皱皮木瓜多糖在制备抗病毒的药物上的应用
阅读说明：本技术 皱皮木瓜多糖在制备抗病毒的药物上的应用 (Application of chaenomeles speciosa polysaccharide in preparation of antiviral drugs ) 是由 宋桥明 汪鋆植 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供皱皮木瓜多糖在制备抗流感病毒的药物上的应用。所述的皱皮木瓜多糖在制备抗禽流感病毒的药物上的应用。所述的皱皮木瓜多糖与H7N9禽流感灭活疫苗的组合物在制备抗禽流感病毒的药物上的应用。本发明的木瓜多糖具有抗病毒作用,降低病毒感染鸡的死亡。与疫苗联用效果更显著。可与疫苗联用用于禽流感的预防与治疗。木瓜多糖具有促生长作用,可促进鸡生长。特别是鸡感染病毒后,既能抗病毒,又能促进鸡生长。与疫苗联用效果更显著。(The invention provides application of chaenomeles speciosa polysaccharide in preparation of a medicine for resisting influenza viruses. The application of the chaenomeles speciosa polysaccharide in preparing the medicine for resisting avian influenza virus is provided. The application of the composition of the chaenomeles speciosa polysaccharide and the H7N9 avian influenza inactivated vaccine in preparing the medicine for resisting avian influenza virus is provided. The pawpaw polysaccharide has an antiviral effect, and can reduce death of virus infected chickens. The effect is more obvious when the composition is used together with a vaccine. Can be used for preventing and treating avian influenza in combination with vaccine. The fructus Chaenomelis polysaccharide has growth promoting effect, and can promote chicken growth. Especially, after the chicken is infected with virus, the virus can be resisted, and the growth of the chicken can be promoted. The effect is more obvious when the composition is used together with a vaccine.)
技术领域
本发明涉及一种家禽用抗病毒的药物，具体为H7N9禽流感病毒的药物。
背景技术
皱皮木瓜为贴梗海棠(Chaenmeles speciosa Nakai)的干燥近成熟果实，湖北长阳是皱皮木瓜主产地。木瓜自古以来作为治病良药，具有平肝舒筋、和胃化湿、降压、降糖、软化血管、护肝降酶、养颜抗衰、防老年痴呆、促进血液循环、延年益寿和提高人体免疫力等功效。木瓜药食同源，含有多种对人体有益的营养成分和药用成分，如多糖、有机酸、黄酮、三萜、氨基酸、蛋白酶和维生素等。对木瓜有机酸、黄酮、三萜药理研究报前较多，对木瓜多糖的研究主要在抗氧化、抗肿瘤方面。近年来，多糖良好的免疫调节功效，使其成为研究热点，多糖在食品、医疗、保健等领域的应用广泛。多糖是皱皮木瓜的重要成分之一。本研究发现木瓜多糖具有良好的抗病毒活性，可作为饲料添加剂，也可用于开发功能性饮料、药品和保健品。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种皱皮木瓜多糖在制备抗流感病毒的药物上的应用。
进一步的，所述的皱皮木瓜多糖在制备抗禽流感病毒的药物上的应用。
所述的皱皮木瓜多糖与H7N9禽流感灭活疫苗的组合物在制备抗禽流感病毒的药物上的应用。
皱皮木瓜多糖掺混于鸡饲料后进行投喂。
所述的皱皮木瓜多糖的掺混量为鸡饲料质量的0.001-0.05％。
本发明的木瓜多糖具有抗病毒作用，降低病毒感染鸡的死亡。与疫苗联用效果更显著。可与疫苗联用用于禽流感的预防与治疗。
木瓜多糖具有促生长作用，可促进鸡生长。特别是鸡感染病毒后，既能抗病毒，又能促进鸡生长。与疫苗联用效果更显著。
木瓜多糖能提高鸡免疫功能。木瓜多糖能提高鸡感染病毒后血清中抗体(IgG)含量和免疫器官指数，有利于抗病毒，保证鸡健康。
具体实施方式
实施例1
实验材料及仪器
实验材料：皱皮木瓜(Chaenmeles speciosa Nakai)采自湖北省长阳土家族自治县榔坪镇关口垭村，由三峡大学王玉兵教授鉴定。
