阅读说明：本技术 一种基于锦鲤疱疹病毒orf149的碳纳米管载核酸疫苗及应用 (Carbon nanotube-carried nucleic acid vaccine based on koi herpesvirus ORF149 and application ) 是由 李莹莹 王高学 王庆 胡峰 朱斌 曾伟伟 王英英 尹纪元 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于锦鲤疱疹病毒ORF149的碳纳米管载核酸疫苗及应用,本发明成功构建了单壁碳纳米管载pcDNA-ORF149核酸疫苗系统,提高鱼体抗体水平,其相对免疫保护率为81.9％,免疫水平远远高于其他免疫系统,具有在水产养殖和病原研究的应用潜质。(The invention discloses a koi herpesvirus ORF 149-based carbon nanotube-loaded nucleic acid vaccine and application thereof, successfully constructs a single-walled carbon nanotube-loaded pcDNA-ORF149 nucleic acid vaccine system, improves the antibody level of fish bodies, has a relative immune protection rate of 81.9 percent, has an immune level far higher than that of other immune systems, and has application potential in aquaculture and pathogen research.)

一种基于锦鲤疱疹病毒ORF149的碳纳米管载核酸疫苗及应用

技术领域

本发明属于淡水生物疫苗领域，特别涉及一种基于锦鲤疱疹病毒ORF149的碳纳米管载核酸疫苗及应用。

背景技术

鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)，是引起鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)、锦鲤及其变种发生锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirusdisease，KHVD)的病原。KHVD死亡率高达80％以上，对多个国家地区的鲤鱼及锦鲤养殖产业造成了巨大的经济损失。

因为没有可防控锦鲤疱疹病毒疾病的药物，疫苗是控制疾病最有效的方法之一。有四种疫苗：活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。

活疫苗能够提供较好的免疫保护，但可能造成较多毒力的残留，存在一定的安全风险。大多数可用于水产养殖的疫苗是灭活的非复制疫苗，但灭活疫苗的免疫保护性相对较低。

亚单位疫苗将病原体中与激发机体保护性免疫无关甚至有害的成分去除，但保留了有效免疫原成分。关于KHV亚单位疫苗研究的报道不多，张子鹏等(锦鲤疱疹病毒ORF30和ORF131蛋白的原核表达及纯化，中国农业信息)利用pET原核表达系统表达KHV ORF030和ORF131，注射免疫鲤鱼后进行攻毒检测，保护率仅为20～60％。

DNA疫苗是由裸质粒DNA组成，接种了这种疫苗后，鱼肌肉组织致病蛋白的基因表达，引起机体免疫应答产生相关抗体，从而起到免疫保护。相比传统疫苗，DNA疫苗具有高效性、易于制备、稳定性高等优点，DNA疫苗首次在鱼类中利用并产生功效是虹鳟鱼对感染性造血坏死病毒的免疫实验。随后，有学者对病毒性出血性败血症、病毒性神经坏死病毒、传染性胰腺坏死病毒、病毒性出血热败血症病毒和鲤春病毒DNA疫苗进行了大量研究。Zhou等(Construction of KHV-CJ ORF25 DNA vaccine and immune challenge test，JournalOf Fish Diseases；Vaccination of plasmid DNA encoding ORF81 gene of CJ strainsof KHV provides protection to immunized carp in vitro，Cell Dev Biol Anim)分别以KHV ORF25、ORF81为靶基因制备的DNA疫苗经证明能降低死亡率，表明DNA疫苗具有较好的防控效果。

CyHV-3隶属于疱疹病毒目异疱疹病毒科鲤疱疹病毒属，是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长295kbp，共编码164个开放阅读框(Openreading frame，ORF)，是已知基因组最大的疱疹病毒。Michel等(The genome of cyprinidherpesvirus3encodes 40proteins incorporated in mature virions，J Gen Virol)借助液相色谱串联质谱分析，确定了KHV基因组中有13个ORF编码囊膜蛋白，包括ORF132、ORF059、ORF65、ORF136、ORF149等。

