具体实施方式

定义

下文提供了一些定义。然而，定义可位于下文的“实施方案”部分，并且以上标题“定义”并不表示“实施方案”部分中的此类公开不是定义。

本文中表示的所有百分数均以占组合物的总重量的重量计，除非另有表示。如本文所用，“约”、“大约”和“基本上”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如该所提及数字的-10％至+10％的范围内，优选该所提及数字的-5％至+5％，更优选该所提及数字的-1％至+1％，最优选该所提及数字的-0.1％至+0.1％。本文中的所有数值范围都应理解为包括该范围内的所有整数或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。

如在本公开和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述(该)”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种代谢物”或“所述代谢物”包括一种代谢物，但也包括两种或更多种代谢物。

词语“包括/包含”都将被解释为包含性的而非排他性的。同样地，术语“包括/包含”和“或”都应当视为包含性的，除非上下文明确禁止这一解释。然而，本文所公开的组合物可不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”的实施方案和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。

如本文所用，“基本上由橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者组成的组合物”和“基本上由橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者和钙组成的组合物”不包括影响除橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙之外的线粒体钙输入的任何附加的化合物。在一个具体的非限制性实施方案中，组合物由赋形剂、橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者、以及任选的钙组成。

在“X和/或Y”的上下文中使用的术语“和/或”应解释为“X”或“Y”或“X和Y”。类似地，“X或Y中的至少一者”应解释为“X”或“Y”或“X和Y两者”。例如，“橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者”意指“橄榄苦苷”或“橄榄苦苷的代谢物”或“橄榄苦苷和橄榄苦苷的代谢物两者”。

在本文中使用的情况下，术语“示例”和“诸如”(尤其后跟术语的列表时)仅为示例性和例示性，而不应被视为排他性的或全面的。如本文所用，“与…相关联”和“与…有联系”是指同时发生，优选是指由相同的潜在病症引起，并且最优选是指所鉴定的病症之一由另一个所鉴定的病症引起。

术语“食物”、“食物产品”和“食物组合物”意指旨在供个体(诸如，人类)摄入并且向个体提供至少一种营养物质的产品或组合物。本公开(包括本文所述的多个实施方案)的组合物可包含、由或基本上由以下要素组成：本文所公开的要素，以及本文所述的或者说可用于饮食中的任何另外的或任选的成分、组分或要素。

如本文所用，术语“治疗”是指将本文所公开的组合物施用于患有病症的个体以减轻、降低或改善至少一种与该病症相关的症状和/或减缓、降低或阻断该病症的进展。术语“治疗”(“treatment”和“treat”)既包括预防性或防止性治疗(预防和/或延缓目标病理学病症或障碍的发展或进展)，也包括治愈性、治疗性或疾病改善性治疗，包括治愈、延缓、减轻已确诊病理学病症或障碍的症状和/或中断其进展的治疗性措施；和治疗存在染病风险或怀疑已染病的患者，以及治疗患病或已经诊断为患有疾病或医学病症的患者。术语“治疗”不一定表示个体被治疗直至完全恢复。术语“治疗”也指在未患疾病但可能易于发展不健康病症的个体中进行的健康维持和/或促进。术语“治疗”还旨在包括强化或以其它方式增强一种或多种主要的预防性或治疗性措施。作为非限制性示例，可以由患者、护理人员、医生、护士或另外的医疗保健专业人员进行治疗。

人类和兽医治疗均在本公开的范围之内。优选地，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以提供治疗有效量或预防有效量的份量或单位剂型施用。

术语“预防”是指将本文所公开的组合物施用于没有显示该病症的任何症状的个体以降低或预防与该病症相关的至少一种症状的发展。此外，“预防”包括减少病症或障碍的风险、发生率和/或严重程度。

如本文所用，“有效量”是在个体中治疗或预防缺陷、治疗或预防疾病或医学病症的量，或更一般地说，是减少症状、管理疾病进展或向个体提供营养、生理或医学益处的量。

相对术语“改善”、“增加”、“增强”等是指相对于在不含橄榄苦苷且不含橄榄苦苷代谢物但在其他方面相同的组合物的相同时间段内施用，本文所公开的组合物(即包含有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者的组合物)的效应。

