一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒
阅读说明：本技术 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒 (Primer, probe and kit for quantitatively detecting BCR-ABL1 fusion gene ) 是由 蒋析文 朱小亚 王丽芳 魏如涛 杨美华 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种定量检测BCR-ABL1融合基因的引物、探针及其试剂盒。具体地,本发明利用实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR),设计BCR-ABL1融合基因主要型(P210)和次要型(P190)特异性引物和探针,靶向扩增目的基因,实现对2种融合基因快速、特异检测。本发明试剂盒中有含BCR-ABL1融合基因主要型(P210)或次要型(P190)融合位点的人工合成大片段作为定量参考品,可对各个治疗阶段下患者体内融合基因进行定量检测。(The invention provides a primer, a probe and a kit for quantitatively detecting a BCR-ABL1 fusion gene. Specifically, the invention designs specific primers and probes of a main type (P210) and a minor type (P190) of the BCR-ABL1 fusion gene by using a real-time fluorescent quantitative PCR (RQ-PCR) technology, and the target gene is amplified in a targeted manner, so that the 2 fusion genes can be rapidly and specifically detected. The kit of the invention contains the artificially synthesized large fragment containing the fusion site of the major type (P210) or the minor type (P190) of the BCR-ABL1 fusion gene as a quantitative reference substance, and can carry out quantitative detection on the fusion gene in a patient body at each treatment stage.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种定量检测BCR-ABL1融合基因的引物、探针及其试剂盒。
背景技术
白血病，也称作血癌，是造血干细胞的恶性克隆性疾病。白血病细胞在骨髓产生，再散布到血液及全身。根据国外统计，白血病约占肿瘤总发病率的3％左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。对我国的白血病发病情况调查结果显示：白血病的年发病率为2.76/10万，在所有白血病中，急性髓系白血病发病率最高(1.62/10万)，急性淋巴细胞白血病次之(0.69/10万)，慢性髓系白血病第三(0.36/10万)。在急性髓系白血病各亚型之中，M2a型、M3型、M5型发病率较高，分别为25.2％、18.7％、23.2％。
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是首个被识别的与特定染色体或基因相关的肿瘤性疾病，其标志性特征为费城染色体(Ph染色体)，即t(9；22)(q34；q11)，致病基础为位于9q34上c-ABL1易位至22q11上的BCR基因3’端，形成BCR-ABL1融合基因。该融合基因存在于95％以上的慢性粒细胞白血病、25％-30％的成人和2％-5％的儿童急性白血病(ALL)，以及少数AML骨髓增生异常综合征(MDS)等血液系统肿瘤患者中。BCR-ABL1融合基因是一种抗细胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，可激活多种信号传导途径使细胞过度增殖进而导致细胞调控发生紊乱。
因断裂点不同，BCR基因与ABL1基因产生3种不同BCR-ABL1融合基因的异构体，分别为主要型(major bcr，M-bcr)即e13a2或e14a2，编码P210胞浆蛋白，见于90％以上的CML患者和部分Ph染色体阳性的ALL患者(Ph+-ALL)中；次要型(minor bcr，m-bcr)即e1a2编码P190融合蛋白，绝大部分Ph+ALL患者为该型别；微小型(μ-bcr)即e6a2，e8a2或e19a2等，编码P190融合蛋白，见于2-3％的CML患者。其中，主要型与次要型占95％以上。临床上可通过定期监测患者的BCR-ABL1融合基因转录水平来评估酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效及微小残留情况，TKI治疗中3、6、12个月以及之后的任意时间点的分子学反应已被列入国内外CML及Ph+ALL诊疗推荐或指南。
目前BCR-ABL1融合基因常用的检测包括荧光原位杂交技术(FISH)、免疫分型、实时定量PCR技术(RQ-PCR)和数字PCR等检测方法。
(1)荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization)，简称FISH，通过荧光素标记的特异性核酸探针，与样本细胞核内的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异性探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。荧光原位杂交探针类型多种，适用样本来源广泛。FISH计数只需分析间期细胞，不受是否分裂的影响，特异性和重复性好，但由于FISH检测的实验操作复杂，对于染色体异位隐蔽的位点较难检出、易出现假阴性的结果，其次，FISH检测灵敏度低，对于微小残留病的定量追踪不够，使其在临床的应用受到很大限制。