ORF149基因全长2100bp，含699个氨基酸，理论分子量为72.0kDa，只包含一个潜在的N-糖基化位点，93个O-糖基化位点。Fuchs等(Identification of structural proteinsof koi herpesvirus，Arch Virol)在细菌和昆虫细胞中成功表达ORF149，制备了多克隆/单克隆抗体(PAbs/MAb)，以此来研究ORF149的免疫原性，并通过间接免疫荧光和免疫电镜分析发现，ORF149通过识别CyHV-3病毒粒子能够产生特异的中和MAb，证明了ORF149可能是CyHV-3病毒主要的免疫显性蛋白之一。

Torrent等通过新型ELISA方法发现ORF149编码的蛋白质具有抗原性，并将其免疫显性表位定位于蛋白质氨基末端部分。德国KHV OIE参考实验室也验证了ORF149蛋白具有较强的免疫原性。ORF149编码的蛋白具有中和表位，有利于蛋白在病毒附着和细胞穿透中发挥作用，因此ORF149是疫苗开发和诊断测试的目标抗原。

但现有技术中，未见抗锦鲤疱疹病毒KHVD的碳纳米管载ORF149质粒的核酸疫苗的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种基于锦鲤疱疹病毒ORF149的碳纳米管载核酸疫苗。

本发明的目的在于提供上述碳纳米管载核酸疫苗的构建方法。

本发明的目的在于提供上述碳纳米管载核酸疫苗在抗锦鲤疱疹病毒病中的应用。

为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明第一个方面，提出了碳纳米管载核酸疫苗。根据本发明的实施例，所述碳纳米管载核酸疫苗包括单壁碳纳米管和pcDNA-ORF149真核质粒。根据本发明的实施例，所述单壁碳纳米管和pcDNA-ORF149真核质粒的质量比12：1。

根据本发明的实施例，所述碳纳米管载核酸疫苗包括单壁碳纳米管和表达质粒，所述表达质粒包括作为抗原的pcDNA-ORF149。根据本发明的实施例，所述pcDNA-ORF149制备方法：ORF149基因***能在真核细胞中表达的载体；在一些实施例中，所述载体为pcDNA-3.1(+)。

根据本发明的实施例，所述的碳纳米管载核酸疫苗，所述单壁碳纳米管和表达质粒的质量比为8～12：1。

发明人惊奇地发现，本发明制备的碳纳米管载核酸疫苗，因添加的单壁碳纳米管，使得免疫效果远远高于普通核酸疫苗；而且，ORF149为锦鲤疱疹病毒结构蛋白中分子量较大的蛋白，不利于在体外表达整个蛋白。但ORF149编码的蛋白能够产生能特异性识别KHV病毒粒子的中和抗体，是KHV主要免疫显性蛋白之一。可以刺激鱼体产生较高的抗体水平，显著的免疫效果。

本发明第二个方面，提出了碳纳米管载核酸疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)先将碳纳米管与二甲基甲酰胺混合，再加入氨基(-NH₂)与多聚甲醛，搅拌混合，加热得到碳纳米管混合物，抽滤后收集滤液，加入氯仿得到功能化碳纳米管SWCNTs，洗涤，干燥，加入***析出功能化碳纳米管；

(2)将功能化碳纳米管SWCNTs溶于水，超声分散得到SWCNTs；

(3)将SWCNTs与PEI混合，超声分散，离心，取沉淀，洗涤；

(4)烘干，过筛；

(5)将SWCNTs与重组质粒pcDNA-ORF149混合；超声分散后得单壁碳纳米管载pcDNA-ORF149核酸疫苗系统SWCNTs-pcDNA-ORF149。

根据本发明的实施例，步骤(1)所述碳纳米管与二甲基甲酰胺按质量比为1:5混合，所述氨基与多聚甲醛按质量比为1:1混合。

根据本发明的实施例，步骤(1)置于110～150℃加热72～100h得到碳纳米管混合物；优选的，置于130℃加热96h得到碳纳米管混合物。

根据本发明的实施例，步骤(3)SWCNTs与PEI体积比为1:6～9；在一些实施例中，SWCNTs与PEI体积比为1:7；步骤(5)SWCNTs与重组质粒pcDNA-ORF149质量比为8～12:1。

