一种莲子芯的微型提取方法
阅读说明：本技术 一种莲子芯的微型提取方法 (Miniature extraction method of lotus plumule ) 是由 曹君 石敏珍 朱思晨 余亚玲 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然药物中生物碱的提取制备领域,针对提取生物碱耗时、费溶剂的问题,提供一种莲子芯的微型提取方法,包括以下步骤：将粉碎后的莲子芯样品和分散剂混合,研磨形成均匀的混合粉末,将混合粉末转移至固相萃取柱中利用溶剂进行洗脱,收集洗脱溶液并离心,取上层清液进行高效液相分析。本发明将基质固相分散微萃取与高效液相色谱巧妙结合起来,能快速有效的富集天然药物中的生物碱。(The invention relates to the field of extraction and preparation of alkaloids in natural medicines, and provides a micro extraction method of lotus plumule aiming at the problems of time consumption and solvent consumption in alkaloid extraction, which comprises the following steps: mixing the crushed lotus plumule sample with a dispersing agent, grinding to form uniform mixed powder, transferring the mixed powder to a solid phase extraction column, eluting by using a solvent, collecting an elution solution, centrifuging, and taking supernatant for high performance liquid analysis. The invention skillfully combines matrix solid phase dispersion micro-extraction and high performance liquid chromatography, and can quickly and effectively enrich alkaloid in natural medicines.)
技术领域
本发明涉及天然药物中生物碱的提取制备领域，尤其是涉及一种莲子芯的微型提取方法。
背景技术
基质固相分散(MSPD)萃取是由Baker等人首次提出的一种高效的样品前处理方法。MSPD的基本原理是将样品和分散剂放在一起，研磨成均匀的混合物，便于样品粉末附着在分散剂上，然后将混合物引入固相萃取管，用不同的洗脱溶剂从分散剂中洗脱出目标化合物。在MSPD过程中，样品的提取和清洁一步完成，明显减少了时间消耗。随着该方法的发展，逐渐被应用于农药残留、重金属和生物活性化合物的提取和分析。此外，近年来MSPD微萃取因其成本低、环保等优点而受到广泛关注。目前常用的分散剂有C18、C8、弗罗里、氧化铝、硅胶等。基于不同分散剂，MSPD法呈现出不同的萃取效率，因此寻找新的分散剂来提高萃取的选择性和提取效率是非常有价值的，特别是对基质固相分散微萃取而言。
氮化硼(BN)纳米片是一种重要的无机化合物，由数量相等的硼和氮组成，它们交替排列，呈现出无限延伸的六边形蜂窝结构。氮化硼层与层之间在范德华力的作用下堆叠，其结构类似于石墨烯。因此，氮化硼具有高比表面积、优异的润滑性、良好的导热性、显著的热化学稳定性和超强的机械性能。由于上述特性，六方氮化硼在电子器件、光存储、储氢、光催化等领域得到了广泛的应用。此外，氮化硼还被广泛用于油脂、重金属、蛋白质、染料和植物生长调节剂的吸附。然而，从以往的研究中可以发现，氮化硼纳米片尚未作为分散剂应用于基质固相分散微萃取。
莲子芯为睡莲科植物莲种子的绿色幼叶及胚根，具有治疗心律失常、神经紊乱、高血压和心血管疾病的作用。如今，莲子芯已被广泛应用于人们的日常生活中，尤其是在亚洲，莲子芯被用作菜肴、茶和药物。莲子芯的药理特性与其含有的黄酮类、生物碱、挥发油等活性物质密切相关。莲子中含有莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱等生物碱，具有较高的生物活性和保健功能。特别是甲基莲心碱，它有利于抗氧化，抗血栓，抗高血压。在以往的研究中，生物碱的提取方法主要有微波辅助提取、回流提取、超声波回流提取(药典法)等。例如公开号为CN103893296B的专利公开了一种微波辅助提取松潘乌头生物碱的方法，该方法包括以下步骤：(1)在粉碎至20～30目的松潘乌头药材中加入氨试剂，将其润湿之后置于微波提取设备中放置2～4h；然后加入乙醇，搅拌均匀，并经微波提取得到提取液；(2)所述提取液进行抽滤，得到滤液A；该滤液A经减压浓缩至无乙醇，即得松潘乌头生物碱浸膏；(3)在生物碱浸膏中加入酸性溶液调至pH值为2～4，过滤除去不溶物，得到滤液B；该滤液B用氨试剂调pH值至10～12后，再用乙醚-氯仿溶液萃取，合并萃取液；萃取液经减压浓缩至干膏状，即得纯化的松潘乌头生物碱产品。该发明快速、高效，但是消耗大量的时间和洗脱溶剂，需要大量的样品。据此需要一种理想的解决方法。
发明内容