(2)免疫分型，是细胞生长发育过程中，处于不同阶段的细胞根据其表面不同标记检测相应的白细胞表面或细胞浆内的抗原，快速将细胞分类，是诊断白血病的重要指标之一。目前国际公认的方法是流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)。FCM利用荧光素标记的单克隆抗体(McAb)作为分子探针，多参数分析白血病细胞的胞膜和胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被检测白血病细胞所属细胞学系及分化程度。应用FCM技术能够快速，多参数，客观的测定白血病细胞膜、细胞浆、细胞核的抗原表达，方法简便、快捷且重复性良好，但目前为止尚未发现检测白血病细胞的特异性抗原，加上试剂和仪器的特殊要求，此项检测很难推广。
(3)数字PCR(dPCR)，是一种核酸分子的绝对定量技术。其技术原理为在传统的PCR扩增前对样品进行分割，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微反应，其中每个微反应或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对微反应进行检测，有荧光信号的微反应判读为1，没有荧光信号的微反应判读为0，根据泊松分布原理及阳性微反应的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与qPCR相比，数字PCR无需标准曲线，可对低拷贝待检靶分子进行绝对定量。但数字PCR系统成本高，通量有限、操作繁琐，缺乏实际的临床验证数据，因此该技术目前在常规基因表达分析中不具备优势。
(4)实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)，基于TaqMan探针荧光定量PCR，TaqMan探针5’端标记一个荧光分子(即报告基团)，3’端标记一个荧光淬灭分子(即淬灭基团)。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，由于Taq酶具有5’→3’外切酶活性，将探针水解，使报告基团和淬灭基团间距增大，从而荧光监视系统能够检测到荧光信号。随着循环次数增加，被扩增的目的基因片段与荧光信号强度呈线性关系，通过Ct值即可得出待测样本目的基因的拷贝数。实时荧光定量PCR技术操作简单、用时短、通量好，仪器设备在市场上得以广泛使用，应用于科研和临床研究。
慢性髓性白血病中国诊断与治疗指南(2020年版)、中国慢性髓性白血病诊疗监测规范(2014年版)、成人急性淋巴细胞白血病诊疗规范(2018年版)及NCCN慢性髓细胞白血病临床实践指南(2020)指出检测BCR-ABL1融合基因是诊断CML的最特异最敏感生物方法之一，临床上可通过定期监测患者的BCR-ABL1融合基因转录水平来评估酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效及微小残留情况，从而更好的指导患者分子靶向治疗和预后判断。综上，现阶段需要一种灵敏度高，特异性好，同时能快速可靠地检测BCR-ABL1融合基因的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测慢性髓系白血病(Chronic MyelogenousLeukemia，CML)或急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)中BCR-ABL1融合基因主要型(P210)和次要型(P190)的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测BCR-BAL1融合基因的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物，和如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:3所示的正向引物；和，如SEQID NO.:4所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.:5所示的正向引物；和，如SEQID NO.:6所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种检测BCR-BAL1融合基因的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.7所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.8所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.9所示的第三探针。
在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第三探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第三探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团、所述第二探针标记的荧光报告基团、和所述第三探针标记的荧光报告基团相同。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测BCR-BAL1融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO.:2、和SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:8所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、逆转录酶、和dNTP。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的BCR-ABL1 P210型阳性定量参考品，所述BCR-ABL1 P210型阳性定量参考品为含有BCR-ABL1 P210型目的片段的质粒；优选地，所述BCR-ABL1 P210型阳性定量参考品的浓度梯度为2×106copies/ml、2×105copies/ml、2×104copies/ml、和2×103copies/ml。