灵芝孢子粉多糖在防治急性肺损伤中的应用
阅读说明：本技术 灵芝孢子粉多糖在防治急性肺损伤中的应用 (Application of ganoderma lucidum spore powder polysaccharide in preventing and treating acute lung injury ) 是由 孙晓波 罗云 张雪涟 魏菲 王梦晨 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本申请提供了灵芝孢子粉多糖在制备治疗肺损伤,特别是细菌脂多糖引起的肺损伤的药物中的应用,灵芝孢子粉多糖能有效降低肺脏炎症基因表达水平和肺脏炎症基因表达水平。本申请还提供了灵芝孢子粉多糖在在制备降低肺脏新冠病毒特异受体Neuropilin-1水平的药物中的应用。(The application provides application of ganoderma lucidum spore powder polysaccharide in preparing a medicament for treating lung injury, particularly lung injury caused by bacterial lipopolysaccharide, wherein the ganoderma lucidum spore powder polysaccharide can effectively reduce the expression level of lung inflammation genes and the expression level of the lung inflammation genes. The application also provides application of the ganoderma lucidum spore powder polysaccharide in preparing a medicine for reducing the level of the lung neocoronavirus specific receptor neuroxilin-1.)
发明领域：
本申请属于呼吸道疾病、感染性疾病和天然药物领域，具体地，本申请提供了灵芝孢子粉多糖在制备治疗肺损伤，特别是细菌脂多糖引起的肺损伤的药物中的应用。
背景技术
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灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体。具有补气安神，止咳平喘的功效。主治心神不宁，失眠，惊悸，咳喘痰多，虚劳证等，是我国传统的补益中药。《神农本草经》称为“神芝”，秦时称为“还阳草”，东汉称为“灵草”。灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。灵芝作为中药在中国已有千年使用历史，在保健食品中拥有很高的市场占有率。已有大量科学数据表明其具有抗氧化、抗肿瘤等活性。灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。灵芝多糖是灵芝孢子粉中最有效的成分之一，具有广泛的药理活性，例如免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老及抗肿瘤作用。本研究通过建立LPS诱导的急性肺损伤模型，评价灵芝孢子粉多糖对其保护作用。
发明内容
一方面，本申请提供了灵芝孢子粉多糖在制备治疗肺损伤的药物中的应用。
进一步地，所述肺损伤为细菌脂多糖引起的肺损伤。
进一步地，灵芝孢子粉多糖降低血浆炎症因子水平。
进一步地，所述血浆炎症因子为GM-CSF和/或IL-6。
进一步地，灵芝孢子粉多糖降低肺脏炎症基因表达水平。
进一步地，所述肺脏炎症基因表达水平为IL-1β，IL-6和/或TNF-α。
另一方面，本申请提供了灵芝孢子粉多糖在制备治疗新冠病毒引起的肺损伤的药物中的应用。
进一步地，灵芝孢子粉多糖降低肺脏新冠病毒特异受体Neuropilin-1水平，降低cleaved-caspase-3和P62表达水平，升高Bcl2/Bax和LC3II/LC3I的表达水平。
另一方面，本申请提供了灵芝孢子粉多糖在制备降低肺脏新冠病毒特异受体Neuropilin-1水平的药物中的应用。
进一步地，所述灵芝孢子粉多糖按照以下方法制备：
(1)取灵芝孢子粉20g于圆底烧瓶，加150mL 95％乙醇过夜，抽滤，晾干； (2)滤饼置于圆底烧瓶，加水300mL，80℃下加热回流2小时，滤过，少量热水洗涤滤器和滤渣，相同条件重复3次，合并滤液；(3)旋蒸，滤渣用10mL 水溶解，边搅拌边缓慢加入乙醇80mL，摇匀；(4)4℃放置12小时，离心，弃上清液，将所得沉淀物烘干，即得。
本申请中的灵芝孢子粉多糖是指以灵芝孢子粉为原料提取的多糖物质，本领域技术人员公知可用的提取方法并可以常规选用。
本申请中的“细菌脂多糖引起的肺损伤”不仅包括实验中使用细菌脂多糖诱导的肺损伤，也包括人或动物收到细菌感染后由所感染细菌分泌的脂多糖引起的肺损伤。
附图说明
图1显示了小鼠体重和肺指数情况；
图2显示了小鼠白细胞数情况；
图3显示了GLP对LPS诱导小鼠急性肺损伤组织病理学改变的影响；
图4显示了GLP对LPS诱导小鼠急性肺损伤血浆炎症因子表达水平的影响；
图5显示了GLP对LPS诱导小鼠急性肺损伤炎症因子基因表达水平的影响；
图6显示了GLP对新冠受体蛋白NRP1，自噬及凋亡相关蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
实施例1实验分组及给药
