用于检测细胞铁死亡的pcr芯片试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 用于检测细胞铁死亡的pcr芯片试剂盒及其使用方法 (PCR chip kit for detecting cell iron death and using method thereof ) 是由 陈美娟 陈成成 陈冲 曹琴琴 杨敏 管瑞静 罕琴 王振球 章进军 贾俊才 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒及其使用方法,该试剂盒中设有qPCR反应预混合溶液、94对特异性引物、ROX参比染料、双蒸水、96孔板；特异性引物每对分别包括一个上游引物和一个下游引物,94对引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.188所示。94对引物对应94个基因,在使用时按顺序放置在96孔板中,每一对引物置于一个孔中。本发明还提供了该试剂盒的使用方法。本发明提供的用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒及其使用方法,可以通过实时荧光定量PCR在转录水平快速检测与铁死亡发生相关基因。(The invention discloses a PCR chip kit for detecting cell iron death and a using method thereof, wherein the kit is provided with qPCR reaction premixed solution, 94 pairs of specific primers, ROX reference dye, double distilled water and a 96-pore plate; each pair of specific primers respectively comprises an upstream primer and a downstream primer, and the sequences of the 94 pairs of primers are shown as SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 188. 94 pairs of primers correspond to 94 genes and are placed in sequence in a 96-well plate at the time of use, with each pair of primers placed in a well. The invention also provides a using method of the kit. The PCR chip kit for detecting the cell iron death and the use method thereof can rapidly detect genes related to the occurrence of the iron death at the transcription level through real-time fluorescent quantitative PCR.)
技术领域
本发明涉及一种分子生物学领域的检测细胞铁死亡的PCR Array试剂盒及其应用，具体地，涉及一种用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒及其使用方法。
背景技术
铁死亡是铁和活性氧(ROS)依赖性的调节性细胞死亡形式，不同于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞死亡方式，不同与其他细胞死亡的形态学特征，铁死亡存在比正常线粒体更小的线粒体，且线粒体膜密度浓缩、线粒体嵴减少或消失以及线粒体外膜破裂等特征。导致铁死亡的原因是由于谷胱甘肽过氧化酶(GPX4)下降，细胞内脂质氧化物代谢发生障碍，在Fe2+催化作用下，脂质过氧化导致活性氧(ROS)升高。从而促使铁死亡的发生。
作为新的细胞死亡机制，铁死亡是近几年来的研究热点。可能参与癌细胞死亡、神经毒性、神经退行性疾病、急性肾功能衰竭、药物性肝毒性、肝脏和心脏缺血/再灌注损伤和T细胞免疫等生命过程。通过对影响铁死亡相关基因整理，探讨铁死亡在各类疾病中发挥的作用，对于治疗疾病具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细胞铁死亡PCR Array试剂盒及其应用，可以通过实时荧光定量的方法在转录水平快速检测与铁死亡发生相关基因。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒，其中，所述的试剂盒中设有qPCR反应预混合溶液、94对特异性引物、ROX参比染料、双蒸水、96孔板；所述的特异性引物，每对分别包括一个上游引物和一个下游引物，94对引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.188所示。
上述的用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒，其中，所述的94对引物对应94个基因，在使用时按顺序放置在96孔板中，每一对引物置于一个孔中。