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的BCR-ABL1 P190型阳性定量参考品，所述BCR-ABL1 P190型阳性定量参考品为含有BCR-ABL1 P190型目的片段的质粒；优选地，所述BCR-ABL1 P190型阳性定量参考品的浓度梯度为2×106copies/ml、2×105copies/ml、2×104copies/ml、和2×103copies/ml。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的ABL1阳性定量参考品，所述ABL1阳性定量参考品为含有ABL1目的片段的质粒；优选地，所述ABL1阳性定量参考品的浓度梯度为2×106copies/ml、2×105copies/ml、2×104copies/ml、和2×103copies/ml。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的阳性质控品和阴性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种检测BCR-BAL1融合基因的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：
所述PCR反应体系包括BCR-ABL1主要型反应管体系、BCR-ABL1次要型反应管体系和ABL1反应管体系；
其中，所述PBCR-ABL1主要型反应管体系包括步骤(1)制备的核酸样本、所述第一引物探针混合液；所述BCR-ABL1次要型反应管体系包括步骤(1)制备的核酸样本、所述第二引物探针混合液；所述ABL1反应管体系包括步骤(1)制备的核酸样本、所述第三引物探针混合液。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法，例如针对实验室培养的肿瘤细胞细胞株进行检测分析，以供新药研发使用。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测BCR-ABL1融合基因。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1阴性质控品检测上机图。
图2BCR-ABL1强阳性质控品检测结果。
图3BCR-ABL1临界阳性质控品检测结果。
图4BCR-ABL1主要型定量参考品检测结果。
图5BCR-ABL1次要型定量参考品检测结果。
图6ABL1定量参考品检测结果。
图7BCR-ABL1主要型(P210)临床样本。
图8BCR-ABL1次要型(P190)临床样本。
图9显示了P210对照体系1的标准曲线。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，利用实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)，设计BCR-ABL1融合基因主要型(P210)和次要型(P190)特异性引物和探针，靶向扩增目的基因，实现对2种融合基因快速、特异检测。本发明试剂盒中有含BCR-ABL1融合基因主要型(P210)或次要型(P190)融合位点的人工合成大片段作为定量参考品，可对各个治疗阶段下患者体内融合基因进行定量检测。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种定量检测慢性髓系白血病(CML)或急性淋巴细胞白血病(ALL)中BCR-ABL1融合基因主要型(P210)或次要型(P190)融合基因的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种定量检测慢性髓系白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)或急性淋巴细胞白血病(Acute LymphoblasticLeukemia，ALL)中BCR-ABL1融合基因主要型(P210)或次要型(P190)融合基因mRNA的表达水平的的方法、引物、探针：
所述检测P210的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测P210的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述检测P190的的上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测P190的的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述检测ABL1内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测ABL1内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述探针检测P210的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述探针检测P190的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述ABL1内控基因的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步地，所述探针SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1。
优选地，所述BCR-ABL1融合基因P210和P190上游引物在反应体系中的终浓度为0.16pmol/μL，所述BCR-ABL1融合基因P210和P190下游引物在反应体系中的终浓度为0.16pmol/μL，所述BCR-ABL1融合基因P210和P190探针在反应体系中的终浓度为0.1pmol/μL；所述内控上游引物在反应体系中的终浓度为0.16pmol/μL，所述内控下游引物在反应体系中的终浓度为0.16pmol/μL，所述内控探针在反应体系中的终浓度为0.1pmol/μL；
所述BCR-BAL1融合基因和内控基因的引物探针序列如下表1：
表1引物探针核苷酸序列信息
上述PCR引物和探针可用于对BCR-ABL1融合基因P210和P190进行定量检测。
