荔枝草多糖的抗病毒用途
阅读说明：本技术 荔枝草多糖的抗病毒用途 (Antiviral application of common sage herb polysaccharide ) 是由 张敦林 唐波 周业飞 常晨 张道华 华涛 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了荔枝草多糖的抗病毒用途,所述的荔枝草多糖为从荔枝草(Salvia plebeiaR．Br．)的全草中提取的多糖。所述的病毒为抗猪伪狂犬病毒,荔枝草多糖通过减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变,抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制,进而杀死猪伪狂犬病毒。本发明还提供一种抗病毒制剂,是将荔枝草多糖溶解于0.05～0.20 mol/L的PBS缓冲液或者DMSO得到浓度为200～800μg/mL的溶液,该水剂对猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)具有良好的防治作用,是发展高效、绿色、生态农业的理想生物兽药。(The invention discloses an antiviral application of common sage herb polysaccharide, wherein the common sage herb polysaccharide is prepared from common sage herb (common sage herb) Salvia plebeia R.br.) from the whole plant. The virus is anti-porcine pseudorabies virus, and the common sage herb polysaccharide inhibits the adsorption, cell entering and replication of the porcine pseudorabies virus by reducing cytopathic effect caused by the porcine pseudorabies virus, so that the porcine pseudorabies virus is killed. The invention also provides an antiviral preparation, wherein the common sage herb polysaccharide is dissolved in 0.05-0.20 mol/L PBS buffer solution or DMSO to obtain a solution with the concentration of 200-800 mu g/mL, and the aqueous solution has a good prevention and treatment effect on porcine Pseudorabies virus (PrV), and is an ideal biological veterinary drug for developing high-efficiency, green and ecological agriculture.)
技术领域
本发明涉及荔枝草多糖在制备抗病毒药物中的新用途。
背景技术
猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)属疱疹病毒科，与其他疱疹病毒类似，伪狂犬病毒在正常情况下对猪的各种神经组织具有潜伏感染性，能引起多种家畜和野生动物发热，奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病，呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一，预防和控制该病毒在家畜类的传播显得尤为重要。
目前，应用于抗猪伪狂犬病毒的药物主要是抗病毒生物制剂和西药。然而，还没有发现不影响宿主细胞代谢而只干扰病毒复制或者直接杀死病毒的药物，而且有的病毒还对抗病毒药物产生了抗药性,甚至出现了依赖药物的变异,使抗病毒药物效果不佳。中草药因为毒副作用较小,残留少,在抗病毒方面具有西药所不能达到的优势。许多试验表明中草药能够干扰病毒复制,还可以通过调节机体的免疫力、非特异性抗炎反应来发挥其抗病毒作用。