主要试剂：95％乙醇，三氯乙酸，NaOH，3500Da半透膜，上海源叶生物公司。
主要实验仪器
FreeZone真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司
5415R小型台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司
NanoQuant酶标仪 瑞士Tecan公司
N-1300型旋转蒸发仪 日本EYELA公司
GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
SB-2000型水浴锅 上海爱朗仪器有限公司
木瓜多糖的提取
木瓜干燥果实10kg，加入95％乙醇回流两次，每次100L，每次2h，脱脂。乙醇回流提取后的木瓜水浴锅上挥干乙醇，80℃烘干。再用沸水提取三次，每次150L，每次3h，合并三次滤液，减压蒸发浓缩至10L。浓缩液加入95％乙醇30L，醇沉48h，然后4000RPM离心10min，将沉淀于水浴锅上挥干乙醇，加水溶解，冰浴中按照40g/L加入三氯乙酸，反应20min后取出加入NaOH溶液调pH至中性，4000RPM离心10min，上清液用流动水于透析袋中透析两天，将透析液浓缩至2L后再加入95％乙醇6L醇沉过夜，4000RPM离心10min，将沉淀于水浴锅上挥干乙醇，冷冻干燥得皱皮木瓜粗多糖。得到褐色粉末状木瓜多糖420g，得率为4.2％。
实施例2
木瓜多糖抗禽流感及对鸡免疫促长作用实验研究
实验材料及仪器
实验材料：
疫苗；H7N9禽流感灭活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司。H7N9禽流感病毒，华中农业大学动物科学技术学院提供。
MDCK细胞，上海中科院细胞库
鸡免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒科诺迪生物有限公司；
木瓜多糖，取自实施例1。
主要实验仪器
超净工作台，苏州净化设备有限公司
二氧化碳培养箱，上海三腾仪器有限公司
病毒在鸡胚内的扩增
取原代H7N9禽流感病毒静脉感染实验鸡，取死亡当天实验鸡的鼻拭子上清和肺部组织研磨液于9-10日龄鸡胚中扩增。扩增方法如下：
(1)检査鸡胚与标记鸡胚气室：使用照卵灯检查鸡胚，去除已死亡的不合格鸡胚，合格鸡胚在气室处进行标记。
(2)消毒鸡胚与鸡胚开孔：将完成标记和酒精消毒的鸡胚轻置于生物安全柜中，使用无菌镊子的尖部在标记气室上方5mm处打孔。
(3)接种样本：使用1ml无菌注射器吸取稀释后的病毒样本，从开孔处垂直下针接样本(0.1ml/枚)。
(4)鸡胚封孔和孵育：使用无菌的蜡片封闭鸡胚孔后将其转移到二氧化碳培养箱中，37℃连续培养48h。
(5)收获鸡胚尿囊液：培养结束后将鸡胚存放于4℃冰箱中冷却过夜。过夜冷却结束后，75％酒精喷洒鸡胚消毒后置于生物安全柜内，用钝器敲裂鸡胚气室外壳并用无菌镊打开鸡胚气室。打开气室后使用无菌移液管吸取尿囊液并将其收获于15ml离心管中。
(6)鸡胚尿囊液的分装保存：将收获于15ml离心管的尿囊液离心取上清并分装到冻存管中密封。4℃冰箱保存备用。
病毒TCID50/ml的测定
MDCK细胞的微量滴定板准备
1)用无菌PBS溶液漂洗细胞培养瓶中的单层MDCK细胞。
2)使用胰蛋白酶在37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中消化细胞约10min。细胞分散后将细胞悬液离心并弃除上清液。
3)细胞重悬至105个/ml，加入96孔板中，每孔100μl。置于37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中培养20h。
病毒的梯度稀释
1)准备8支15ml离心管。按稀释梯度从高到低的顺序分别标记-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8。每支管加9ml病毒生长液。
2)取1ml待滴定尿囊液加入“-1”管内，吹打混匀，再从“-1””管内吸取1ml加入“-2”管内。以此类推10倍稀释病毒原液。
3)使用病毒生长液漂洗静置过夜MDCK细胞生长液弃除。
4)漂洗后每列依次加入梯度稀释病毒液。以此类推共8列，每列加样复孔为6个，每孔均为100μl。完成加样后将细胞板放置于37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中静置1h以吸附病毒。
5)吸附完成后弃去板中溶液，每孔加200μl病毒生长液，在37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中静置72h。根据细胞病变情况进行统计。统计后用浓度为1％的火鸡血悬液复核。根据不同稀释度的细胞病变孔数，根据Reed-Muench公式计算样品的滴度。求出TCID50/ml(半数组织细胞感染剂量)。
实施例3
木瓜多糖抗禽流感及对鸡免疫促长作用
选90日龄鸡140只，随机分为7组，每组20只。
核实以下描述正确与否空白组：未感染H7N9禽流感疾病的健康鸡，不接种疫苗也不喂食木瓜多糖，仅喂食基础饲料。
模型组：感染H7N9禽流感疾病的鸡，不接种疫苗也不喂食木瓜多糖，仅喂食基础饲料。