利用BCR-ABL1融合基因和内控ABL1基因定量参考品分别计算得出BCR-ABL1融合基因和内控ABL1基因的拷贝数，以拷贝数比值来确定BCR-BAL1融合基因转录本水平，即：BCR-ABL1-Qty/ABL1-Qty＝BCR-BAL1融合基因拷贝数(P210或P190)/ABL1内参基因拷贝数。其中，BCR-ABL1融合基因的线性范围为1.0E+03copies/mL≤BCR-ABL1-Qty≤1.0E+08copies/mL，超过该浓度范围的样本所定量的结果仅供参考。本发明结合融合基因特异性的探针使得检测体系灵敏度可以达到500copies/mL。
上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于荧光PCR(探针法)可检测BCR-ABL1融合基因的P210和P190两种融合类型，为临床上这两种类型患者疗效的定期监测和治疗方案提供参考。
本发明还公开了一种BCR-ABL1融合基因定量检测的试剂盒，所述试剂盒包括BCR-ABL1融合基因(P210和P190)、内控基因ABL1引物探针混合液、热启动Taq酶、逆转录酶、dNTP等。所述试剂盒还包括BCR-ABL1融合基因(P210和P190)、内控基因ABL1阳性定量参考品、质控品。
所述检测P210的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测P210下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述检测P190上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述检测P190下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述检测ABL1内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测ABL1内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQID NO：6所示；
所述探针包括检测P210和P190两种型别的探针和内控基因ABL1探针；所述P210的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述P190的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述内控基因ABL1的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所有探针其5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
当检测样本存在BCR-ABL1主要型融合基因或BCR-ABL1次要型融合基因时，探针与上下游引物所扩增的目的片段结合，释放FAM荧光信号；所述内控基因ABL1引物与探针是根据人ABL1基因保守片段设计并合成的，用于检测ABL1基因；
所述引物探针混合液包括如下成分，如表2：
表2 BCR-ABL1融合基因引物探针混合液组成成分
所述阳性定量参考品成分如下，如表3：
表3 BCR-ABL1融合基因阳性定量参考品组成成分
所述质控品成分如下，表4：
表4 BCR-ABL1融合基因质控品组成成分
本发明涉及的目的片段包括：
BCR-ABL1主要型目的片段1(SEQ ID NO.:10)：
CGGGATCCCGAGTTACACGTTCCTGATCTCCTCTGACTATGAGCGTGCAGAGTGGAGGGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGAAGCTTCTCCCTGACATCCGTGGAGCTGCAGATGCTGACCAACTCGTGTGTGAAACTCCAGACTGTCCACAGCATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAGATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCAGAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
BCR-ABL1次要型目的片段2(SEQ ID NO.:11)：
CGGGATCCCGGCTCCTGCGCAGCCAGAGCACCTCTGAGCAGGAGAAGCGCCTTACCTGGCCCCGCAGGTCCTACTCCCCCCGGAGTTTTGAGGATTGCGGAGGCGGCTATACCCCGGACTGCAGCTCCAATGAGAACCTCACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTCCTCTGGCCAGTCCAGCCGCGTGTCCCCAAGCCCCACCACCTACCGCATGTTCCGGGACAAAAGCCGCTCTCCCTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCGACAGCAGCAGTCCCCCCACGCCGCAGTGCCATAAGCGGCACCGGCACTGCCCGGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATCGTGGGCGTCCGCAAGACCGGGCAGATCTGGCCCAACGATGGCGAGGGCGCCTTCCATGGAGACGCAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCAGAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCCCCAAGCTTGGG
ABL1目的片段3(SEQ ID NO.:12)：
CGGGATCCGGACCGAGCTGGGAGAGGGGCTCCGGCCCGATCGTTCGCTTGGCGCAAAATGTTGGAGATCTGCCTGAAGCTGGTGGGCTGCAAATCCAAGAAGGGGCTGTCCTCGTCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCAGAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTAAGCTTGGG
