遍保护与“杀菌免疫”相结合不存在潜伏病毒证明了这种ΔgD-2疫苗的有效性。

材料和方法

细胞和病毒：Vero(非洲绿猴肾细胞系；CCL-81；美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA，USA)细胞、VD60细胞[在内源启动子下编码gD-1的Vero细胞(85)]、和CaSki(人宫颈上皮细胞系；CRL-1550；ATCC)在补充有10％胎牛血清的DMEM(FBS，Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)中传代。THP-1(人单核细胞系；TIB-202；ATCC)细胞在补充有10％FBS的RPMI-1640(Life Technologies)中传代并且根据ATCC指南传代培养。先前已经描述了HSV-2(G)ΔgD-2的构建及其在VD60细胞上的增殖(95,94)。比较5种不同的病毒制剂，没有观察到疫苗功效的变异性。HSV-2(4674)在CaSki细胞上增殖。在Vero细胞上增殖实验室菌株HSV-2(G)(87)、HSV-2(333-ZAG)(86)、HSV-1(17)(89)、和HSV-1(F)(87)。南非分离株HSV-2(SD90)由David Knipe提供并且在Vero细胞上增殖。由Montefiore的临床病毒学实验室提供了五种HSV-1(B3x1.1至B3x1.5)和五种HSV-2(B3x2.1至B3x2.5)去鉴定的临床分离株，并且在Vero细胞上传代三次用于低传代工作原种。

体外生长曲线：如先前描述进行单步和多步生长曲线(86)。对于每种病毒的单步生长，Vero细胞以5PFU/细胞的感染复数(moi)感染病毒，并且在感染后，注射后(pi)每4、8、16和24小时(h)收获上清液和细胞，并且储存在-80℃。对于每种病毒的多步生长，以0.01PFU/细胞的moi感染Vero细胞，并且注射每12h收获上清液和细胞直到72小时。通过用上清液和溶解的细胞进行空斑测定来测量感染性病毒。

临床分离株的病毒DNA分离和测序：HSV DNA通过在T150烧瓶中感染汇合的Vero细胞制备，每个B3x临床分离株的MOI为10。收获细胞16hpi，并且用PBS洗涤两次。按照制造商的建议，使用血液和组织(Qiagen)提取DNA。通过Qubit dsDNA hs测定(LifeTechnologies)对DNA进行定量。按照制造商的说明书，通过Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备配对末端文库。在Illumina MiSeq桌面测序仪上对文库进行测序。在通过与猕猴基因组比对去除宿主序列之后，用VirAmp管道(89)装配病毒基因组序列作为不完整的绿藻(Chlorocebus sabaeus)(Vero细胞来源)基因组的替代物。在提交至GenBank之前，通过与HSV-1(96)(GenBank登录号)和HSV-2(HG52)(JN561323)比较，在ViPR上用基因组注释转移效用(Genome Annotation Transfer Ultility)对HSV-1和HSV-2基因组进行注释。包括先前测序的HSV-2(SD90e)(KF781518)、HSV-2(333)(KP192856)、ChHV 105640(NC_023677.1)和HSV-1(F)(GU734771.1)在内的全基因组比对使用ClustalW(90)，并且在MEGA6(91)中进行1000次引导复制(bootstrap replicate)使用UPGMA方法构建系统发育树。消除包含空位或缺失数据的所有位置。基因组序列的GenBank号如下：HSV-2(G)(KU310668)、HSV-2(4674)(KU310667)、B3x1.1(KU310657)、B3x1.2(KU310658)、B3x1.3(KU310659)、B3x1.4(KU310660)、B3x1.5(KU310661)、B3x2.1(KU310662)、B3x2.2(KU310663)、B3x2.3(KU310664)、B3x2.4(KU310665)、B3x2.5(KU310666)。