本发明为了克服提取生物碱耗时、费溶剂的问题，提供一种莲子芯的微型提取方法，将基质固相分散微萃取与高效液相色谱巧妙结合起来，能快速有效的富集天然药物中的生物碱。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种莲子芯的微型提取方法，包括以下步骤：将粉碎后的莲子芯样品和分散剂混合，研磨形成均匀的混合粉末，将混合粉末转移至固相萃取柱中利用溶剂进行洗脱，收集洗脱溶液并离心，取上层清液进行高效液相分析。该方法与传统的生物碱提取方法，如回流提取、微波辅助提取、回流提取、超声波回流等相比，极大的缩短了样品处理时间和样品用量，同时还保持了高的提取效率，对于珍贵或者生物碱含量较低的样品该方法具有较大的实用价值。
作为优选，所述分散剂选自氮化硼、硅胶、壳聚糖、C18和弗罗里。作为进一步优选，所述分散剂为氮化硼纳米片，莲子芯样品和氮化硼纳米片的质量比为4:(1-5)。作为更进一步优选，莲子芯样品和氮化硼纳米片的质量比为1:1。本发明首次采用氮化硼纳米片作为基质固相分散剂用于富集技术，并且应用在天然药物中生物碱提取富集领域。
作为优选，所述研磨在玛瑙研钵中进行，研磨时间为30-150s。作为进一步优选，所述研磨时间为120s。
作为优选，所述洗脱的溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇、丙酮和三氯甲烷。作为进一步优选，所述洗脱的溶剂为甲醇，甲醇用量只需200μL，大大减少了有机溶剂的消耗，遵循了绿色环保的原则。
本发明提供了一种高效的、简便的氮化硼纳米片辅助的基质固相分散萃取方法，来富集提取天然药物中的生物碱。通过单因素实验对影响萃取效率的分散剂的种类、分散剂的用量、研磨时间和洗脱溶剂种类等一系列参数进行了系统的讨论和优化。在最佳条件下进行了线性、日内和日间精密度(RSD％)、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、重复性和回收率等验证实验。该发明已成功应用于莲子芯中生物碱(莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱)的定性定量分析，还可用于多种药材中生物碱的检测，在天然药材中提取生物碱的微量分析中具有广泛的应用潜力。
附图说明
图1为基质固相分散萃取工艺流程图。
图2为氮化硼纳米片分散剂的扫描电镜图。
图3为氮化硼纳米片分散剂的透射电镜图。
图4为考察不同分散剂的富集效果柱状图，图中，a、b、c、d、e分别代表分散剂的种类，分别为：a-硅胶；b-弗洛里；c-壳聚糖；d-XB-C18，e-氮化硼纳米片。
图5为考察不同量的氮化硼纳米片富集效果的折线图，图中，12.5mg、25mg、37.5mg、50mg、62.5mg分别代表不同分散剂量时三种目标化合物的峰面积。
图6为考察不同研磨时间的富集效果折线图，图中，30s、60s、90s、120s、150s分别代表不同研磨时间时三种目标化合物的峰面积。
图7为考察不同洗脱液种类的富集效果柱状图，图中，1、2、3、4分别代表洗脱溶剂的类型，分别为：1-乙腈；2-三氯甲烷；3-丙酮；4-乙醇；5-甲醇。
图8为氮化硼纳米片分散剂与目标化合物的相互作用示意图。
图9中A为三种目标化合物的混标色谱图，B为运用富集方法提取的样品色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一、实施例
总实施例
样品制备和富集：首先将莲子芯样品在50℃的烤箱中烘干，然后用粉碎机碾成粉，用60目筛子过筛。其次，取0.05g样品粉末和0.0125-0.0625g的分散剂放入玛瑙研钵中，用杵研磨，得到均匀的混合物。然后将混合物转移到底部有筛板的1mL固相萃取柱中，将另一个筛板放在上面，用柱塞轻轻压实。接着将固相萃取柱固定在真空泵支管上。最后用洗脱溶剂(200μL)对混合物进行洗脱。取富集提取液于1mL离心管中，13000rpm离心5min，HPLC检测上清液。基质固相分散萃取工艺流程如图1所示。
加标样品制备和富集：与上述步骤的区别在于做HPLC时，取上层清液加入莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱标样，涡旋混合均匀，取上层清液至进样小瓶，再进行高效液相分析。
图9中A为三种目标化合物的混标色谱图，B为运用富集方法提取的样品色谱图。
1、实施例1-5(考察吸附剂种类对富集效果的影响)
1.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg分散剂，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨2分钟形成混合均匀的粉末；取5个干净1mL固相萃取柱，编号1、2、3、4、5，分别对应实施例1-5，对应分散剂分别为：硅胶、弗洛里、壳聚糖、XB-C18、氮化硼纳米片(BNNSs)；5个固相萃取柱上下筛板压实；
1.2使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
1.3用离心管收集洗脱溶液；
1.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
1.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
1.6实验重复三次，数据取平均值；
HPLC色谱条件为：
检测波长：280nm；柱温：30℃；色谱柱：Extend-C18，5μm，150mm×4.6mm；流动相为乙腈(B)和0.06％的氨水(A)，洗脱梯度为：0～3min，20～45％B；3-5min，B 45-80％；5～10min，B的比例保持在80％；流速为0.8mL/min，进样量为2μL；
