一种化合物在制备抗黄曲霉毒素b1毒性的药物中的应用
阅读说明：本技术 一种化合物在制备抗黄曲霉毒素b1毒性的药物中的应用 (Application of compound in preparation of anti-aflatoxin B1 toxicity medicine ) 是由 王旭 胡嗣祎 赵书红 谢胜松 黄玲利 彭大鹏 郝海红 程古月 李新云 张金福 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了结构式如下式(Ⅰ)所示的化合物在制备抗黄曲霉毒素B1毒性的药物中的应用。所述化合物自身对细胞的生长不会产生影响,但是能降低黄曲霉毒素B1对细胞产生的毒性,提高细胞的存活率,降低黄曲霉毒素B1导致的细胞氧自由基水平和脂质过氧化产物丙二醛水平的提升,从而抵抗黄曲霉毒素B1的细胞毒性。(The invention discloses application of a compound with a structural formula shown as the following formula (I) in preparation of a drug for resisting the toxicity of aflatoxin B1. The compound does not influence the growth of cells, but can reduce the toxicity of the aflatoxin B1 to the cells, improve the survival rate of the cells, and reduce the promotion of the oxygen free radical level of the cells and the malondialdehyde level of a lipid peroxidation product caused by the aflatoxin B1, thereby resisting the cytotoxicity of the aflatoxin B1.)
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种化合物在制备抗黄曲霉毒素B1毒性的药物中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的真菌毒素，是一种广泛存在的真菌毒素，它有多种衍生物，其中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的毒性、致癌性最强。黄曲霉毒素主要存在于大豆、玉米、花生等粮油产品，在坚果和中药材中也有发现。黄曲霉毒素在我国主要粮食作物中均有污染的情况，对于花生玉米大豆粮油作物污染较严重，在动物饲料中尤为严重，动物饲料所用的植物性原料容易因为存储堆积不当操作造成霉变，容易导致黄曲霉毒素产生。AFB1的毒性作用极强，具有遗传毒性以及导致肝细胞癌的能力，AFB1与乙型肝炎病毒(HBV)具有协同作用，能够增加肝癌发生的风险并加速肝癌的发展。除此之外AFB1也可以促进包括HCV、酒精导致的肝硬化疾病发展为肝癌。除了遗传毒性与致癌作用外，AFB1还可能造成营养不良、生长迟缓和免疫功能下降，严重影响着人类的身体健康状况。
黄曲霉毒素B1当前的防控主要依靠控制黄曲霉毒素的来源来进行，比如通过改良种植技术、改良储存方法防止AFB1的产生，通过物理、化学、生物方式降解AFB1。此外，对于摄入黄曲霉毒素后的治疗也有一定的进展，如一些已知药物或化合物能抵抗AFB1毒性作用，但是无特效治疗药物，因此研究并开发新型的针对AFB1毒性作用的治疗药物对于养殖业及人畜健康极为重要。
申请人使用计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)，通过分子模拟对接筛选，发现一种已知的人工合成小分子化合物具有抗黄曲霉毒素B1毒性的作用，目前尚未有相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于一种化合物在制备抗黄曲霉毒素B1毒性的药物中的应用，旨在为临床提供一种潜在的治疗AFB1中毒的药物。
本发明中的化合物其结构式如下式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，R1代表氧原子或烷氧基；R2代表H、烷基、苯烷基、苯、烷氧基取代的苯。
进一步地，所述化合物的结构式如式(Ⅱ)-(Ⅴ)所示：
最佳的，所述化合物的结构式如式(Ⅱ)所示，该化合物的名称为1-(1,3-苯并二恶醇-5-酰氧基)-3-[4-(2-甲氧基苯基)-1-哌嗪基]-2-丙醇；英文名(1-(1，3-benzodioxol-5-yloxy)-3-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-2-propanol)；CAS号：380192-64-3。
本发明在多种细胞上验证了上述化合物的功能，结果表明：
化合物对正常细胞(猪肾细胞)没有显著的毒性作用，也不会影响细胞的生长，但是能降低黄曲霉毒素B1对正常细胞产生的毒性，提高细胞的存活率，降低黄曲霉毒素B1导致的细胞氧自由基水平和脂质过氧化产物丙二醛水平的提升，从而抵抗黄曲霉毒素B1的细胞毒性。