上述的用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒，其中，所述的94对引物按对应的基因，如以下顺序放置在96孔板中：第一排放置的引物对应的基因为：Aco1，Arf6，Cars，Slc11a2，Gclc，Hamp，Hspb1，Ncoa4，Pcbp1，Sat2，Steap3，Vdac2；第二排放置的引物对应的基因为：Acsl4，Atg5，Cdo1，Dpp4，Gclm，Hars，Ireb2，Nfe2l2，Pcbp2，Slc1a5，Stim1，Vdac3；第三排放置的引物对应的基因为：Akr1b1，Atp5g3，Chac1，Elavl1，Gls2，Heph，Keap1，Nox1，Pparg，Slc39a14，TF，Map1lc3b；第四排放置的引物对应的基因为：Akr1b10，Bbc3，Cisd1，Emc2，Got1，Hfe，Kras，Nox3，Prdx6，Slc39a8，Tfrc，Panx2；第五排放置的引物对应的基因为：Akr1c1，Becn1，Cisd2，Eprs，Gpx4，Hmox1，Lox，Nox4，Prnp，Slc3a2，Tfr2，Sat1；第六排放置的引物对应的基因为：Aldha1，Braf，Cp，Fth1，Gss，Hmox2，Lpcat3，Nqo1，Ptges2，Slc40a1，Trp53，Sqstm1；第七排放置的引物对应的基因为：Alox12，Brd4，Cs，Ftl1，Gsta1，Hras，Map1lc3a，Nras，Rpl8，Slc7a11，Txnrd1，Usp7；第八排放置的引物对应的基因为：Alox15，Car9，Cybb，Ftmt，Gstp1，Hsf1，Actb，Gapdh，Hprt1，B2m。
本发明还提供了一种上述的试剂盒的使用方法，其中，所述的方法包含：步骤1，准备实验组和对照组的细胞cDNA；步骤2，配制PCR反应体系，将94对特异性引物按顺序置于96孔板中，以步骤1所得的cDNA模板，进行实时荧光定量PCR反应；步骤3，根据需要对所得的数据进行分析。
上述的试剂盒的使用方法，其中，所述的步骤2中的PCR反应条件为：在95℃预变性30s，再在95℃变性5s，然后在60℃退火延伸30s，变性和退火延伸进行40个循环。
上述的试剂盒的使用方法，其中，所述的步骤3中，根据数据分析筛选出与铁死亡相关基因的表达量的变化。
上述的试剂盒的使用方法，其中，所述的步骤3中的分析包含熔解曲线分析。
上述的试剂盒的使用方法，其中，所述的熔解曲线的条件为在95℃持续15s，再在60℃持续1min。
本发明提供的用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒及其使用方法具有以下优点：
本发明提供了检测铁死亡核心基因的丰度变化的试剂，借助于该检测试剂可以通过实时荧光定量的方法在转录水平快速检测与铁死亡发生相关基因，在此基础上分析研究影响铁死亡的核心基因及作用机制，进一步探讨核心基因靶向的途径，从而发现铁死亡在各类疾病中发挥的作用机制，对于治疗各类疾病具有重要的现实意义。
本发明通过各大数据库及文献整理确定了90个与铁死亡相关的基因。本发明重点在于引物的设计组合，通过对90个基因引物对不断优化和验证，避免每个基因在PCR扩增是不会出现引物二聚体、非特异性扩增，从而保证所有基因的的有效扩增效率。如若引物对选择的不对出现引物二聚体则会影响目的基因的正常扩增；或者非特异性扩增的产生，对PCR结果的有效性将产生影响。在同一实验条件下，同时对90个目的基因和4个内参基因进行PCR检测，要保证引物对适宜和最佳扩增条件，是技术难点，其中最核心的是引物设计，本发明中引物对都是经过不断的优化和验证，确定的最合适的引物对，保证了基因的扩增效率和没有非特异性扩增。
本发明试剂盒的实验体系可以在任一实时荧光定量PCR仪器上使用。可以通过一次反应得到关于铁死亡核心基因的丰度变化，实验操作简单，结果重复性好，是研究铁死亡与各类疾病关系的一种高效研究方法。
附图说明
图1a和图1b为对照组和实验组的实时荧光定量PCR扩增曲线图。
图2a和图2b为对照组和实验组的实时荧光定量PCR熔解曲线图。
图3为对照组和实验组实时荧光定量PCR后热图分析的结果图。
图4为对照组和实验组实时荧光定量PCR后差异表达分析的结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
一种用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒，该试剂盒中设有qPCR反应预混合溶液、94对特异性引物、ROX参比染料、双蒸水、96孔板；特异性引物每对分别包括一个上游引物和一个下游引物，94对引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.188(即，序列1～188)所示。具体参见下表1。
表1.特异性引物表。
94对引物对应94个基因，在使用时按顺序放置在96孔板中，每一对引物置于一个孔中。