鼠免疫和病毒攻击研究：实验由阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会协议#20130913和#20150805批准进行。雌性C57BL/6和BALB/c小鼠在4-6周龄时从Jackson实验室(JAX，barharbor，ME)购买。将小鼠初免并且在3周后用100μl/小鼠皮下(sc，后肢内侧和骨盆)用5x10⁴-5x10⁶ PFU的ΔgD-2或等量的VD60细胞裂解物(对照)加强。通过空斑测定在补充细胞(VD60)上测定滴度。

对于阴道内HSV感染，在攻击前5天用2.5mg醋酸甲羟孕酮(MPA；SicorPharmaceuticals，Irvine，CA)治疗小鼠。然后将小鼠用LD90(5x10⁵pfu/小鼠)的HSV-2(4674)以30μl/小鼠阴道内接种，并且如前描述(21)的针对疾病进行评分并且监测存活持续14天。对于HSV皮肤感染，用Nair在小鼠右侧脱毛，并且让其休息24小时。用异氟烷(Isothesia，Henry-Schein)麻醉脱毛的小鼠，然后用一次性记忆板在暴露的皮肤上擦伤20至25次，并且随后用1x10⁵ PFU HSV-1或5x10⁴ PFU HSV-2株攻击用于体内毒力研究，或用LD₉₀、10xLD₉₀，或100xLD₉₀选择单纯疱疹病毒株(见表1)用于疫苗功效研究。监测小鼠14天并且如下评分：1：原发性损伤或红斑，2：远部位带状疱疹损伤，轻度水肿/红斑，3：严重溃疡和水肿，表皮扩散增加，4：后睑下垂/麻痹，以及5：死亡。对评分为4的小鼠实施安乐死后，在随后的所有日期将其赋值为5，以进行统计分析。

HSV RT-qPCR：按照制造商的推荐，使用血液和组织(Qiagen)从称重的组织样品中提取DNA。然后将提取的DNA标准化为每个反应10ng的DNA，并且使用AbsoluteqPCR-ROX Mix(Thermo Scientific)使用实时定量PCR(RT-qPCR，qPCR)对病毒DNA进行定量。HSV聚合酶(UL30)引物购自Integrated DNA Technologies(Cat#：1179200494)，并且用于检测病毒基因组DNA。使用数字PCR(dPCR，ThermoFisherScientific)校准分离的HSV-2病毒DNA的绝对拷贝量，随后用作确定HSV病毒基因组拷贝的标准曲线。读取4个或更少拷贝数的样品被认为是阴性的。数据呈现为log10 HSV基因组/克DRG(背根神经节)组织。

检测皮肤活检中的抗体和细胞因子：从HSV-2ΔgD-2或VD60裂解物(对照)免疫的小鼠(通过机械切除直径约5-10mm)加强免疫后第21天或病毒皮肤攻击后第2天和第5天获得皮肤活检。在FastPrep-24^TM5G(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)中，用6.0m/sec的无血清DMEM在RNase/DNase游离裂解基质A管中称重并且均质化组织，进行30秒循环。将样品在4℃下以5000rpm旋转10分钟，并且评估所得上清液的抗HSV抗体、细胞因子和趋化因子。如先前描述的，使用未感染的HSV-1(96)、或HSV-2(4674)-感染的Vero细胞裂解物作为包被抗原，通过ELISA检测抗HSV抗体(94)。使用1μg/ml的生物素抗小鼠Igκ或生物素抗小鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、或IgG3(Becton Dickenson，San Diego)作为第二检测抗体。在SpectraMax(M5系列)ELISA酶标仪上以450nm的吸光度读取孔。通过将未感染的细胞裂解物获得的值减去用感染的细胞裂解物获得的值来确定所得吸光度。将总抗HSV Ig报告为在组织匀浆的1:1000稀释度下相对于相对组织重量标准化的450nm下的光密度(OD)。抗HSVIgG、IgA、IgM、或IgG1-3报道为在所有稀释度下在450nm下的光密度(OD)，除了IgG1-3仅在皮肤匀浆的1:100稀释度下报道。