附图说明
图1：化合物M2处理PK-15细胞后对细胞活性的影响。
图2：化合物M2对AFB1细胞毒性的抵制能力。
图3：化合物M2对AFB1致死PK-15细胞IC50值的影响。
图4：化合物M2对AFB1导致的PK-15细胞氧自由基ROS水平上升的影响。
图5：化合物M2对AFB1导致的PK-15细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平上升的影响。图中，**P<0.05。
图6：8种化合物抵抗AFB1对人肝癌细胞系Huh7毒性的作用。图中，****P<0.001；***P<0.01。
图7：芝麻酚对AFB1细胞毒性的抵制能力。图中，***P<0.01。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
试验材料：
1.化合物
试验中共使用了8种化合物，申请人将其命名为M1-8，这些化合物均为已知化合物，可通过合成或商业途径获得。本实验购自SPECS公司。
芝麻酚购自阿拉丁。
2.细胞
猪肾细胞系(Pig Kidney 15，PK-15)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，并由本实验室保存使用。
人肝癌细胞系(Huh-7)来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心。
3.试剂
Aflatoxin B1：购自Sigama。
DMEM培养基：Gibico。
胎牛血清：德国PAN。
CCK-8试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。
ROS试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司。
实施例1：M2对PK-15细胞的毒性作用
1.野生型PK-15细胞的培养
将对数生长期的PK-15细胞从T25的细胞培养瓶消化下来后，根据细胞密度用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基稀释至106个/mL的细胞悬浮液，将细胞混合均匀后用排枪接种到96孔板中，每个孔中加入100μL细胞悬浮液，在周围孔加入相同体积的PBS，轻轻拍打培养板的周围，使细胞分布均匀，待细胞沉淀到培养板底部后放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中；待细胞长至50％-60％，吸去培养基，用无菌PBS将细胞洗一遍，后加入无血清DMEM培养基，12h后待细胞周期同步化后吸去培养基。
2.细胞给药
M2用DMSO溶解，后用DMEM完全培养基进一步稀释成浓度为2、4、8、16、20、24、28、32μg/mL，96孔板中每孔加入100μL，每个剂量组设置6个平行孔，同时设空白组(不加细胞只加培养基)和对照组(加入与20μg/mL药物组同体积的DMSO)，在周围孔加入相同体积的PBS，放入培养箱中培养；加药后36h取出进行细胞毒性检测。
3.CCK-8检测M2的细胞毒性
将CCK-8试剂与培养基以1：10比例配好后加到各个孔中。放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养1h；酶标仪读取450nm波长的吸光值(OD450)。计算得到试验组相对于对照组的细胞存活率。细胞存活率＝(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
结果如图1所示，M2在2-32μg/mL时对于PK-15细胞的影响较小，没有明显的细胞毒性。
实施例2：M2抗AFB1毒性能力的检测
1.AFB1毒素与M2共处理细胞后的存活率曲线
(1)将PK-15细胞接种到96孔板中，每孔约105个细胞，培养24h待细胞生长至50-60％后加药处理，AFB1毒素浓度设置为每组均为2μg/mL，M2浓度设置为0.5-40μg/mL间9个浓度梯度，稀释于10％胎牛血清的DMEM培养基中。
(2)加药处理细胞，设置空白组、DMSO对照、AFB1毒素对照、M2处理组(9个浓度)，每组6个平行孔，孵育36h后CCK-8检测细胞存活情况，检测方法与实施例1相同。
得到不同浓度M2与AFB1毒素共处理细胞后的存活率曲线，如图2所示，细胞存活率随着M2浓度的增加而增加，说明M2有抵抗AFB1致死细胞的作用。
2.M2对AFB1毒素IC50值的影响
(1)将PK-15细胞接种到96孔板中，每孔约105个细胞，培养24h待细胞生长至50-60％后加药处理，设置AFB1毒素浓度梯度为0、1、2、4、6、8、12、16、20μg/mL。根据图2结果选定M2最佳浓度为24μg/mL，稀释于10％胎牛血清的DMEM培养基中。
(2)加药处理细胞，设置AFB1组、M2+AFB1组，每个浓度6个平行孔，孵育36h后CCK-8检测细胞存活情况，检测方法与实施例1相同，测定AFB1的IC5曲线，以及M2作用下AFB1的IC50曲线。
结果如图3所示，未加入M2时，AFB1毒素对PK-15细胞的半数致死浓度为1.215μg/mL；加入M2时，AFB1毒素对PK-15细胞的半数致死浓度增加到4.149μg/mL，进一步说明M2有抵抗AFB1毒性的作用。