94对引物按对应的基因，如以下顺序放置在96孔板中：第一排放置的引物对应的基因为：Aco1，Arf6，Cars，Slc11a2，Gclc，Hamp，Hspb1，Ncoa4，Pcbp1，Sat2，Steap3，Vdac2；第二排放置的引物对应的基因为：Acsl4，Atg5，Cdo1，Dpp4，Gclm，Hars，Ireb2，Nfe2l2，Pcbp2，Slc1a5，Stim1，Vdac3；第三排放置的引物对应的基因为：Akr1b1，Atp5g3，Chac1，Elavl1，Gls2，Heph，Keap1，Nox1，Pparg，Slc39a14，TF，Map1lc3b；第四排放置的引物对应的基因为：Akr1b10，Bbc3，Cisd1，Emc2，Got1，Hfe，Kras，Nox3，Prdx6，Slc39a8，Tfrc，Panx2；第五排放置的引物对应的基因为：Akr1c1，Becn1，Cisd2，Eprs，Gpx4，Hmox1，Lox，Nox4，Prnp，Slc3a2，Tfr2，Sat1；第六排放置的引物对应的基因为：Aldha1，Braf，Cp，Fth1，Gss，Hmox2，Lpcat3，Nqo1，Ptges2，Slc40a1，Trp53，Sqstm1；第七排放置的引物对应的基因为：Alox12，Brd4，Cs，Ftl1，Gsta1，Hras，Map1lc3a，Nras，Rpl8，Slc7a11，Txnrd1，Usp7；第八排放置的引物对应的基因为：Alox15，Car9，Cybb，Ftmt，Gstp1，Hsf1，Actb，Gapdh，Hprt1，B2m。
本发明还提供了该试剂盒的使用方法，该方法包含：步骤1，准备实验组和对照组的细胞cDNA；步骤2，配制PCR反应体系，将94对特异性引物按顺序置于96孔板中，以步骤1所得的cDNA模板，进行实时荧光定量PCR反应；步骤3，根据需要对所得的数据进行分析。
步骤2中的PCR反应条件为：在95℃预变性30s，再在95℃变性5s，然后在60℃退火延伸30s，变性和退火延伸进行40个循环。
步骤3中，根据数据分析筛选出与铁死亡相关基因的表达量的变化。
步骤3中的分析包含熔解曲线分析。
熔解曲线的条件为在95℃持续15s，再在60℃持续1min。
步骤3中的分析还包含扩增曲线分析，热图分析，差异表达分析等。
下面结合实施例对本发明做更进一步描述。
实施例1.用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒。
该试剂盒中设有qPCR反应预混合溶液(WCGENE生产的qPCR mix)、94对特异性引物、ROX参比染料、双蒸水(无RNA酶/DNA酶ddH2O)、96孔板；特异性引物每对分别包括一个上游引物和一个下游引物，94对引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.188所示。
94对引物对应94个基因，在使用时按顺序放置在96孔板中，每一对引物置于一个孔中。
94对引物按对应的基因，根据下表2的顺序放置在96孔板中。
表2.引物在96孔板的放置顺序。
96孔板的孔位设置为共8排，排前标有字母A～H，每排12个孔，最顶端的一排孔的上方标有数字1～12。94对引物按顺序放入前94个孔，最后一排(H排)的最后两个孔(孔11、孔12)为空白对照。
实施例2.PCR试剂在检测小鼠正常组、实验组的试剂盒中的应用。
一种用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒的使用方法，首先准备小鼠实验组和对照组(正常组)两个细胞cDNA，然后使用该试剂盒检测细胞内铁死亡。即，将94对引物按顺序置于96孔板中，进行实时荧光定量PCR检测，可以通过一次反应获得关于铁死亡相关基因丰度的变化。
该试剂盒采用实时荧光定量PCR方法进行检测，具体如下。
配制实时荧光定量PCR的反应体系，如下表3所示。
表3.反应体系。
将准备好的cDNA模板，按照以上体系进行实时荧光定量PCR反应。采用的PCR反应仪器为ABI StepOnePlus。
在ABI StepOnePlus仪器上设置程序如下表4所示。
表4.反应程序。
将引物置于96孔板上进行PCR反应，其中每一对引物置于一孔，将94对引物对置于94个孔中，具体排布如表2所示。
所得的对照组(正常组)和实验组的扩增曲线，参见图1a(对照组)和图1b(实验组)所示。从扩增曲线图上可以看出目的基因扩增良好，ct值在正常范围内，适合下游数据分析。
对照组和实验组的熔解曲线，参见图2a(对照组)和图2b(实验组)所示。从熔解曲线图上可看出目的基因的峰都是单一的，没有引物二聚体及非特异性扩增。说明PCR体系良好，可以进行下游实验。
再利用各个基因的Ct值计算核心血管生成相关基因的表达差异。
根据对照组和实验组实时荧光定量PCR后，计算出2-△ct，进行的热图分析的结果，参见图3所示。
根据对照组和实验组实时荧光定量PCR后，计算出2-△△ct，进行差异表达分析的结果，参见图4所示。
根据以上数据分析，可以筛选出与铁死亡相关基因的表达量的变化。
本发明提供的用于检测细胞铁死亡的PCR芯片试剂盒及其使用方法，针对现有技术中如何确定某些基因分子通过直接或间接靶向铁代谢和脂质过氧化来调节铁死亡的问题，将涉及细胞铁死亡相关的基因分子集中在一个96孔板中，通过实时荧光定量的方法在转录水平快速检测与铁死亡发生相关基因。即，本发明通过将94对引物置于96孔板中，进行实时荧光定量PCR检测，可以从一次反应中获得关于铁死亡相关基因丰度的变化。
本发明将涉及与铁死亡密切相关的基因集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，与正常细胞、实验组做对比，探讨铁死亡在疾病组/正常细胞中的可能途径，进而探讨引起铁死亡的核心基因及核心基因可能的靶途径，能够为研究铁死亡中核心分子调控，特别是研究关键蛋白的调控提供最直接的证据。本发明从转录水平快速准确的找到铁死亡相关分子，为与铁死亡相关疾病作用机制探讨等提供了一种实验试剂。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
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