根据本发明的实施例，步骤(3)和步骤(5)室温超声分散30～40min。

本发明第三个方面，提出了所述碳纳米管载核酸疫苗在制备改善鱼类免疫力疫苗中的应用。根据本发明的实施例，所述免疫力可因抗锦鲤疱疹病毒抗体增加而改善。

本发明第四个方面，提出了改善鱼类免疫力的方法。将前面所述的碳纳米管载核酸疫苗注射到鱼体。

根据本发明的实施例，所述免疫力可因免疫相关因子表达被提升而改善。根据本发明的实施例，所述免疫力可因抗锦鲤疱疹病毒抗体增加而改善。

根据本发明的实施例，所述免疫相关因子为cxca、illβ、mx1、vip2、IgM、Igt1。

本发明在克隆、分析KHV囊膜蛋白ORF149基因的基础上，将其完整编码序列***PcDNA-3.1(+)，构建重组质粒，再与氨化的单壁碳纳米管进行连接，构建单壁碳纳米管载ORF149核酸疫苗，注射免疫锦鲤后，相关免疫基因表达量显著提高，锦鲤血清内抗KHV抗体含量显著增多，并发现有较高的免疫保护效果，为探索KHV疫苗的增效机制、开发新型KHV核酸疫苗并进行锦鲤疱疹病毒病的防控奠定基础。

本发明的有益效果是：

1)本发明根据CyHV-3ORF149基因序列，成功构建了可以在真核细胞中表达的锦鲤疱疹病毒ORF149重组质粒。

2)本发明将单壁碳纳米管共价修饰为氨基化单壁碳纳米管，与重组质粒pcDNA-ORF149共价连接，继而成功构建了单壁碳纳米管载pcDNA-ORF149核酸疫苗系统(SWCNTs-pcDNA-ORF149)。

3)本发明构建的核酸疫苗系统SWCNTs-pcDNA-ORF149可以显著提高鱼体抗体水平，其中含1μg ORF149质粒的免疫组的相对免疫保护率为81.9％，远远高于其他免疫系统。

附图说明

图1是PCR扩增ORF149基因产物的电泳图，其中1为ORF149基因PCR产物；2为ORF149基因PCR产物；M为DNA Marker DL 5000；

图2是重组质粒pcDNA-ORF149双酶切鉴定电泳图，其中M.DNA Marker DL 10000；S.重组质粒pcDNA-ORF149双酶切产物；

图3A是pcDNA-ORF149转染后IFA检测，B图为空白对照；

图4是注射核酸疫苗后肌肉中各免疫相关因子表达量；图A～F分别是免疫相关因子(cxca、illβ、mx1、vip2、IgM、Igt1)表达量；

图5是注射核酸疫苗后血清中抗锦鲤疱疹病毒抗体含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

实施例1

1.基因克隆

针对GenBank的CyHV-3ORF149基因序列，用Primer Premier5.0设计特异性高的引物对：F：CAGAATTCCTGAGGACCATGCTCCGTC(SEQ ID NO.1)；

R：CACTCGAGCAAGCAAGCAAAAGCAC(SEQ ID NO.2)；

这对引物划线部分别为限制性内切酶EcoR I和Xho I的酶切位点，引物由生工生物公司合成。

PCR反应体系：12.5μL rTaq Mix、上下游引物各1μL(10μmol/L)和2μL DNA模板，补灭菌水至25μL。

反应程序如下：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s；循环30次；72℃，10min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后与pMD18-T载体连接,即可得到重组克隆质粒pMD18-T-ORF149，将重组质粒转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定，并由艾基生物公司测序验证。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见2100bp的片段，与预期的片段大小符合(图1)。测序后经BLAST比对，与GenBank中登录的KHV ORF149基因(NC_009127.1)核苷酸序列具有99％的一致性，本发明成功克隆了KHV ORF149基因。