荔枝草为唇形科鼠尾草属植物荔枝草Salvia plebeia R.Br.的全草，又名雪见草、蛤蟆草、皱皮草等，主要产自江苏、浙江、安徽、河南、山东等地，资源丰富，首载于《本草纲目》，其化学成分主要有多糖、萜类、黄酮类、苯丙素类及挥发油类，具有抗菌、抗炎、抗氧化等药理活性，主要用于治疗人扁桃体炎、支气管炎、崩漏、便血、肾炎水肿等。在抗病毒兽药应用方面，仅见刘嘉魁等的复方兽药专利申请--一种用于抗病毒兽药液及其制备方法(申请号：201811238488.6)，该专利采用癸氧喹酯、两面青、金银花、甘草、柴胡、黄芪、白扁豆、刺五加、忍冬藤、荔枝草等多种复合成分，制备了一种抗病毒兽药液，但其药效成分不明确，所述兽药抑制的病毒种类亦不明确，其仅说明加入的两面青、金银花、甘草、柴胡等具有明显的抗病毒效果，也说明加入癸氧喹酯可以与重要的抗病毒活性成分起到协同作用提高成品药液的功效，并未明确荔枝草的抗病毒功效，且该专利在其复方兽药中采用的是荔枝草提取液的乳酸菌发酵液。在公开号为CN102083415A，名称为用于治疗疱疹病毒感染的方法中，提供了将纳米乳剂组合物局部施用于，所述的纳米乳剂具有对疱疹病毒具有抗病毒或抑病毒性质，其包括抗病毒主药以及其他药学助剂，制备该纳米乳剂时的油中，荔枝草叶油作为了备选油，但其用途仅在于作为油相。
迄今为止，未见荔枝草多糖应用于猪伪狂犬病毒引起的牲畜类传播疾病的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供荔枝草多糖的抗病毒新用途。
所述的病毒为抗猪伪狂犬病毒。其作用机理是荔枝草多糖可以减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变,抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制,且可直接杀死猪伪狂犬病毒。
本发明所述的荔枝草为唇形科鼠尾草属植物荔枝草Salvia plebeia R.Br.的全草。
本发明提供一种用于预防或者治疗猪伪狂犬病毒感染的制剂,包括了荔枝草多糖以水为溶剂经热煮法提取，乙醇沉淀后得到的固形物。
上述制剂中荔枝草多糖固形物的含量为200～800μg/mL，较佳地，含量为400～600μg/mL，更佳地，该含量为600μg/mL。
所述制剂是将所得荔枝草多糖溶解于缓冲液中所得，所采用的溶剂为PBS缓冲液或者DMSO；
所述PBS缓冲液的浓度为0.05～0.20mol/L，较佳地为浓度为0.10～0.12mol/L。
有益效果:本发明提供了荔枝草多糖对于猪伪狂犬病毒的抗病毒作用，通过减少猪伪狂犬病毒引起的细胞病变,抑制猪伪狂犬病毒的吸附、入胞和复制,对环境污染小, 且对动物无毒副作用。
附图说明
图1荔枝草多糖含量测定标准曲线及结果，如图1显示，葡萄糖标准溶液浓度在10～50mg/L范围内与吸光度呈现良好线性关系(A：吸光度、C：葡萄糖标准溶液浓度)；
图2荔枝草多糖的病毒抑制作用线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
制备荔枝草多糖固形物(参考文献：汪亚楠,田祎穎,黄俊霖,等.荔枝草总多糖提取工艺研究[J].广州化工,2018,046(010):75-77)
(1)称取荔枝草全草20g，剪碎，放入1000mL的烧杯中，加入500mL水，加热，煮沸1～2h(参考文献中加热温度不超过90℃。提高温度有利于提取更完全)，过滤，除去滤渣，蒸馏除去部分的水，得到荔枝草水提物溶液100mL，冷却至室温。
(2)加入400mL的无水乙醇使溶液中的多糖沉淀，再放入4℃的冰箱内静置过夜，抽滤，干燥，得到粗多糖。(参考文献中无此步骤。本步骤有助于除去多糖中的杂质)
(3)所得粗多糖用50mL热水溶解，溶解后的液体按体积比3:1加入Sevege 试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1)进行除蛋白处理，重复上述过程，直到无蛋白析出。
(4)将溶解后的液体与Sevage试剂充分混匀后抽滤，再冷冻干燥，得荔枝草多糖4.28g。
实施例2
荔枝草多糖含量的测定(参考文献：汪亚楠,田祎穎,黄俊霖,等.荔枝草总多糖提取工艺研究[J].广州化工,2018,046(010):75-77)
