一种快速检测呼吸道b亚属人腺病毒的检测方法
阅读说明：本技术 一种快速检测呼吸道b亚属人腺病毒的检测方法 (Detection method for rapidly detecting respiratory tract subgenus B human adenovirus ) 是由 马广源 肖勇 管红霞 鲍静 周琪 於淳安 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法,包括如下步骤：步骤1、采集患者呼吸道标本,并提取人腺病毒核酸作为待检模板；步骤2、针对人腺病毒B亚属中5种呼吸道腺病毒进行引物设计和筛选；步骤3、将步骤2中经引物设计和筛选后的5种呼吸道腺病毒的上下游引物分别按照1:1的体积比例进行混合,并将混合后的产物作为引物混合物；步骤4、配制反应体系,反应体系的总体积为25μL；步骤5、将步骤4中的反应体系进行PCR反应,得到PCR产物；步骤6、将得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析,并根据结果判断其亚属,借此,本发明具有不仅可以快速确定是否为腺病毒,并且还可以快速进一步确定亚属的优点。(The invention provides a detection method for rapidly detecting respiratory tract subgenera B human adenovirus, which comprises the following steps: step 1, collecting a respiratory tract specimen of a patient, and extracting human adenovirus nucleic acid as a template to be detected; step 2, designing and screening primers aiming at 5 respiratory tract adenoviruses in human adenovirus subgenus B; step 3, mixing the upstream primers and the downstream primers of the 5 respiratory adenoviruses which are designed and screened in the step 2 according to the volume ratio of 1:1 respectively, and taking the mixed products as a primer mixture; step 4, preparing a reaction system, wherein the total volume of the reaction system is 25 mu L; step 5, carrying out PCR reaction on the reaction system in the step 4 to obtain a PCR product; and 6, carrying out high-resolution melting curve analysis on the obtained PCR product, and judging the subgenera according to the result, so that the method has the advantages of quickly determining whether the PCR product is adenovirus and quickly further determining the subgenera.)
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法。
背景技术
人腺病毒(Human Adenovirus，HAdV)是一种无包膜双链DNA病毒，主要引起呼吸道疾病，也可感染消化道、泌尿道、眼部而引起疾病，其致病性、临床症状与其型别密切相关。依据生物学特性的不同，国际病毒学分类委员会(ICTV)划分为A～G共7个亚属。A、F和G主要引起消化道感染、腹泻，C、E和部分B亚属主要引起呼吸道疾病，其他B亚属主要引起尿路感染，D亚属主要引起角膜炎和结膜炎。人腺病毒可导致多种人类疾病，其中与呼吸道疾病相关的人腺病毒主要有B亚属(HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55)，C亚属(HAdV-1、2、5、6、57)和E亚属(HAdV-4)。而引起常见呼吸道疾病的B亚属主要为HAdV-3、7、11、14和55。
人腺病毒在全球普遍流行，其流行模式多变，常与人腺病毒型别、流行地区和易感人群的年龄等因素相关。人腺病毒感染一年四季均可发生，在我国北方以冬春季常见，南方以春夏季常见。人腺病毒传染性较强，在密闭、拥挤和潮湿的环境，如军营、学校、托幼机构、医疗机构等常可引起暴发流行。HAdV-3和HAdV-7型是儿童下呼吸道感染最重要的人腺病毒型别，其次是11、14型；HAdV-55型自首次在我国发现以来，已在全国形成广泛流行，成为我国成人社区获得性肺炎的重要病原体之一。
高分辨率熔解曲线分析法(High Resolution Melting)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，通常与实时荧光PCR结合，可以实时监测温度上升时双链DNA的解链过程。目前腺病毒的检测方法可分为免疫学和分子生物学检测方法。