分散剂在MSPD萃取过程中起着非常重要的作用，它不仅可以作为样品粉末的固体载体，还可以分散和吸附目标化合物。因此，了解吸附剂的性质，选择最佳的吸附剂来提高萃取效率是非常重要的。本研究对BNNSs、硅胶、弗洛里、壳聚糖和XB-C18等分散剂进行了研究，结果如图4所示。从柱状图可以看出，使用BNNSs作为分散剂的目标化合物的峰面积远远高于其他分散剂，大约是硅胶的三倍。产生这种现象的原因可能是BNNSs由无数个周期性重复排列的六原子环组成，同时所有的目标化合物都具有苯环，因此在吸附剂和目标化合物之间存在π-π共轭键，提高了BNNSs的吸附能力。此外，硼原子中存在一个空轨道，可以看起来像路易斯酸，而目标组分可以提供-OH基团作为路易斯碱，因此可能存在配位键，从而进一步增强了分散剂与目标分析物之间的作用力。这一结果也可能归因于BNNSs的高比表面积和疏水特性，这使得BNNSs通过范德华力有效地保留了目标化合物。这些力的作用机理如图8所示。BNNSs的扫描电镜图和透射电镜图如图2、3所示。相比之下，使用硅胶的目标化合物的峰面积明显低于其他吸附剂。这可能是由于硅胶孔隙率大，残留了大量的目标化合物，使得分析物难以用提取液洗脱。综上所述，分散剂最优选择为BNNSs。
2、实施例6-10(考察吸附剂量对富集效果的影响)
2.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和一定量的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨2分钟形成混合均匀的粉末；取5个干净1mL固相萃取柱，编号1、2、3、4、5，分别对应实施例6-10，对应BNNSs的用量分别为：12.5mg、25mg、37.5mg、50mg、62.5mg；5个固相萃取柱上下筛板压实；
2.2使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
2.3用离心管收集洗脱溶液；
2.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
2.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
2.6实验重复三次，数据取平均值；
HPLC色谱条件为：
检测波长：280nm；柱温：30℃；色谱柱：Extend-C18,5μm,150mm×4.6mm；流动相为乙腈(B)和0.06％的氨水(A)，洗脱梯度为:0～3min,20～45％B；3-5min,B 45-80％；5～10min,B的比例保持在80％；流速为0.8mL/min，进样量为2μL；
分散剂与样品的配比是MSPD萃取过程中的另一个关键参数。适量的分散剂可以提高萃取效率，帮助目标化合物成功洗脱。为了获得最佳的萃取效果，研究了分散剂用量在12.5～62.5mg之间的提取效果，在此过程中样品粉的用量保持在50mg不变。检测结果如图5所示。折线图比较了使用不同分散剂量的目标分析物的峰面积。随着分散剂用量从12.5mg增加到37.5mg，目标化合物的峰面积稳定增长。同时，当分散剂添加到50mg时，化合物的萃取效率显著提高，峰面积最大。这种现象可能是由于分散剂用量的增加，接触面积显著增加，分析物与吸附剂之间的吸收力随之增加。当分散剂用量从50mg增加到62.5mg时，目标化合物的峰面积呈下降趋势。原因可能是被测物与吸附剂之间的吸附力太强，导致目标物无法被成功洗脱。另外，由于分散剂与样品配比过高，大量样品残留在吸附剂的孔隙中。因此，选择50mg BNNSs为最佳用量。
3、实施例11-15(考察研磨时间对富集效果的影响)
3.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨形成混合均匀的粉末；取5个干净1mL固相萃取柱，编号1、2、3、4、5，分别对应实施例11-15，对应混合物的研磨时间分别为：30s、60s、90s、120s、150s；5个固相萃取柱上下筛板压实；
3.2.使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
3.3用离心管收集洗脱溶液；
3.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
3.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
3.6实验重复三次，数据取平均值；
HPLC色谱条件为：
检测波长：280nm；柱温：30℃；色谱柱：Extend-C18,5μm,150mm×4.6mm；流动相为乙腈(B)和0.06％的氨水(A)，洗脱梯度为:0～3min,20～45％B；3-5min,B 45-80％；5～10min,B的比例保持在80％；流速为0.8mL/min，进样量为2μL；
研磨时间是影响试样样品粉末与吸附剂接触力和分散程度的关键优化参数。在其他萃取参数不变的情况下，研究了不同研磨时间在30～150s范围内的最佳萃取效率。从图6可以看出，当研磨时间从30秒增加到90秒时，目标化合物的峰面积稳步增加。当时间延长到120s时，被测物的峰面积显著增加，提取效率最高。原因可能是：样品和分散剂的混合不够充分，使得它们之间的作用力很弱，当研磨时间过短时，无法充分提取目标化合物。因此，需要足够的研磨时间才能获得较好的萃取效率。但是折线图也显示，当时间从120秒增加到150秒时，目标化合物的峰面积急剧下降。这可能是由于分散剂和样品之间的作用力太大，随着时间的延长，被测物不能被成功地洗脱。因此，120s被认为是最佳磨削时间。
4、实施例16-20(考察洗脱溶剂的种类对富集效果的影响)