如本文所用，“施用”包括另一个体向个体提供所提及的组合物，使得该个体可食用该组合物，并且还仅包括个体自身食用所提及的组合物的行为。

“动物”包括但不限于哺乳动物，其包括但不限于啮齿动物；水生哺乳动物；家畜，诸如狗、猫和其他宠物；农场动物，诸如绵羊、猪、牛和马；和人。在使用“动物”、“哺乳动物”或它们的复数形式时，这些术语还适用于能够具有通过段落上下文表现出的或意欲表现出的作用的任何动物，例如受益于改善的线粒体钙输入的动物。虽然本文中常用术语“个体(individual)”或“个体(subject)”来指人，但本公开并非限制于此。因此，术语“个体(individual)”或“个体(subject)”是指可受益于本文所公开的方法和组合物的任何动物、哺乳动物或人类。

术语“宠物”意指可得益于或享用本公开所提供组合物的任何动物。例如，宠物可以是鸟类动物、牛科动物、犬科动物、马类动物、猫科动物、山羊类动物、狼类动物、鼠科动物、绵羊类动物或猪类动物，但宠物也可以是任何合适的动物。术语“伴侣动物”意指狗或猫。

在人的上下文中，术语“老年”是指自出生起的年龄为至少60岁，优选63岁以上，更优选65岁以上，并且最优选70岁以上。在非人动物的上下文中，“老年”意指已达到其可能寿命的60％，在一些实施方案中达到其可能寿命的至少70％、至少80％或至少90％的非人受试者。寿命的确定可以基于死亡率统计表、计算、或估计，并且可以考虑已知会对寿命造成正面或负面影响的过去、现在和未来的影响或因素。在确定寿命时，物种、性别、体型大小、遗传因素、环境因素和应激物，当前和过去的健康状态、过去和现在的营养状况、和应激物的考虑可以被纳入考虑中。在人的上下文中，术语“中老年”是指自出生起年龄为至少45岁，优选50岁以上，更优选55岁以上，并且包括老年个体。

本文所用的术语“份量”或“单位剂型”是可互换的，并且指适合作为用于人和动物个体的单位剂量的物理离散单位，每个单位优选与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相关联地含有预定量的本文所公开的包含橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者的组合物，其量足以产生所需的效果。单位剂型的规格取决于所用的特定化合物、要实现的效果以及与宿主中每种化合物相关联的药效学。在一个实施方案中，单位剂型可以是容纳在诸如瓶的容器内的预定量的液体。

“口服营养补充剂”或“ONS”是包含至少一种宏量营养素和/或至少一种微量营养素的组合物，例如无菌液体、半固体或粉末的形式，并且旨在补充其他营养摄入量，诸如来自食物的营养摄入量。可商购获得的ONS产品的非限制性示例包括和在一些实施方案中，ONS可以是可在不进一步添加液体的情况下食用的液体形式的饮料，例如为一份组合物的一定量液体。

如本文所用，“不完全营养”优选地是指不包含含量充足的常量营养素(蛋白质、脂肪和碳水化合物)或微量营养素的营养产品，对于施用该营养产品的动物而言不足以作为唯一营养源。术语“完全营养”是指能够成为个体营养的唯一来源的产品。从完全营养组合物中，个体可得到其营养需求的100％。

“套盒”是指该套盒的多个组分在一个或多个容器中物理上相关联，或与一个或多个容器物理上相关联，而且被视作制造、分装、销售或使用的单元。容器包括但不限于袋、盒、纸盒、瓶、外包装、收缩包装、附连部件(例如，装订部件、粘附部件等)，任何类型、任何设计或任何材料的包装，或它们的组合。

“代谢疲劳”意指一个或多个细胞(例如，肝脏、肾、脑、骨骼肌中的一个或多个)中的线粒体功能减少，这是由于一个或多个细胞内的底物不足和/或肌纤维内的代谢物积聚，代谢物积聚干扰钙的释放或钙刺激线粒体功能的能力。与代谢疲劳相关的生理状态可包括肌肉疲劳或虚弱、缺乏能量、特别是物理能量、缺乏活力或虚弱。