免疫学主要包括ELISA技术，但此技术有一定的局限性；分子生物学方法主要为PCR检测技术，目前此技术仅能确定是否为腺病毒，要想进一步确定亚属还的依靠测序技术，不能有效快速的确定亚属，不能在突发公共卫生事件中做到快速检测。
发明内容
本发明提出一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法，具有不仅可以快速确定是否为腺病毒，并且还可以快速进一步确定亚属的优点。
本发明的技术方案是这样实现的：一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、采集患者呼吸道标本，并提取人腺病毒核酸作为待检模板；
步骤2、针对人腺病毒B亚属中5种呼吸道腺病毒进行引物设计和筛选；
步骤3、将步骤2中经引物设计和筛选后的5种呼吸道腺病毒的上下游引物分别按照1:1的体积比例进行混合，并将混合后的产物作为引物混合物；
步骤4、配制反应体系，体系为：10μL MeltDoctorTMHRM Master Mix、8μL RNaseFree Water、2μL步骤3中的引物混合物和5μL步骤1中的待检模板，反应体系的总体积为25μL；
步骤5、将步骤4中的反应体系进行PCR反应，得到PCR产物；
步骤6、将得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析，并根据结果判断其亚属。
作为一种优选的实施方式，步骤1中采集患者呼吸道标本的方法包括鼻咽拭子、痰液或灌洗液中的一种。
作为一种优选的实施方式，步骤1中提取人腺病毒核酸的方法包括采取手工提取试剂盒进行提取或采用全自动核酸提取仪进行提取中的一种。
作为一种优选的实施方式，步骤2中对人腺病毒核酸进行引物设计和筛选后的引物类型包括：HAdV-3、HAdV-7、HAdV-11、HAdV-14和HAdV-55，其上下游引物分别为：
HAdV-3包括如SEQIDNO：1所示的上游引物和如SEQIDNO：2所示的下游引物；
HAdV-7包括如SEQIDNO：3所示的上游引物和如SEQIDNO：4所示的下游引物；
HAdV-11包括如SEQIDNO：5所示的上游引物和如SEQIDNO：6所示的下游引物；
HAdV-14包括如SEQIDNO：7所示的上游引物和如SEQIDNO：8所示的下游引物；
HAdV-55：包括如SEQIDNO：9所示的上游引物和如SEQIDNO：10所示的下游引物。
作为一种优选的实施方式，步骤5中反应体系进行PCR反应的程序为：于95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火45s，并进行40个循环。
作为一种优选的实施方式，步骤5中将得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析的熔解程序为：于95℃熔解2min，60℃熔解2min后，由60℃升温至95℃，熔解速率为0.2℃/s，最后于37℃冷却。
作为一种优选的实施方式，步骤6中根据结果判断其亚属的方法为：
当Tm值为86.2℃±0.14，判定为人腺病毒3型；
当Tm值为79.5℃±0.15，判定为人腺病毒7型；
当Tm值为73.8℃±0.10，判定为人腺病毒11型；
当Tm值为76.3℃±0.12，判定为人腺病毒14型；
当Tm值为82.5℃±0.15，判定为人腺病毒55型。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明采用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)的技术手段，通过核酸扩增、实时荧光PCR、HRM等步骤。高分辨率熔解曲线与实时荧光PCR的结合(HRM-realtime PCR)，HRM具有非常高的灵敏度，HRM中的饱和染料能将PCR产物全程标记，以独特的Tm值的方式来判读结果。从而实现了快速、直观、重复性好的效果，该效果具有准确、灵敏度高、特异性好，费用低、节约检测时间和成本等优点。
与本发明技术相比，以往的检测技术：
1、实时荧光PCR法检测，检测5种亚型至少要2-5管反应液可确定亚型，特点：操作繁琐，荧光探针非常贵；
2、实时荧光PCR法检测到人腺病毒，然后测序进行BLAST分析，确定亚型，特点：操作繁琐、用时长、成本高；
3、普通PCR扩增目的基因，然后凝胶分析确定亚型，特点：灵敏度低、容易污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明高分辨率熔解曲线。
图中，1-人腺病毒Ⅱ型；2-人腺病毒14型；3-人腺病毒7型；4-人腺病毒55型；5-人腺病毒3型。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、采集患者呼吸道标本，并提取人腺病毒核酸作为待检模板；
步骤2、针对人腺病毒B亚属中5种呼吸道腺病毒进行引物设计和筛选，其结果如下表所示；
步骤3、将步骤2中经引物设计和筛选后的5种呼吸道腺病毒的上下游引物分别按照1:1的体积比例进行混合，并将混合后的产物作为引物混合物；
步骤4、配制反应体系，体系为：10μL MeltDoctorTMHRM Master Mix、8μL RNaseFree Water、2μL步骤3中的引物混合物和5μL步骤1中的待检模板，反应体系的总体积为25μL；
步骤5、将步骤4中的反应体系进行PCR反应，得到PCR产物；