2.重组表达质粒构建

对重组克隆质粒pMD18-T-ORF149、真核表达载体pcDNA-3.1(+)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳、切胶、回收、DNA纯化试剂盒纯化，再将目的片段和双酶切后的真核载体进行连接。

酶切体系为：10×buffer 2μL，EcoR I和Xho I各1μL，pMD18-T-ORF149 1μg，补ddH₂O至20μL。37℃水浴酶切2h得到目的片段。

连接体系：T4 Ligase 1.5μL，10×T4 Ligase buffer 1.5μL，pcDNA-3.1(+)3μL，目的片段9μL。16℃连接过夜。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定并由艾基生物公司测序验证，该重组真核载体命名为pcDNA-ORF149。

将构建的重组原核载体pcDNA-ORF149进行双酶切鉴定，获得与预期大小相符的两条条带(图2)，表明重组原核载体pcDNA-ORF149构建成功。

3.质粒DNA瞬时转染

培养RK13单层细胞，待其铺满细胞瓶底部时，使用胰酶消化RK13单层细胞后将细胞消化至细胞变圆从瓶底脱落时，用含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，吹打消化后的分散细胞，然后以一定密度接种于48孔细胞培养板(0.3mL/well，用于做间接免疫荧光试验)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。待培养细胞长至70-80％，用于真核表达质粒的转染，本发明采用Roche公司的X-treme gene HP DNA transfection Reagaent进行转染，具体转染步骤参照说明书进行。

4.间接免疫荧光(IFA)

在48孔板中培养已转染72h的细胞，将培养基弃掉，使用PBS(pH7.4)清洗细胞2次，然后每孔加入100μL的混合液(甲醇和丙酮的体积比为1:1)，-20℃固定30min，倒掉固定液，将细胞在温箱中晾干，干燥20～30min；室温下PBS洗涤3次，每次5min，洗涤时放在小型摇床上轻微摇晃；用含有10％脱脂牛奶的PBS室温下封闭1h；弃去封闭液，室温下PBS洗涤3次，每次5min；每孔加入100μL PBS稀释的(1:100稀释)鼠抗锦鲤疱疹病毒ORF149蛋白的单抗，轻微摇晃室温下孵育1h；室温下PBS洗涤3次，每次5min；加入用PBS稀释的(1:10000稀释)Alexa488抗小鼠IgG二抗，轻微摇晃室温下孵育1h；室温下PBS洗涤3次，每次5min；加入适量的碘化丙啶(PI)进行染核，室温下孵育20min；在荧光显微镜下观察荧光并拍照。

IFA检测结果显示，pcDNA-ORF149真核表达质粒在RK13细胞中能检测到特异性荧光信号，而未转染质粒的RK13细胞作为空白对照组没有检测到荧光信号(图3A和B)，说明了本发明的pcDNA-ORF149真核表达质粒构建成功。

实施例2单壁碳纳米管载pcDNA-ORF149核酸疫苗的制备

一种碳纳米管载核酸疫苗，包括单壁碳纳米管和表达质粒，所述表达质粒包括作为抗原的pcDNA-ORF149；所述pcDNA-ORF149制备方法：ORF149基因***能在真核细胞中表达的载体；所述载体为pcDNA-3.1(+)；所述单壁碳纳米管和表达质粒的质量比为8～12：1。

碳纳米管载核酸疫苗的制备方法：

(1)碳纳米管与二甲基甲酰胺以质量比1:5混合，再加入以质量比1:1混合的氨基及多聚甲醛，搅拌混合，置于130℃处理96h得碳纳米管混合物，再经微孔滤膜抽滤，以除去未反应的碳纳米管，收集滤液。然后用氯仿溶解滤液中残留的有机物质，并用纯水洗涤，置于80℃干燥去除氯仿，加入***析出功能化碳纳米管(SWCNTs，又名碳纳米管)；