实施方案

橄榄苦苷是存在于属于木犀科的植物、并且尤其是油橄榄的果实、根部、树干中并且更具体地叶片中的多酚。图1示出了橄榄苦苷的化学结构。橄榄苦苷是3,4-二羟基苯基乙醇(也称为羟基酪醇，在图1中标记为“A”)和橄榄酸(在图1中标记为“B”)的杂环脂肪酸酯(heterosidic ester)，其含有葡萄糖分子(在图1中标记为“C”)。图2示出了基于文献中报道的研究结果，本发明中哺乳动物和微生物酶的橄榄苦苷的代谢途径。

本公开的一个方面是实现选自以下的至少一种结果的方法：(i)改善与一个或多个细胞中的代谢疲劳相关的生理状态，(ii)增加一个或多个细胞中线粒体能量和线粒体钙摄取，以及(iii)治疗或预防钙缺乏/耗尽症(例如降低发生率和/或严重性)。该方法包括向个体口服施用有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。

本公开的另一方面是在对其有需要的个体中治疗或在处于其风险(例如，降低发生率和/或严重性)的个体中预防选自以下的至少一种病症的方法：(i)与一个或多个细胞中的代谢疲劳相关的生理状态，以及(ii)钙缺乏/耗尽症。该方法包括向对其有需要或处于其风险中的个体口服施用有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。

本公开的又一个方面是在对其有需要或处于其风险中的个体中治疗或预防(例如，降低发生率和/或严重性)线粒体相关疾病或与改变的线粒体功能相关的病症的方法。该方法包括向个体口服施用有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。线粒体相关疾病或病症可选自：应激、生理性衰老、肥胖、代谢率降低、代谢综合征、糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、神经退行性疾病、认知障碍、应激诱导的或应激相关的认知功能障碍、心境障碍、焦虑障碍、年龄相关的神经元死亡或功能障碍、慢性肾病、肾衰竭、创伤、感染、癌症、听力损失、黄斑变性、肌病和营养不良以及它们的组合。

在另一个实施方案中，代谢疲劳包括缺乏能量、特别是物理能量、缺乏活力或虚弱。

在一些实施方案中，方法包括在施用之前将个体鉴定为患有该病症或存在该病症风险。

橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者的有效量随特定组合物、接受者的年龄和病症以及所治疗的特定障碍或疾病而变化。然而，在一般实施方案中，可每天将0.001mg至1.0g的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者，优选地每天0.01mg至0.9g的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者，更优选地每天0.1mg至750mg的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者，更优选地每天0.5mg至500mg的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者，并且最优选地每天1.0mg至200mg的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者施用于个体。

在一些实施方案中，橄榄苦苷以还包含钙的组合物施用。钙的至少一部分可为一种或多种钙盐，诸如乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙或它们的混合物。在一般实施方案中，每天向个体施用0.1g至1.0g的钙，优选每天125mg至950g的钙，更优选每天150mg至900mg的钙，更优选每天175mg至850mg的钙，并且最优选每天200mg至800mg的钙。

在一个实施方案中，橄榄苦苷的至少一部分通过萃取获得，例如通过从植物诸如属于木犀科的植物中萃取，优选从属于木犀科的植物诸如油橄榄(橄榄树)、女贞属的植物、丁香属的植物、白蜡属的植物、茉莉属的植物和木犀属的植物的茎、叶、果实或核中的一者或多者中萃取。附加地或另选地，橄榄苦苷和/或其代谢物的至少一部分可通过化学合成获得。

橄榄苦苷的合适代谢物的非限制性示例包括橄榄苦苷元、羟基酪醇、高香草醇、异高香草醇、它们的葡糖醛酸化形式、它们的硫酸化形式、它们的衍生物、以及它们的混合物。图3A示出了高香草醇的化学结构；并且图3B示出了其异构体(3-羟基-4-甲氧基苯乙醇或3-羟基-4-甲氧基苯乙基醇)。

在一些实施方案中，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者是施用给个体的唯一多酚和/或施用给个体的组合物中的唯一多酚。