本发明所述试剂盒适用样本为外周血或骨髓样本核酸。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性质控品组、阳性质控品组及定量参考品组。当阳性质控品检测结果为阳性，且阴性对照组为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可以达到500copies/mL。
本发明还公开了一种BCR-ABL1融合基因定量检测的方法，具体步骤包括：
处理待测样本并提取样本中的RNA；优选地，待测样本为外周血或骨髓样本提取后的核酸，并对样本核酸进行质量检测；
1.实时荧光定量PCR反应体系配制
取出BCR-ABL1主要型PCR反应液A、BCR-ABL1次要型PCR反应液A、ABL1PCR反应液A、BCR-ABL1 PCR反应液B，室温融化后振荡混匀，8,000rpm瞬时离心后使用。按表5-表7进行配制。
配制后将各组分充分混合，配制成相应的BCR-ABL1主要型、次要型和ABL1PCR反应管，瞬时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将30μL扩增体系分别分装到PCR管中。
表5 BCR-ABL1主要型反应管体系配制(单人份)
表6 BCR-ABL1次要型反应管体系配制(单人份)
表7 ABL1反应管体系配制(单人份)
2.实时荧光PCR仪扩增：将含有待测样本的荧光PCR反应体系短暂快速离心后，放置在荧光PCR扩增仪(ABI 7500或QuantStudio TM 5)96孔板中，对实验名称、阳性质控品、阴性质控品及定量参考品进行正确设置，对荧光通道、扩增程序进行设置。完成设置后即可进行Run，结束后对结果进行人工分析。
3.结果读取及分析：反应结束后保存检测数据文件。按对应顺序设置BCR-ABL1(P210、P190)及内控基因ABL1的4个阳性定量参考品(Task中设为Standard，Quantity中设为阳性定量参考品对应的浓度，单位为copies/mL)。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15，End值可以在5～20，在Log图谱窗口Threshold的Value值取样本最高荧光值1/20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线))，使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值(correlation数值)≥0.97。“Report”窗口记录仪器自动分析计算出的未知样本BCR-ABL1的拷贝数(BCR-ABL1-Qty)，将该结果导出。重新按对应顺序设置ABL1的4个阳性定量参考品，步骤同前，将未知标本ABL1的拷贝数(ABL1-Qty)导出。(注：Qty是Quantity的缩写，代表浓度)。
4.根据检测结果，判定待测样本是否发生BCR-ABL1融合，进而计算BCR-ABL1融合基因表达量＝BCR-ABL1融合基因拷贝数/ABL1内参基因拷贝数。
本申请采用实时荧光定量PCR检测原理如下:
实时荧光定量PCR技术基于TaqMan探针荧光定量PCR，TaqMan探针5’端标记一个荧光报告基团，3’端标记一个荧光淬灭基团。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。当PCR扩增时，由于DNA聚合Taq酶具有5’→3’方向的外切酶活性，同时还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5'-3'方向的核酸外切酶活性。将探针水解时，报告基团和淬灭基团间距增大，抑制作用解除，从而荧光监视系统能够检测到荧光信号。
基于荧光定量PCR原理，适用实时荧光PCR仪对荧光信号进行检测，依据荧光信号强度与扩增循环数之间呈正相关的线性关系。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数呈指数形式增加，随着反应循环数的增加，最终PCR扩增产物不再以指数级形式增加，从而进入平台期。PCR终产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以选择在荧光信号的指数增长期阶段进行定量分析。在进行定量分析时，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
与现技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种BCR-ABL1融合基因定量检测的方法、引物、探针与试剂盒。本试剂盒优化了特异性引物探针，针对BCR-ABL1主要型和次要型融合基因进行检测。使用本发明提供的特异性引物与探针，可定量检测慢性髓系白血病(CML)或急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中外周全血或骨髓样本中，BCR-ABL1主要型(P210)或BCR-ABL1次要型(P190)融合基因转录水平。即，BCR-ABL1融合基因拷贝数(P210或P190)/ABL1内参基因拷贝数)×100％。本发明的灵敏度可达500copies/mL。具有过程优化简单、所需样本少、性能稳定高效、高准确性等优点，数据分析自动化，结果可实时观察。本发明适用于对慢性髓系白血病(CML)或急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的BCR-ABL1融合基因主要型和次要型转录水平进行监测，临床上可通过定期监测患者的BCR-ABL1融合基因转录水平来评估酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疗效及微小残留情况，实现治疗效果的动态追踪，从而早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。且目前国内还未有同类试剂盒的上市。这是探索白血病早期诊断与高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：试剂盒及检测方法
本实施例提供了一种BCR-ABL1融合基因定量检测的试剂盒的组成成分、包装及数量(20反应/盒)，如表8。
表8.试剂盒的组成成分、包装及数量