实施例3：M2降低AFB1导致PK-15细胞氧自由基(ROS)水平的提升
1.AFB1毒素与M2处理细胞。
(1)将PK-15细胞接种到12孔板中，培养24h待细胞生长至40-50％后加药处理。AFB1毒素浓度固定为0.1μg/mL，M2浓度设置为2μg/mL，稀释于10％胎牛血清的DMEM培养基中。
(2)加药处理细胞，设置调零组、空白组、AFB1组、M2组、AFB1+M2组，每组2个平行孔，处理48h后进行荧光染色处理。
2.ROS检测试剂处理
(1)利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，发出绿色荧光。
(2)按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
(3)弃去培养基，PBS清洗2遍，使用胰酶将细胞消化，加入基础培养基充分吹散制成细胞悬液，离心得细胞沉淀，细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
3.流式细胞仪检测ROS阳性率
使用分析型流式细胞仪检测，使用FITC通道下检测绿色荧光，带有绿色荧光的细胞比例代表ROS阳性率。以对照组细胞FITC峰值处的荧光强度作为中位数作为标准线，右侧FITC-A+代表ROS阳性，下方数值代表高于中位数荧光强度的细胞比例，数值升高代表ROS阳性率的提升，表明细胞ROS水平上升。
结果如图4。AFB1组细胞FITC-A+数值由51上升至78.1，表明AFB1导致细胞ROS水平上升，细胞氧化应激水平提升，而添加M2组细胞在AFB1作用下仅由42.7上升至55.5，且与空白组阳性率相近，表明M2可以有效防止AFB1导致的细胞ROS水平上升。AFB1导致PK-15细胞活性氧(ROS)水平的上升，而M2缓解了AFB1导致的ROS水平上升。
实施例4：M2降低AFB1导致PK-15细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平的提升
1.AFB1毒素与M2处理细胞
(1)将PK-15细胞接种到6孔板中，培养24h待细胞生长至60-70％后加药处理。AFB1毒素浓度固定为2μg/mL，M2浓度设置为10μg/mL，稀释于10％胎牛血清的DMEM培养基中。
(2)加药处理细胞，设置空白组、AFB1组、M2组、AFB1+M2组，处理36h后提取细胞蛋白质。
2.提取细胞蛋白质
(1)将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，使用PBS清洗细胞两次后弃去。
(2)配制细胞裂解液，添加磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、EDTA溶液于细胞酶裂解液中，配置为细胞蛋白提取液。
(3)每孔细胞加入细胞蛋白提取液100μL，冰上放置10min后吹打下细胞移入1.5mLEP管中，冰上裂解40min，随后使用离心机4℃12000g/min离心10min使细胞碎片沉淀，吸取上清即为细胞全蛋白。
(4)使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
2.检测细胞MDA水平
使用微量丙二醛(MDA)测定试剂盒检测细胞MDA水平，试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGT004-1。
以空白组细胞MDA水平作为基准，比较AFB1、M2、AFB1+M2组，发现M2能下调AFB1导致的细胞MDA水平上升，见图5。
实施例5：化合物在其它细胞(人肝癌细胞系)上抗AFB1的表现
将Huh7细胞6孔板中，每孔约105个细胞，培养24h待细胞生长至50-60％后加药处理，AFB1毒素浓度设置为每组均为4μg/mL，M1-8等8种化合物浓度均为10μg/mL。
加药处理细胞，设置空白组、AFB1毒素对照、化合物处理组，每组6个平行孔，孵育36h后CCK-8检测细胞存活情况。
得到8种化合物抵抗AFB1致死Huh7细胞作用的能力，如图6所示，M2、M4、M5、M6四种化合物对AFB1毒素的细胞毒性具有较强的抵抗作用。这四个化合物都具有1，3-苯并二恶茂、哌嗪、丙醇基团，说明这三个基团是化合物的官能团，对化合物的功能产生重要作用。
实施例6：芝麻酚在PK-15细胞上抵抗AFB1的表现
已有文献报道芝麻酚(3,4-亚甲二氧基苯酚)具有抗氧化的能力，我们推测其可能具有抵抗AFB1细胞毒性的能力，因此我们还对芝麻酚的功能进行了检测，试验方法如下：
将PK-15细胞接种到96孔板中，每孔约105个细胞，培养24h待细胞生长至50-60％后加药处理，AFB1毒素浓度设置为每组均为2μg/mL，芝麻酚浓度设置为32-1024μg/mL间6个浓度梯度，稀释于10％胎牛血清的DMEM培养基中。
加药处理细胞，设置空白组、AFB1毒素对照、AFB1毒素加芝麻酚(6个浓度)处理组，每组6个平行孔，孵育36h后检测细胞存活情况。
结果如图7所示，芝麻酚浓度在512μg/mL时PK-15细胞的存活率才达到80％，而本发明化合物在浓度为20-30μg/mL时PK-15细胞的存活率接近100％，说明本发明化合物的活性远高于芝麻酚。
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