对白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β(IL-1β)测定皮肤匀浆上清液，使用Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子免疫测定(Millipore，Danvers，MA)和Luminex Magpix系统并且使用Milliplex Analyst(版本3.5.5.0；VigeneTech Inc.)分析IL-33、肿瘤坏死因子α(TNFα)、由干扰素-γ诱导的单因子(MIG，CXCL9)、干扰素可诱导的细胞因子(IP-10，CXCL10)。

皮肤组织的组织病理学、免疫组织化学和免疫荧光：在攻击后第5天使小鼠安乐死，并且切除病毒(或模拟)感染位点处的皮肤，并且在室温下福尔马林固定48小时。常规地处理样品以石蜡包埋并且切片。用于组织病理学的载玻片用苏木精和伊红(H&E)染色。样本由委员会认证的兽医病理学家进行组织学评估，该病理学家不知道样本的身份。对于免疫组织化学(IHC)，将样品切片至5μm，在二甲苯随后分级醇中脱蜡。抗原修复在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中进行，加热至96℃，持续30分钟。使用在水中的3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。通过常规IHC方法，使用SuperPicTure^TM(ThermoFisher Scientific，目录号87-9673)针对抗CD3(即用型，ThermoFisher Scientific、目录号RM-9107-R7)、抗B220(BD Biosciences、目录号550286)或抗Iba1(1:3000Wako Pure Chemical Industries，Richmond，VA)的兔第一抗体对这些切片进行染色，并且然后用作为最终色原的二氨基联苯胺进行染色。用苏木精轻微复染所有免疫染色的切片。用Zeiss Axio Observer倒置光学显微镜在每个样品的3个不同位置处从顶层(表皮)到基底层(横纹肌)以20x放大倍数对染色横截面进行显微照片。如Bologna-Molina et al.,2011(92)描述，对染色阳性细胞进行计数。数据表示为每个样品三个显微照片切片的阳性细胞百分比＝(阳性有核细胞/总有核细胞)的平均值。

对于免疫荧光研究，在HSV或模拟皮肤攻击后5天切除皮肤组织，然后在OCT介质中冷冻。将样品切成5μm切片并且储存在-80℃下。然后将冷冻的载玻片固定在-20℃丙酮中15分钟，用洗涤缓冲液(WB，在PBS中的0.05％吐温20)洗涤，然后在室温下用封闭缓冲液(2％BSA，在PBS中的5％热灭活的山羊血清)封闭2小时。将载玻片洗涤两次，并且在室温下与阻断缓冲液中的抗CD4(GK1.5，1:200)、抗CD8(YTS169.4，1:250)、抗Ly6G(1A8，1:500)温育1小时。将载玻片彻底清洗，并且用山羊抗大鼠第二抗体与Alexa flour 555或Alexa flour488(分别为1:500或1:200)结合在室温下温育30分钟。将载玻片洗涤并且用含有DAPI(具有DAPI的Diamond Antifade Mountant，ThermoFisher Scientific)的培养基固定。使用Nikon Eclipse Ti-U倒置光学显微镜在20x放大倍数下从顶层(表皮)到基底层(横纹肌)在每个样品的两个不同位置处对载玻片进行成像。对于％CD4+和％CD8+定量，通过Velocity(6.3版，Perkin Elmer)的软件算法，通过DAPI阳性对象≥5μm计算总有核细胞。对CD4或CD8阳性细胞的荧光和DAPI+细胞核的掺入进行人工计数，以排除皮肤切片中的毛囊和细胞碎片的非特异性染色。数据表示为每个样品两张图像的阳性细胞百分比＝(阳性细胞/总DAPI细胞)的平均值。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定。为了确定HSV特异性的ADCP，使用了从Ackerman et al.，2011年修改的协议。简而言之，将2x1081μm Neutravadin-red荧光珠(Invitrogen，F-8775)用0.3mg的生物素化的HSV-2感染或未感染(对照)Vero细胞在500μlBlockAid^TM(ThermoFisher Scientific，B-10710)中在4℃下过夜包被。将珠用在PBS中的1％BSA洗涤两次，并且然后将1x10⁶个珠/孔添加到96圆底板中。在加强后1周将来自免疫小鼠的血清在56℃热灭活30分钟，并且在无血清RPMI中以1:5稀释。将50μl稀释的血清添加到含有HSV裂解物或对照细胞裂解物包被的珠的孔中，并且在37℃下温育2小时。将2x10⁴个细胞/孔的THP-1细胞加入到每个细胞中，最终体积为200μl/孔，并在37℃和5％CO₂下温育8小时。随后，移出100μl上清液并且储存在-20℃下，然后用100μl4％多聚甲醛重悬。然后在Einstein流式细胞仪核心设施的5激光LSRII流式细胞仪(Becton Dickenson，San Diego)上读取样品。通过门控代表THP-1细胞的事件，然后使用FlowJo软件(版本10，Tree StarInc.)应用以下方程式：[(％细胞珠阳性x对珠呈阳性的细胞的MFI)/10⁶]来报告吞噬评分。使用Milliplex人定制免疫测定(Millipore，Danvers，MA)和如先前描述的Luminex Magpix系统，通过分析储存的培养的上清液，确定经由抗体吞噬作用从活化的THP-1细胞分泌IFN-γ。