步骤6、将得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析，并根据结果判断其亚属。
步骤1中采集患者呼吸道标本的方法包括鼻咽拭子、痰液或灌洗液中的一种。
步骤1中提取人腺病毒核酸的方法包括采取手工提取试剂盒进行提取或采用全自动核酸提取仪进行提取中的一种。
步骤2中对人腺病毒核酸进行引物设计和筛选后的引物类型包括：HAdV-3、HAdV-7、HAdV-11、HAdV-14和HAdV-55，其上下游引物分别为：
HAdV-3：上游引物为5’TTTGCCCACTAACACCA 3’(SEQ ID NO.1)
下游引物为5’GCAATACACGGAAAGGT 3’(SEQ ID NO.2)；
HAdV-7：上游引物为5’GGCATTGCTTCCACG 3’(SEQ ID NO.3)
下游引物为5’GGTTGGCTTCCTCTAC 3’(SEQ ID NO.4)
HAdV-11：上游引物为5’CGGCTTTCAGCGGCT 3’(SEQ ID NO.5)
下游引物为5’AGATAAGGGATGGACCTAC 3’(SEQ ID NO.6)
HAdV-14：上游引物为5’CGGCTTTCAGAGGCT 3’(SEQ ID NO.7)
下游引物为5’GATAAGACCAAGATAAGGGAT 3’(SEQ ID NO.8)
HAdV-55：上游引物为5’GCCCAACAGACCCAA 3’(SEQ ID NO.9)
下游引物为5’ACACCTTAGTCCGACAC 3’(SEQ ID NO.10)。
步骤5中反应体系进行PCR反应的程序为：于95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火45s，并进行40个循环。
步骤6中将得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析的熔解程序为：于95℃熔解2min，60℃熔解2min后，由60℃升温至95℃，熔解速率为0.2℃/s，最后于37℃冷却。
步骤7中根据结果判断其亚属的方法为：
当Tm值为86.2℃±0.14，判定为人腺病毒3型；
当Tm值为79.5℃±0.15，判定为人腺病毒7型；
当Tm值为73.8℃±0.10，判定为人腺病毒11型；
当Tm值为76.3℃±0.12，判定为人腺病毒14型；
当Tm值为82.5℃±0.15，判定为人腺病毒55型。
饱和的荧光染料与DNA双链结合时发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱，如果升高温度使DNA变性，以温度为横坐标对荧光信号作图，可得到溶解曲线，其中50％DNA分子发生变性的温度称为溶解温度(Melting temperature，Tm值),Tm值是PCR引物设计中一个非常重要的参数，是指引物与模板之间精准互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对，而另外50％的引物处于解离状态时的温度。Tm值一般大于55℃。不同的DNA，Tm值不同，DNA中G-C含量越高，Tm值越高。在设计多重PCR时，还要考虑每对引物之间的错配，以及Tm值的差值不能小于2℃，因此本发明选用86.2℃±0.14，判定为人腺病毒3型。
这也就是本设计选择DNA的Tm值作为区分B亚属中5种亚型的基础，这样可以操作简单、只需配制一管PCR反应液，根据Tm值的不同，可轻松判断所检病原的亚型。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 无锡市疾病预防控制中心
<120> 一种快速检测呼吸道B亚属人腺病毒的检测方法
<141> 2021-09-16
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tttgcccact aacacca 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcaatacacg gaaaggt 17
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggcattgctt ccacg 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggttggcttc ctctac 16
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cggctttcag cggct 15
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agataaggga tggacctac 19
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cggctttcag aggct 15
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gataagacca agataaggga t 21
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gcccaacaga cccaa 15
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acaccttagt ccgacac 17
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