60只6～8周龄雄性自发性糖尿病小鼠模型C57BL/6N小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2019-0009；在中国医学科学院药用植物研究所动物中心进行动物饲养。动物实验设施持续保持屏障环境标准。主要环境指标的控制范围：室温20～26℃，日温差≤4℃。相对湿度40～70％。最小换气次数15次/小时，光照明：暗＝12h，明＝12h。动物饲养于标准盒内，每盒5只，其饲养空间符合中华人民共和国国家标准GB14925-2010中关于实验动物所需最小空间的规定。所有动物均由培训合格的人员进行饲养管理，整个饲养过程中保持动物饮食活动自由。
灵芝孢子粉多糖(polysaccharide from Ganoderma lucidum，GLP)由中国医学科学院药用植物研究所天然药物化学中心田瑜老师提供(基本制备方法包括1、取灵芝孢子粉20g于圆底烧瓶，加150mL 95％乙醇过夜，抽滤，晾干；2、滤饼置于圆底烧瓶，加水300mL，80℃下加热回流2小时，滤过，少量热水洗涤滤器和滤渣，相同条件重复3次，合并滤液；3、旋蒸，滤渣用10mL水溶解，边搅拌边缓慢加入乙醇80mL，摇匀；4、4℃放置12小时，离心，弃上清液，将所得沉淀物烘干，即得灵芝粗多糖。)，细菌脂多糖(sigma，L2880)，地塞米松 (北京索莱宝科技有限公司，722G053)。
根据体重随机将实验动物分为6组，每组10只，如下：①对照组；②模型组；③-⑤灵芝多糖低、中、高剂量组(25,50,100mg.kg-1)；⑥地塞米松组 (6mg.kg-1)。所有试药均溶于生理盐水中。各组每3天称取体重，③-⑤组每天灌胃给药1次，⑥组腹腔连续给药7天；①-②组给予相当剂量生理盐水，连续给药2周。最后一次给药结束6h后，气管注射LPS(10mg/kg，50ul生理盐水)， 24h后摘眼球取血，静置离心，获取上清，上清置于-80度冰箱保存。
实施例2肺泡灌洗液检测
处死小鼠后，立刻气管注入冷冻PBS灌洗1次，1.0ml/次，获取后1500r/min，离心10min；灌洗后的肺置于-80度低温冰箱保存。
实施例3总白细胞数检测
预冷磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)1mL经气管注入左肺，注入后静止平衡 30s，然后再缓慢抽出，每只动物灌洗1次。取BALF 1mL，1000r.min-1离心 10min，除去上清液，沉淀每管加入200μL红细胞裂解液重悬，然后加入PBS 液500μL混匀后离心去上清，沉淀加入500μLPBS液重悬白细胞，用全自动细胞计数仪进行白细胞计数。
如图2所示，与对照组相比，模型组小鼠肺泡灌洗液白细胞总数显著增加，表明模型成功建立。与模型组相比，GLP低、中、高剂量能够显著降低白细胞总数。该实验结果表明，灵芝多糖可显著改善肺泡炎性反应。
实施例4肺指数检测
未灌洗的小鼠处死后取出肺，并称肺湿重，计算肺指数。
结果如图1所示，各组小鼠体重及肺指数均无显著变化，表明LPS和不同剂量GLP对小鼠体重及肺指数无调节作用。
实施例5肺组织HE染色
称湿重后的肺放于适量多聚甲醛固定液中，制作石蜡切片，HE染色。染好的片子置于显微镜下拍照。
如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠肺泡出现了较多的炎性细胞渗出，偶见肺泡水肿；与模型组小鼠相比，GLP组能够显著改善上述变化。以上结果表明，GLP能够显著改善LPS诱导的急性肺损伤。
实施例6血浆炎症因子检测
-80度冰箱低温取出血浆，按照试剂盒说明检测血浆炎症因子GM-CSF,IL-6 和TNF-α表达水平。
如图4所示，与对照组相比，模型组小鼠血浆中GM-CSF,IL-6和TNF-α表达水平显著增加，表明LPS刺激后促使肺部炎症损伤。与模型组相比，GLP处理组小鼠GM-CSF和IL-6表达水平显著降低，而对TNF-α表达水平无显著影响；结果表明，GM-CSF和IL-6是GLP保护肺炎损伤的血浆检测的敏感指标。
实施例7 RT-PCR
按照试剂盒说明书提取肺组织mRNA，反转录成cDNA，配平以后根据试剂盒说明书进行real-time PCR，通过2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。
表1引物序列
如图5所示，与对照组相比，模型组小鼠肺脏炎症基因Il-1β，IL-6，TNF-α，和Ccl2表达水平显著增加，表明LPS刺激后促使肺部炎症损伤。与模型组相比，GLP处理组小鼠IL-1β，IL-6和TNF-α表达水平显著降低，而对Ccl2表达水平无显著影响；结果表明，IL-1β，IL-6和TNF-α是GLP保护肺炎损伤的敏感指标。
实施例7新冠病毒特异受体表达检测
如图6所示，与对照组相比，模型组小鼠肺脏组织中新冠病毒特异受体Neuropilin-1(NRP1)显著升高，GLP给药后能够显著降低其表达水平。同时， GLP还能降低cleaved-caspase-3和P62表达水平，升高Bcl2/Bax和LC3II/LC3I 的表达水平。结果表明，GLP能够抑制新冠病毒特异性受体NRP1的表达，调节细胞凋亡和自噬。
各组数据均用means±SD表示，各组间比较用Graphpad Prism 5.0进行方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA),Tukey法进行两两比较。P< 0.05认为具有统计学意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人名称 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 灵芝孢子粉多糖在防治急性肺损伤中的应用
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