组织中的病毒检测。如上描述称量皮肤和背根神经节(DRG)并且使其均质化。然后将均质化的组织的上清液覆盖在汇合的Vero细胞单层(在48孔板中2×10⁵个细胞/孔)上持续1h。将孔用PBS洗涤，并且然后用含有1％热灭活的FBS的199培养基洗涤，用0.5％甲基纤维素覆盖，并且在37℃下温育48h。将细胞用2％多聚甲醛固定，用结晶紫溶液染色，并且定量PFU的数目。如先前描述进行神经元离体共培养测定(94)。

统计分析。使用GraphPad Prism版本6(San Diego，CA)通过双向方差分析(双向ANOVA)与多重比较或未配对学生的t检验来比较结果。通过对数秩检验比较Mantel-Cox存活曲线。P值＜0.05(^*)、＜0.01(^**)、＜0.001(^***)被认为是显著的。

实施例3

全世界新生儿HSV感染是每年约14,000例。原发性母体生殖器HSV占新生儿病例的50％-80％。即使采用有效治疗，围产期传播也会导致严重的死亡率和发病率。显然，预先存在的母体抗体可以明显地提供一些保护，因为随着复发性母体HSV疾病，围产期HSV传递的风险降低至1％-3％。然而，对于两种HSV1/2血清阴性的怀孕妇女的数量增加。

小鼠和伦理声明：小鼠研究得到了阿尔伯特爱因斯坦医学院动物护理和使用机构委员会协议#2016-1205的批准。C57BL/6小鼠购自杰克逊实验室(JAX，Bar Harbor，ME)。

细胞和病毒：将Vero(非洲绿猴肾细胞系；CCL-82；ATCC)、HaCAT(人角化细胞，ATTCCLS 300493)和VD60细胞(在其内源启动子下编码gD-1的Vero细胞)在补充有10％胎牛血清(FBS，Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen)的DMEM中进行传代。临床分离株HSV-2(4674)和HSV-1(B3x1.1)以及实验室株HSV-2(333)ZAG在Vero细胞上增殖，该实验室株在病毒内的基因间位点处插入的CMV启动子的控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)。在互补的表达gD-1的VD60细胞上增殖HSV-2(G)ΔgD-2，并且通过空斑测定同时在VD60和Vero细胞上测定病毒滴度；在非互补Vero对照细胞上未检测到空斑。