(2)称取1.0mg SWCNTs溶于水中，超声分散20min，使碳纳米管均匀分散到水溶液中；

(3)将SWCNTs水溶液(1.0mg/mL)与PEI水溶液(聚乙烯亚胺，分子量1500，1.0mg/mL)按体积比为1：7进行混合，室温下超声分散30min。以10000r/min离心15min，弃去上清液，取沉淀，并将沉淀洗涤3次(以除去未包裹在SWCNTs上的PEI)；

(4)将离心获得的沉淀60℃烘干，研磨过300目细胞筛备用；

(5)将同浓度SWCNTs-PEI水溶液与重组质粒pcDNA-ORF149溶液按体积12：1混合，在室温下超声分散10min，超声分散后的产物即为单壁碳纳米管载pcDNA-ORF149核酸疫苗(SWCNTs-pcDNA-ORF149)。将接种KHV的病毒液70℃灭活18h即为灭活疫苗。未连接碳纳米管的重组质粒pcDNA-ORF149即为重组质粒组。

实施例3

一种改善鱼类免疫力的方法，将本发明制备的碳纳米管载核酸疫苗注射到鱼体，所述免疫力可因免疫相关因子(cxca、illβ、mx1、vip2、IgM、Igt1)表达被提升而改善；所述免疫力可因抗锦鲤疱疹病毒抗体增加而改善。

对本发明制备的核酸疫苗系统作进一步效果检测。

疫苗注射

将540尾锦鲤随机分为9组，将含重组质粒pcDNA-ORF149 1μg、5μg、10μg的碳纳米管载核酸疫苗、未连接碳纳米管，只含重组质粒pcDNA-ORF149 1μg、5μg、10μg的裸露质粒、空质粒、PBS将以肌肉注射方式免疫锦鲤。每尾注射200μL，注射在背鳍左右两边肌肉。灭活疫苗以腹腔注射方式每尾注射200μL。

免疫相关因子表达量测定

锦鲤免疫28天后，取锦鲤脾组织。提取脾组织的RNA，利用荧光定量PCR检测免疫相关因子cxca、illβ、mx1、vip2、IgM、Igt1表达量情况，引物如表1：

表1免疫相关因子引物

PCR反应体系：上下游引物各0.4μL、Rox0.4μL、酶10μL、模板2μL、水6.8μL。反应程序如下：95℃，5min；95℃，15s；60℃，45s；72℃，45s；循环30次；72℃，10min。

结果发现，免疫注射重组质粒组、碳纳米管载重组核酸疫苗组、灭活疫苗后相比PBS及空质粒组，免疫相关因子(cxca、illβ、mx1、vip2、IgM、Igt1)表达量均有上升，且碳纳米管载重组核酸疫苗组免疫相关因子的表达量上升最显著(图4)。

抗KHV抗体含量测定

锦鲤免疫1-4周后，每周随机抽取3条鱼抽取血清，利用间接ELISA方法对锦鲤血清中抗锦鲤疱疹病毒的特异性抗体含量进行检测。

结果发现：注射免疫重组质粒组、碳纳米管载重组核酸疫苗组、灭活疫苗后，抗锦鲤疱疹病毒抗体含量均有增多，且碳纳米管载重组核酸疫苗组抗体含量增多最显著(图5)。

免疫保护率测定

将疫苗注射免疫锦鲤28天后，腹腔注射KHV病毒液，待对照组锦鲤开始死亡时，记录各组锦鲤死亡数，记录2周，进行免疫保护率评价。

结果显示：含10μg ORF149质粒的碳纳米管载核酸疫苗免疫组(SWCNTs-pcDNA-14910μg)的相对免疫保护率高达81.9％(表2)，含ORF149质粒的碳纳米管载核酸疫苗免疫组的相对免疫保护率高于其他组别(如含ORF132质粒)，说明本发明制备的碳纳米管载核酸疫苗免疫效果显著。

表2：注射核酸疫苗后各组免疫保护率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种基于锦鲤疱疹病毒ORF149的碳纳米管载核酸疫苗及应用

<130>

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工引物

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