本实施例提供使用上述试剂盒检测BCR-ABL1融合基因定量检测的方法。具体实施步骤如下：
步骤一：待测样本RNA模板提取及质量检测
1)抽取白血病患者外周血2mL置于EDTA或枸橼纳抗凝剂的采血管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。
2)使用核酸提取或纯化试剂盒(粤穗械备20170583号)进行核酸提取。
3)采用分光光度计(如NanoDrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计)对提取后核酸的浓度进行检测。浓度若低于10ng/μL，建议确认样本质量后重新提取；浓度若高于100ng/μL，建议将核酸稀释至10-100ng/μL。本试剂盒中的BCR-ABL1强阳性质控品、BCR-ABL1临界阳性质控品与阴性质控品均参与核酸提取。
步骤二：实时荧光PCR扩增反应体系配制
从试剂盒中取出BCR-ABL1 P210型PCR反应液A、BCR-ABL1 P190型PCR反应液A、ABL1 PCR反应液A、BCR-ABL1 PCR反应液B、BCR-ABL1 P210型阳性定量参考品、BCR-ABL1P190型阳性定量参考品、ABL1阳性定量参考品、BCR-ABL1强阳性质控品、BCR-ABL1临界阳性质控品和阴性质控品室温融化后振荡混匀，8,000rpm瞬时离心后使用。
1)BCR-ABL1主要型PCR反应管体系配制
表9 BCR-ABL1主要型反应管体系配制(单人份)
2)BCR-ABL1次要型反应管体系配制
表10 BCR-ABL1次要型PCR反应管体系配制(单人份)
3)ABL1 PCR反应管体系配制
表11 ABL1反应管体系配制(单人份)
将各组分充分混合，配制成相应的BCR-ABL1 P210型、P190型和ABL1 PCR反应管，瞬时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将30μL扩增体系分别分装到PCR管中。
4)加样：往上述BCR-ABL1主要型PCR反应管、BCR-ABL1次要型PCR反应管和ABL1PCR反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、提取后的质控品和对应基因型别的阳性定量参考品各加20μL，使各反应总体积为50μL。盖紧管盖，8,000rpm瞬时离心后转移至扩增检测区。
5)PCR扩增
ABI 7500仪器设置：打开软件后，选择“New Experiment”，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknown)、阳性定量参考品(Standard)，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；选择FAM荧光通道收集荧光信号。ABI 7500仪器设置：Reporter选FAM；Quencher选NONE；参比荧光Passive Reference选NONE。设置循环条件如下：反应体系体积设置为50μl。
设置完成后，保存文件，运行程序。
QuantStudioTM 5仪器设置：打开软件后，选择“Create New Experiment”，自动出现一个向导界面，在“Experiment Properties”界面根据需求的进行命名；程序设定：在导向界面选择“Method”进入程序设置界面，设置循环条件：
板式设定：选择“plate”界面将“Quick Setup”栏中参比荧光Passive Reference选None；点击“Advanced Setup”设定检测通道Targets：Reporter选FAM；Quencher选NONE；Task阴性质控选N；阳性质控以及未知样本选U；阳性定量参考品选S，并在“Quantity”框中输入定量参考品浓度。
设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤三：结果读取及分析
反应结束后保存检测数据文件。按对应顺序设置BCR-ABL1(P210型、P190型)4个阳性定量参考品(Task中设为Standard，Quantity中设为阳性定量参考品对应的浓度，单位为copies/mL)。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15，End值可以在5～20，在Log图谱窗口Threshold的Value值取样本最高荧光值1/20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线))，使“Standard curve”窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值(correlation数值)≥0.97。“Report”窗口记录仪器自动分析计算出的未知样本BCR-ABL1的拷贝数(BCR-ABL1-Qty)，将该结果导出。重新按对应顺序设置ABL1的4个阳性定量参考品，步骤同前，将未知标本ABL1的拷贝数(ABL1-Qty)导出。(注：Qty是Quantity的缩写，代表浓度)。
步骤四：结果判断
1、内控结果判定：待测样本ABL1 PCR反应管FAM通道有明显扩增曲线，且Ct≤30，满足此条件则按2进行结果判断；若不满足此条件，本样本检测结果无效，建议确认核酸或样本质量后重新检测。
2、BCR-ABL1 PCR反应管(主要型、次要型)结果判断：
1)若BCR-ABL1 PCR反应管FAM检测通道无扩增曲线，或有扩增曲线但Ct值>38，则判断样品的BCR-ABL1 RNA浓度低于本试剂盒最低检测限。
2)若BCR-ABL1 PCR反应管FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期且Ct值≤38，则判为BCR-ABL1阳性，进一步按以下方法进行定量结果判断：
若1.0E+03copies/ml≤BCR-ABL1-Qty≤1.0E+08copies/ml，则该样本的BCR-ABL1表达量为BCR-ABL1-Qty/ABL1-Qty；
若BCR-ABL1-Qty>1.0E+08copies/ml，建议将样本稀释到线性范围内再检测；
若500copies/ml≤BCR-ABL1-Qty﹤1.0E+03copies/ml，定量结果仅作参考。