免疫和病毒攻击研究：用5x10⁶ pfu的ΔgD-2(在VD60细胞上生长)未感染的对照VD60细胞裂解物、或与150μg铝(明矾)(Imject Alum；Pierce Biotechnology，Rockland，IL)和12.5μg单磷酰脂质A(MPL)(Invivogen，San Diego，CA))(rgD-2/明矾-MPL)组合的5μg重组gD-2蛋白接种雌性小鼠。在100μl/小鼠的最终体积中，在4周龄(初免)和7周(加强免疫)皮下给予疫苗。加强免疫后一周，将免疫的雌性与雄性(2:1)一起圈养并且监测阴道塞。随后取出雄性小鼠，每天监测妊娠雌性直至递送。幼鼠在生命的第1、7或14天鼻内接种，通过微量移液管将5μl病毒注射到两个鼻孔，以导致未接种疫苗的7天龄新生小鼠(通常为10⁵pfu/小鼠HSV-1(B3x1.1)或10³-10⁴pfu/小鼠HSV-2(4674))产生90％致死性(LD90)。每天监测幼鼠的疾病迹象，如果它们出现脑炎的迹象(例如，瘫痪、震颤、不稳定、驼背姿势)，立即将其安乐死。

通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测HSV DNA：在安乐死时(当小鼠死于疾病时或攻击后第14天)，收集三叉神经节，使用DNeasy血液和组织(Qiagen)提取DNA，并且用靶向HSV聚合酶(UL30)的引物通过实时qPCR(Absolute qPCR ROX Mix(Thermo Scientific))检测每个样本10ng DNA中HSV的存在(正向引物序列，5’-GGCCAGGCGCTTGTTGGTGTA-3’(SEQ IDNO：3)；反向引物序列，5’-ATCACCGACCCGGAGAGGGA-3’(SEQ ID NO：4)；探针序列，5’-CCGCCGAACTGAGCAGACACCCGC-3’(SEQ ID NO：5))(整合DNA技术)。将小鼠β-肌动蛋白用作上样对照(Applied Biosystems，Foster City，CA)并且在Applied Biosystems QuantStudio7Flex中运行qPCR。具有少于四个拷贝的样品被认为是阴性的。

抗体应答、中和滴度以及FcγR活化的定量：通过先前描述的在血清中或在母乳中的酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定HSV特异性总IgG或同种型特异性IgG。在分娩后第8-12天，通过将它们与其后代分开至少2小时并且在挤奶前5分钟通过腹腔给予单剂量2IU/kg催产素从妊娠雌性小鼠收集母乳。人工挤出乳滴，然后移液到无菌Eppendorf管中，并且在-20℃下冷冻直至使用。简而言之，用感染复数(MOI)为0.1pfu/细胞的HSV-1(B3x1.1)或HSV-2(4674)感染后24小时收获的Vero细胞裂解物或未感染的对照裂解物包被ELISA板。将连续稀释的血清与包被的板在4℃下温育过夜，并且使用特定的生物素标记的二级抗体(BDBiosciences，San Jose，CA)对结合的IgG、IgG1、IgG2或IgG3进行定量。在减去未感染的细胞裂解物获得的光密度测定法(OD)值之后测定抗-HSV IgG水平。将中和滴度定义为相对于不存在免疫血清的情况下形成的空斑(约100个空斑/孔)，导致空斑数量减少50％的最高热灭活血清稀释度。使用mFcγIV ADCC报告基因生物测定(Promega，Madison，WI)，用HSV-2(4674)或HSV-1(B3x1.1)感染的Vero细胞作为靶标来确定FcγRIV激活。

抗体依赖性细胞介导杀伤(ADCK)测定：效应子免疫细胞是从脾和肝分离的并且从5-10只初次接受试验的新生儿或3-5只初次接受试验的成年小鼠中汇合。通过用氯化铵-钾(ACK)裂解缓冲液(Gibco，Grand Island，NY)裂解去除红细胞。对汇合的细胞进行计数并且重悬于完全RPMI培养基中。靶细胞是在37℃下用1pfu/细胞的HSV-2(333)ZAG的MOI或作为对照的未感染的HaCaT细胞感染4h的HaCaT细胞。靶标用CellStripper(Corning)解离，以10⁷细胞/ml的浓度重新悬浮在DMEM中，并且将2x10⁵个细胞(100μl)添加到96孔U底板的每个孔中。在室温下，用分离自ΔgD-2或VD60对照接种的成年小鼠的合并的热灭活的血清(在DMEM中1:5稀释)温育靶标15分钟。然后以10:1的效应细胞与靶细胞比率添加合并的效应细胞1小时。培养物用活/死红可固定染料(Invitrogen)染色30分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％多聚甲醛固定，并且重新悬浮在FAC缓冲液(PBS中的2％热灭活FBS)中。在LSRII(Becton Dickinson)上通过流式细胞术分析细胞，并使用FlowJo分析软件确定GFP阳性(HSV-2感染)死细胞的百分比。