(1)葡萄糖标准溶液的配置：准确称取葡萄糖分析纯样品1.0100g,加入少量去离子水溶解，并定容至100mL容量瓶中，得0.1000g/L浓度的葡萄糖标准溶液。
(2)标准曲线的制备：分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准溶液置于试管中，各试管中加蒸馏水至2.0mL后加入1mL 5％的苯酚溶液，将溶液充分混匀后滴加5mL浓硫酸，混合均匀后静置5min，再放入55℃水浴中加热15min，取出后自然冷却5min终止反应，迅速测定，采用UV法在490nm处测定吸光度(A)，蒸馏水为空白对照，最终以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖线性方程，如图1所示。
(3)样品溶液制备：取粗多糖样品1.0g，加蒸馏水溶解并定容至100mL容量瓶中，得浓度为0.1g/L的粗多糖样品溶液。取0.25mL粗多糖样品溶液至试管中，加蒸馏水至2.0mL后加入1mL 5％的苯酚溶液，将溶液充分混匀后滴加5mL浓硫酸，混合均匀后静置5min，再放入55℃水浴中加热15min，取出后自然冷却5min 终止反应，迅速测定，采用UV法在490nm处测定吸光度(A)。粗多糖样品溶液测得吸光度为0.288，通过线性方程A＝8.56c+0.1936(R2＝0.99497)计算出粗多糖样品中多糖含量为81.09％，荔枝草全草多糖含量为5.51％。
实施例3荔枝草多糖抗猪伪狂犬病毒的制剂的制备
一种抗猪伪狂犬病毒的制剂,由实施例1所得荔枝草多糖固形物溶解于0.1mol/L的PBS缓冲液中获得,所得溶液中，荔枝草多糖的浓度分别为200μg/mL,400μg/mL和 600μg/mL。
实施例4荔枝草多糖抑制猪伪狂犬病毒活性测定
用实施例3所得荔枝草多糖浓度为200μg/mL,400μg/mL,600μg/mL的制剂处理处理103.0TCID50/mL的PRV病毒液，同步接种事先长成致密单层的的ST细胞，同时设立药物处理及接毒对照及细胞对照(24孔板)。24小时及48小时收集来自(未) 处理的PRV感染细胞的培养上清液(冻融)，测量病毒含量。结果见表1及图2，荔枝草多糖抗病毒实验ST细胞接种24小时可见接种PRV的对照细胞孔出现约50％细胞病变。400μg/mL、600μg/mL剂量组均未出现病变，200μg/mL剂量组出现约 10-20％的轻微病变,荔枝草多糖对照孔与细胞对照孔相比无肉眼可见变化。荔枝草多糖抗病毒实验ST细胞接种48小时可见接种PRV的细胞对照孔细胞全部病变漂浮。 600μg/mL剂量组未出现病变，400μg/mL剂量组可见20％左右病变，200μg/mL剂量组可见80％左右病变。
表1
实施例5猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR
用实施例3所得荔枝草多糖浓度为200μg/mL,400μg/mL,600μg/mL的制剂处理处理103.0TCID50/ml的PRV病毒液，同步接种事先长成致密单层的的ST细胞，同时设立药物处理及接毒对照及细胞对照(24孔板)。48小时收集来自(未)处理的PRV 感染细胞的培养上清液(冻融)，提取病毒基因组，测定荧光定量PCR，设三个重复。根据文献“猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立”里标准曲线，分析定量样品cp值。结果见表2，荔枝草多糖浓度可抑制伪狂犬病毒的复制，随着荔枝草多糖浓度增加，细胞孔的病毒拷贝数越低。
表2
实施例6荔枝草多糖对小鼠致死性攻击的保护作用实验
在致死剂量的强毒PRV毒株100LD50(SQ-20181210)腹腔攻击小鼠组，并在攻毒前(后)24和48小时分别用荔枝草多糖(40mg/kg体重，60mg/kg体重，80mg/kg 体重，100mg/kg体重，120mg/kg体重及140mg/kg体重),并设立攻毒对照组及药物对照组。每日观察存活率。结果见表3，其中40mg/kg体重保护率为1/5,60mg/kg体重保护率为1/5，80mg/kg体重保护率为2/5,100mg/kg体重保护率为3/5,120mg/kg体重保护率为4/5,140mg/kg体重保护率为4/5,因而荔枝草多糖用量为120mg/kg时为最佳。
表3
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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