疫苗组：感染H7N9禽流感疾病的鸡，肌肉接种H7N9禽流感灭活疫苗。
木瓜多糖1组：感染H7N9禽流感疾病的鸡，基础饲料中添加质量分数为0.01％的木瓜多糖。
木瓜多糖2组：感染H7N9禽流感疾病的鸡，基础饲料中添加质量分数为0.05％的木瓜多糖。
木瓜多糖3组(疫苗)：感染H7N9禽流感疾病的鸡，肌肉接种H7N9禽流感灭活疫苗，并在基础饲料中添加质量分数为0.01％的木瓜多糖。
木瓜多糖4组(疫苗)：感染H7N9禽流感疾病的鸡，肌肉接种H7N9禽流感灭活疫苗，并在基础饲料中添加质量分数为0.05％的木瓜多糖。
一周后，除空白组外，每只鸡经鼻接种0.1ml生理盐水稀释的107TCID50/ml病毒鸡胚尿囊液。空白组鸡经鼻接种0.1ml生理盐水。分组隔离饲养。时及打扫鸡舍卫生。每天清洗水槽、料槽，每天定时通风换气，鸡舍及周边环境每周喷雾消毒。
接种疫苗当天起，木瓜多糖组分别给予添加木瓜多糖的饲料，木瓜多糖1、3组在基础饲料中添加质量分数为0.01％的木瓜多糖，木瓜多糖2、4组在基础饲料中添加质量分数为0.05％的木瓜多糖；连续饲喂21天。接种疫苗后2、4周翅下静脉采血，分离血清，检测免疫抗体水平(IGg)。其他组及木瓜多糖组非添加期，饲喂基础饲料。基础饲料为玉米粉、豆粕、鱼粉以质量比10：2：1的混合物。
木瓜多糖对鸡存活率的影响
结果见表1。以107TCID50/ml的剂量感染鸡，鸡明显出现精神萎靡、食欲减退等临床症状，感染鸡5-10为死亡高峰期。随着时间的延长，木瓜多糖与疫苗联用组先恢复，逐渐趋于正常。木瓜多糖能降低病毒感染鸡的死亡，与疫苗联用效果更显著。
表1木瓜多糖对鸡存活率的影响
组别
存活数(只)
死亡(只)
存活率(％)
空白组
20
0
100**
模型组
4
16
20
疫苗组
13
7
65**
木瓜多糖1组
8
12
40
木瓜多糖2组
10
10
50*
木瓜多糖3组(疫苗)
16
4
80**
木瓜多糖4组(疫苗)
18
2
90**
与模型组相比*P＜0.05**P＜0.01
木瓜多糖对鸡增重的影响。
结果如表2。以107EID50的剂量感染鸡，鸡生长明显减慢，与空白组比，差异显著(P＜0.05)，木瓜多糖组、木瓜多糖组联用疫苗组与模型组比鸡增重作用明显，木瓜多糖能伸促进病毒感染存活鸡的生长，与疫苗联用效果更显著。
表2木瓜多糖对鸡增重的影响
与模型组相比*P＜0.05**P＜0.01
攻毒检测：接种病毒第3天，采集鸡血，用现配制的1％鸡红细胞悬液在96孔微量血凝板上按常规方法进行病毒血凝效价(HA)检测，HA≥24为阳性，HA＜24为阴性。结果：用血凝抑制试验对鸡血样进行血凝效价检测，攻毒后3天血凝效价均≥24，空白对照血凝效价＜24，表明攻毒成功。
木瓜多糖对鸡血清中IgG的影响。
的测定：采用ELISA检测保存的血清样品中IgG的浓度，具体操作根据IgG试剂盒说明书进行。鸡IgG标准品浓度依次为：2400、1200、600、300、150、75μg/μL。按说明书设置标准孔和样品孔，然后37℃恒温箱育60min，洗涤液5次，加底物后37℃避光恒温箱育15min，最后加入终止液，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。根据标准品的OD值为横坐标，浓度值为纵坐标绘制标出准曲线，根据标准曲线计算样品中IgG的含量(y＝2465.1X-201.3R2＝0.999)。结果如表3。疫苗免疫后第免疫后2、4周，与模型组与空白组比血清中IgG含量升高，但差异不显著，疫苗组、木瓜多糖组、木瓜多糖组联用疫苗组与空白组比血清中IgG含量升高，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，木瓜多糖单用可以增加病毒感染存活鸡血清中IgG含量，与疫苗联用效果更显著。
表3木瓜多糖对鸡血清中IgG的影响(μg/ml)
与空白组相比*P＜0.05**P＜0.01
木瓜多糖对鸡免疫器官指数的影响。
结果如表4。疫苗免疫后4周，与模型组与空白组比免疫器官指数升高，但差异不显著，疫苗组、木瓜多糖组、木瓜多糖组联用疫苗组与空白组比免疫器官指数升高，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，木瓜多糖单用可以增加病毒感染存活鸡免疫器官指数，与疫苗联用效果更显著。
表4木瓜多糖对鸡免疫器官指数影响
组别
数量(只)
脾脏指数％
胸腺指数％
法氏囊指数％
空白组
20
0.35±0.05
0.48±0.10
0.41±0.05
模型组
4
0.38±0.07
0.52±0.08
0.44±0.09
疫苗组
13
0.45±0.07*
0.57±0.05*
0.46±0.08*
木瓜多糖1组
8
0.50±0.12**
0.71±0.09**
0.53±0.07**
木瓜多糖2组
10
0.54±0.08**
0.73±0.11**
0.55±0.12**
木瓜多糖3组(疫苗)
16
0.57±0.06**
0.74±0.12**
0.56±0.08**
木瓜多糖4组(疫苗)
18
0.59±0.07**
0.76±0.13**
0.59±0.11**
与空白组相比*P＜0.05**P＜0.01
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