FcγR表达：在FACS缓冲液中将针对ADCK测定从成人或新生儿小鼠的脾和肝分离的免疫细胞调节至1x10⁷个细胞/mL，并且将100μl的细胞悬浮液添加到96孔圆底微量滴定板中。将细胞在4℃下在黑暗中用CD11b-APC-Cy7、Ly6G-AlexaFluor700、Ly6C-PE、F4/80-APC、CD3-PE-Cy7、活/死红可固定染料(BD Biosciences，Invitrogen)以及相关的抗-mFcγ-FITC(I、II、III、IV；BioLegend)染色30分钟，并且然后用在PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟。为了分析，基于前向和侧向光散射区域(FSC-A，SSC-A)对宽度(FSC-W，SSC-W)排除双联体。细胞群体定义如下：巨噬细胞，CD11bintF4/80hi；嗜中性细胞，CD11bhiF4/80loLy6GhiLy6Cint；单核细胞，CD11bhiF4/80loLy6GintLy6Chi。在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences)上读取样品并且使用FlowJo分析软件分析数据。基于％FMO FITC阳性-％FITC阳性计算FcγR阳性细胞的百分比。

统计分析：使用GraphPad Prism版本7.0软件(GraphPad Software Inc.，SanDiego，CA)进行统计分析。p值小于或等于0.05被认为是统计学显著的。使用Mantel-Cox检验比较存活曲线；使用方差分析与如所指示的多重测试来比较其他结果。

结果

用ΔgD-2的母体接种保护7-14天龄的幼鼠免于HSV-1或HSV-2攻击：为了确定母体接种是否可以保护幼鼠免于出生后的HSV，将成年雌性小鼠用两个剂量的ΔgD-2、rgD-2/明矾-MPL接种疫苗，或作为对照，在交配之前未感染的VD60细胞裂解物，并且用HSV-1或HSV-2的临床分离株以约LD90剂量鼻内攻击它们的幼鼠。最初在出生第7天攻击幼鼠，推测这与足月人婴儿免疫对应。与对照接种的母鼠出生的幼鼠相比，在ΔgD-2免疫的母鼠所生的幼鼠中观察到针对致死性HSV-1和HSV-2疾病的显著保护作用(p＜0.001)(图15A)。相比之下，母体rgD-2/Alum-MPL在7天龄幼鼠中提供针对HSV-1(1/5(20％)存活)或HSV-2(3/18(16.7％存活))的很少保护。当幼鼠在出生第14天攻击时持续保护(图15B，p＜0.001)，但当幼鼠在出生第1天攻击时保护减弱(HSV-2比HSV-1减弱更多)(图15C)。

为了确定7日或14天龄幼鼠中观察到的针对致死性疾病的保护作用是否与针对潜伏储库的建立的保护作用相关联，在脱血时或在存活的小鼠中，在病毒攻击后第14天，通过qPCR针对HSV DNA对三叉神经节进行测定。与用rgD2-Alum/MPL或VD60对照裂解物疫苗接种的小鼠相比，从用ΔgD-2疫苗接种的母鼠所生的幼鼠回收的病毒DNA显著减少，这表明通过母体衍生的Ab的快速病毒清除(参见图17)。