4.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨120s形成混合均匀的粉末；取5个干净1mL固相萃取柱，编号1、2、3、4、5，分别对应实施例16-20，对应洗脱溶剂种类分别为：乙腈、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇；5个固相萃取柱上下筛板压实；
4.2.使用200μL的洗脱溶剂淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
4.3用离心管收集洗脱溶液；
4.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
4.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
4.6实验重复三次，数据取平均值；
HPLC色谱条件为：
检测波长：280nm；柱温：30℃；色谱柱：Extend-C18,5μm,150mm×4.6mm；流动相为乙腈(B)和0.06％的氨水(A)，洗脱梯度为:0～3min,20～45％B；3-5min,B 45-80％；5～10min,B的比例保持在80％；流速为0.8mL/min，进样量为2μL；
在提取过程中，需要合适的洗脱溶剂在洗脱目标化合物的同时确保基质留在固相萃取柱中，以获得更高的被测物的提取率。本实验采用甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、三氯甲烷等6种洗脱溶剂，其他条件保持不变来探究洗脱溶剂对富集的影响。结果如图7所示，可以看出用甲醇洗脱的目标化合物的峰面积比用其他洗脱溶剂洗脱的最高。这一现象与洗脱液和被测物的极性有关，在一定程度上决定了洗脱的程度。根据相似相溶原理，目标物的极性与甲醇的极性相近，有利于溶解。此外，被测化合物和甲醇都含有-OH基团，导致它们之间存在氢键，增加了相互作用，从而提高了目标化合物的洗脱效率。相比之下，乙腈、丙酮和三氯甲烷的萃取效率远远低于甲醇和乙醇。原因可能是它们之间的作用力太弱，无法与被测物形成氢键，导致洗脱量不足，萃取效率较低。因此以甲醇为最佳洗脱溶剂。
二、方法学考察
为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、隔天精密度、重复性以及加样回收率。
1、日内精密度
1.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨120s形成混合均匀的粉末；取1个1mL固相萃取柱,将混合粉末装入其中，上下筛板压实；
1.2使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
1.3用离心管收集洗脱溶液；
1.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
1.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
1.6进样分析，在同一天内不同的时间段进样6次。
2、日间精密度
2.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨120s形成混合均匀的粉末；取1个1mL固相萃取柱,将混合粉末装入其中，上下筛板压实；
2.2使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
2.3用离心管收集洗脱溶液；
2.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
2.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果；
2.6进样分析，在三天内相同的时间点进样，每天进2次。
3、重复性
参照下列实验步骤，平行做3组，作为考察
3.1准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨120s形成混合均匀的粉末；取1个1mL固相萃取柱,将混合粉末装入其中，上下筛板压实；
3.2使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
3.3用离心管收集洗脱溶液；
3.4将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
3.5取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果。
4、加样回收率
参照下列实验步骤，每个浓度平行做3组
4.1将莲子芯样品进行碾碎，准确称量50mg莲子芯样品粉末和50mg的BNNSs，将二者至于玛瑙研钵中混合研磨120s形成混合均匀的粉末；
4.2按照步骤1再制取一份；
4.3取2个干净1mL固相萃取柱，编号1、2，将制得的混合粉末装入其中，2个固相萃取柱上下筛板压实；
4.4使用200μL的甲醇淋洗固相萃取柱，对目标化合物进行洗脱；
4.5用离心管收集洗脱溶液；
4.6往两个离心管中分别加入浓度为1μg/mL和10μg/mL的混合标样；涡旋，使样品溶液和混标充分混匀；
4.7将离心管置于离心机，13000rpm下离心5min；
4.8取上层清液装入进样小瓶，用HPLC分析结果。
实验结果汇总如下表1和表2，结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确。
表1.
表2.
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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