注：BCR-ABL1主要型反应和次要型反应分别进行判读。
图1显示了阴性质控品检测上机图。
图2显示了BCR-ABL1强阳性质控品检测结果。
图3显示了BCR-ABL1临界阳性质控品检测结果。
图4显示了BCR-ABL1主要型定量参考品检测结果。
图5显示了BCR-ABL1次要型定量参考品检测结果。
图6显示了ABL1定量参考品检测结果。
实施例2：试剂盒的灵敏度检测及最低检出率实验
选用已定标浓度接近检测限500copies/mL的BCR-ABL1主要型样本L1和BCR-ABL1次要型样本L2进行验证。按照步骤一进行核酸提取，步骤二对样本进行检测，每次检测做10个复管。操作严格按试剂盒说明书进行，在实时PCR系统上检测。扩增结束后按照步骤三对实验结果进行读取分析，步骤四进行结果判断。
对本发明的灵敏度和最低检测限进行检测，测试结果如下表12。
表12试剂盒最低检测限结果
试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，灵敏度检测良好；可稳定检测出相应融合基因，且阳性符合率为100％。
实施例3：试剂盒的重复性
根据所测得对照样本的拷贝数，制备重复性参考品共4份，编号分别为R1-R4。R1-R2由BCR-ABL1主要型(P210)阳性样本核酸和10ng/μL阴性样本核酸混合而成；R3-R4由BCR-ABL1次要型(P190)阳性样本核酸和10ng/μL阴性样本核酸混合而成。BCR-ABL1主要型(P210)和BCR-ABL1次要型(P190)样本核酸均经过数字PCR进行拷贝数确认。
以制备的R1-R4为待检样本，检测重复性参考品(R1-R4)，重复检测10次，并对10次样本浓度对数值的变异系数进行统计计算。R1-R2检测结果均为BCR-ABL1主要型(P210)融合基因阳性；R3-R4检测结果均为BCR-ABL1次要型(P190)融合基因阳性；R1-R4浓度对数值的变异系数(CV，％)≤5％。检测结果见表13。
表13试剂盒重复性检测结果
检测结果表明：重复性参考品R1-R4浓度对数值的变异系数CV值均小于5％。符合CSLI EP5-A3，符合定量检测方法的精密度要求。
实施例4：试剂盒的准确性
根据所测得对照样本的拷贝数，制备阳性考品共6份，编号分别为P1-P6。P1-P3由含不同拷贝数(高、中、低)的BCR-ABL1主要型阳性样本核酸和10ng/μL的阴性样本核酸混合制备而成；P4-P6由高、中、低不同拷贝数的BCR-ABL1次要型阳性样本核酸和10ng/μL的阴性样本核酸混合制备而成。
以制备的P1-P6为待检样本，检测阳性参考品(P1-P6)。P1-P3检测结果均为BCR-ABL1主要型(P210)融合基因阳性；P4-P6检测结果均为BCR-ABL1次要型(P190)融合基因阳性，符合率为100％。检测结果见表14。
表14试剂盒准确性检测结果
检测结果表明：阳性参考品P1-P3结果应均为BCR-ABL1主要型融合基因阳性；P4-P6结果应均为BCR-ABL1次要型融合基因阳性。表明本发明试剂盒的准确性较好。
实施例5：临床应用实验
抽取10例白血病患者外周血2mL置于EDTA或枸橼纳抗凝剂的采血管中，提供血样的10名患者已通过Sanger测序法进行BCR-ABL1融合基因类型确定；做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。使用核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；采用分光光度计(如NanoDrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足A260/A280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于10ng/μL，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
取每个样本的RNA模板及试剂盒中对照样本各20μL，加样至步骤二配制的荧光PCR扩增反应体系的八连管中，使每管反应液的总体积为50μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒后，并进行PCR扩增。扩增结束后，参照步骤三进行结果读取和分析，步骤四进行结果判断。
检测结果为：10例样本中，5例样本呈BCR-ABL1融合阳性(3例为P210，2例为P190)，5例样本为阴性，所检结果与Sanger测序法检测的结果一致性为100％。
图7显示了典型的BCR-ABL1主要型(P210)临床样本检测结果。
图8显示了典型的BCR-ABL1次要型(P190)临床样本检测结果。
对比例1
本发明人对BCR-ABL1融合基因的基因序列，进行深入比对分析后，针对目标序列设计了数十套引物探针，期望从中获得能够对2种融合基因进行准确定量检测且灵敏度高的引物探针组合。
由于引物特异性差异、退火温度不一致等原因，针对多个靶标很难获得能够进行同步扩增的高灵敏度荧光PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，其中大多数引物探针体系的标准曲线难以满足定量检测的要求，有些引物探针体系虽然具有较好的标准曲线，但是灵敏度较低。
例如，使用如下的对照引物对进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：
表15.P210对照体系1：
表16.P190对照体系1
按照实施例1的方法进行检测，检测结果表明P210对照体系1的标准曲线较差，无法满足定量检测的要求，P210对照体系1的定量参考品检测结果如图9所示。P190对照体系1的标准曲线较好，能够满足定量检测的要求。
按照实施例2的方法进行灵敏度检测及最低检出率实验，结果表明P190对照体系1的灵敏度较差，针对浓度为500copies/mL的BCR-ABL1次要型样本(10个复管)进行检测，阳性符合率仅为80％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 一种定量检测BCR-ABL1融合基因的引物、探针及其试剂盒
<130> 020093
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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