保护与FcγRIV激活抗体相关：HSV结合(ELISA)、中和以及FcγRIV激活Ab水平在从在疾病的安乐死时(攻击后平均第6天)或在攻击存活的幼鼠的实验结束时(攻击后第14天)在出生第7天被HSV-1或HSV-2感染的幼鼠获得的血液中进行定量。用gD-2/Alum-MPL和ΔgD-2进行疫苗接种引起HSV-1或HSV-2结合IgG Ab的类似滴度，而如预期的，在VD60免疫的小鼠所生的HSV感染的幼鼠中检测到很少或没有HSV特异性IgG(图16A，16B)。然而，Ab的功能性分化。在用gD-2/明矾-MPL免疫的母鼠所生的幼鼠的血清中的Ab主要是中和作用(平均NT 1：25)(图16C)，但不激活鼠FcγRIV(图16D)。相反地，在ΔgD-2-免疫的母鼠所生的小鼠中的血清Ab显示出指示ADCC活性的显著的FcγRIV激活，但几乎没有或没有中和活性。

最佳保护需要获得自母乳的抗体：与第7天或第14天相比，当幼鼠在生命的第1天攻击时观察到的保护差异表明，仅经胎盘获得的抗体不足和/或在FcγR效应细胞功能中存在年龄依赖性差异。为了探索这些可能性，将ΔgD-2免疫的母体所生的幼鼠在出生时更换，并且由已用VD60细胞裂解物(仅经胎盘获得的Abs)免疫的母体喂养以及相反地由VD60对照免疫的母亲所生的小鼠由ΔgD-2免疫的母体(仅母乳获得的Abs)喂养。阳性对照是由ΔgD-2免疫的母体所生和喂养的小鼠，并且阴性对照是由VD60对照裂解物免疫的母体所生和喂养的小鼠。然后在生命第7天或第14天鼻内攻击幼鼠并监测两周。与对照(由VD60免疫的母鼠所生和喂养的小鼠)相比，当ΔgD-2免疫的母鼠所生的幼鼠在第7或14天攻击时，如果它们也被ΔgD-2免疫的母鼠喂养，则显著保护免受HSV-1的LD90的损害，但是如果通过对照免疫的母鼠(p＜0.001，具有用于多重比较的校正的Kaplan-Meier)在出生和护士时更换幼鼠，则不是这样。相反地，当在第14天攻击而不是在第7天攻击时，由VD60免疫的母鼠所生的但由ΔgD-2免疫的母鼠所喂养的幼鼠也被显著保护(p＜0.001)。当用HSV-2攻击幼鼠时获得类似的结果。(图19A-C)在接受经胎盘和乳腺Ab的新生儿中针对潜伏期的保护也是最佳的(图20)

结果与攻击时存在于幼鼠血清中的新生儿Ab水平的量相关。(图21A-21B)对于这些研究，在第3、7或14天在未用病毒攻击的“更换的”小鼠中获得血液。(在第1天收集血液是不可行的)。如果小鼠出生于ΔgD-2免疫的母体但不被其喂养，则HSV-2特异性IgG的新生水平快速下降，这与鼠IgG的短半衰期一致。相反地，HSV特异性IgG在仅由ΔgD-2免疫的母体喂养的小鼠中快速增加。在第8-12天收集的样品中证实了乳酪乳中HSV特异性抗体的存在。

在第1天受到攻击的小鼠的保护降低与抗体依赖性细胞杀伤活性有关：尽管在出生第1天存在足够水平的HSV特异性抗体(基于由ΔgD-2免疫的母体所生但未由其喂养的第3天测量水平)，保护在统计学上不显著，表明FcγRIV表达的差异和/或抗体依赖性细胞杀伤(ADCK)的缺陷。与成年小鼠相比，在分离自1-3天龄的肝和脾的免疫细胞亚群中未观察到任何FcγR的表达的显著差异。然而，与第7天或成人细胞相比，从1-3天龄的幼鼠分离的免疫细胞的ADCK效应子功能显著降低。对于这些研究，从不同老化小鼠(效应细胞)中分离的免疫细胞的混合单细胞悬液与HSV-2(ZAG)(表达GFP)感染的HaCAT靶标细胞在存在从ΔgD-2或VD60免疫的成年小鼠收获的血清的情况下温育，并且定量效应细胞杀死靶细胞的能力(数据未示出)。

来自用亚致死剂量的HSV-2感染的小鼠的致死血清不能保护幼鼠免于随后的病毒攻击。将成年雌性小鼠(C567BL/6)用10⁵pfu HSV-2(4674)的剂量或用PBS(对照)鼻内感染。感染后两周，从小鼠收集血清并测试HSV-2特异性抗体。与gD-2接种的小鼠(图22C)相比，在极少的Fc RIV激活的情况下，亚致死感染诱导主要中和(图22B)的IgG应答(图22A，ELISA滴度)。随后将血清阳性或对照小鼠交配，并且在第7天用HSV-2鼻内攻击所得幼鼠。没有观察到显著的保护(图22D)。

讨论

在全球范围内，估计每100,000名新生儿中就有10人感染HSV，其中大多数病例发生在非洲，这反映了母体HSV-2的高发病率。然而，最高的总体流行率可能发生在美洲，那里越来越多的HSV-1和HSV-2血清阴性女性达到育龄期，从而使她们更容易获得任何一种血清型的原发性生殖器感染。如果在分娩时检测到活动性病变，则对有频繁复发史和/或剖腹产史的女性进行阿昔洛韦抑制治疗可能会降低HSV的风险，但大多数围产期传播发生在母体原发HSV且没有临床病变的情况下。因此，最佳预防将需要有效对抗HSV-1和HSV-2两者的临床分离株并且产生有效穿过胎盘的IgG应答的疫苗。

当前鼠研究的结果证明，用ΔgD-2免疫雌性成年小鼠(在受孕之前)引起Ab应答，该Ab应答保护新生小鼠(出生7-14天)免受用HSV-1或HSV-2的临床分离株进行的鼻内病毒攻击。保护与Abs激活鼠FcγRIV以引发ADCK的能力相关。尽管在新生小鼠的血清中产生类似水平的总HSV特异性Ab，但用佐剂化的重组gD-2蛋白的母体免疫在第7天仅提供有限的保护，但在第14天观察到显著的保护，同时获得自母乳的HSV特异性抗体增加。这些发现得到了临床观察的支持，即中和抗体是对自然感染的主要反应，可提供针对新生儿疾病的部分保护。

一些保护(无统计学显著性)在新生儿出生当天是明显的(参见图15C)。然而，当新生小鼠同时接受经胎盘和母乳获得的Ab时，保护是最佳的，正如ΔgD-2免疫母鼠所生的幼鼠失去保护所证明的那样，在出生时切换并且用对照接种疫苗的母鼠进行喂养。这反映了鼠IgG的相对短的半衰期，对于IgG1、IgG2a/c和IgG3是约6-8天并且对于IgG2b是4-6天，以及在小鼠的近端小肠的刷状缘上更高水平的Fc新生儿受体表达。相比之下，人IgG的半衰期长得多，并且婴儿(作为胎儿)由于新生儿FcR在合体滋养层细胞中相对高水平的表达而经胎盘接受其大部分母体IgG。因此，小鼠中的胎儿保护(经胎盘)不足代表可通过胎儿和新生儿人的技术获得的保护。

清楚的是，可以通过母体免疫策略来实现对围产期感染进行预防，并且抗体的被动转移保护了初次接受试验的动物。

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20 25 30

Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Pro

35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

Ala Arg Lys His Thr Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Tyr Arg Met Gly

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Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe

165 170 175

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu

180 185 190

Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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275 280 285

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50 55 60

Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu

85 90 95

Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp

100 105 110

Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly

115 120 125

Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser

130 135 140

Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp

145 150 155 160

Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe

165 170 175

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu

180 185 190

Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His

195 200 205

Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro

210 215 220

Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp

225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

245 250 255

Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro

260 265 270

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala

275 280 285

Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

290 295 300

Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His

305 310 315 320

Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr

325 330 335

Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu

340 345 350

Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr

355 360 365

Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp

370 375 380

Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr

385 390

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

ggccaggcgc ttgttggtgt a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

atcaccgacc cggagaggga 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 5

ccgccgaact gagcagacac ccgc 24