在一些实施方案中，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙可施用于老年个体。在一些实施方案中，个体是健康的。在一些实施方案中，个体具有代谢疲劳，但任选地原本是健康的。在一些实施方案中，个体可为宠物。

在一个实施方案中，一个或多个细胞的至少一部分为选自肝脏、肾、脑和骨骼肌的至少一种身体部分的一部分。

橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙可以适于人类和/或动物食用的任何组合物施用。在一个优选的实施方案中，将橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙口服或经胃肠内施用(例如管饲)给个体。例如，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙可以饮料、食物产品、胶囊、片剂、粉末或悬浮液施用于个体。

合适的组合物的非限制性示例包括食物组合物、膳食补充剂、膳食补充剂(例如，液体ONS)、完全营养组合物、饮料、药品、营养剂、在食用前用水或乳重构的粉末状营养产品、食品添加剂、药物、饮品、宠物食品以及它们的组合。

根据本发明的食物产品可包括乳制品，诸如发酵乳产品，例如酸奶、酪乳等；冰淇淋；浓缩乳；乳；乳制奶油；风味乳饮品；基于乳清的饮品；浇头；咖啡奶精；巧克力；基于干酪的产品；汤；沙司；菜泥；调味品；布丁；奶油冻；婴孩食物；营养配方食品，诸如用于完全营养的那些，例如用于婴儿、儿童、青少年、成人、老年人或病危；例如谷物和谷物棒。

饮品可包括例如基于乳或酸奶的饮品、发酵乳、蛋白质饮品、咖啡、茶、能量饮品、大豆饮品、水果和/或蔬菜饮品、水果和/或蔬菜汁。

橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙可以食物产品施用，该食物产品还包含选自蛋白质、碳水化合物、脂肪以及它们的混合物的组分。

在不能或不建议口服或经胃肠内施用的一些情况下，组合物可以肠胃外方式施用。

在另一个实施方案中，本公开提供了在对其有需要或处于其风险中的个体中治疗或预防(例如，降低发生率和/或严重性)线粒体相关疾病或与改变的线粒体功能相关的病症的方法。该方法包括向对其有需要或处于其风险中的个体口服施用有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。

在一个实施方案中，将橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙施用于个体持续至少一个月的时间段；优选至少两个月，更优选至少三个月、四个月、五个月或六个月；最优选至少一年。在该时间段期间，可每周至少一天向个体施用橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙；优选每周至少两天，更优选每周至少三天、四天、五天或六天；最优选每周七天。橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙可以每天单次剂量或每天多次单独剂量施用。

上述施用示例不需要无中断的连续每日施用。相反，在施用中可以存在一些短暂的中断，例如在施用期间中断两至四天。施用组合物的理想持续时间可以由本领域的技术人员确定。

在一个实施方案中，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者可在同一组合物中与钙一起施用，例如同时包含橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者和钙的单位剂型。

在另选的实施方案中，橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者可与钙在单独的组合物中依次施用。术语“依次”是指橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者和钙以相继的方式施用，使得橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者在第一时间施用而不含钙，并且在第二时间(在第一时间之前或之后)施用钙而不含橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。在顺序施用之间的时间可以是例如在同一天中的一秒或几秒、一分钟或几分钟或一小时或几小时；同一个月中的一天或几天或一周或几周；或同一年中的一个或几个月。

本公开的另一方面是一种制备用于实现选自以下的效应的组合物的方法：(i)改善与一个或多个细胞中的代谢疲劳相关的生理状态，(ii)增加一个或多个细胞中线粒体能量和线粒体钙摄取，以及(iii)治疗或预防钙缺乏/耗尽症(例如降低发生率和/或严重性)。

该方法包括将橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者添加至选自蛋白质、碳水化合物、脂质以及它们的组合的成分中。组合物(例如，食物产品)可在施用前制备(例如，组合物被制备、包装、并且然后由将组合物施用给自身或其他个体的消费者购买)，或者可基本上与施用同时制备(由对自己或他人施用该组合物的个体在施用之前小于30分钟、优选在施用之前小于15分钟、更优选在施用之前小于10分钟、最优选在施用之前小于5分钟制备组合物)。

该组合物可包含有效量的橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者。例如，组合物的单份或剂量可包含有效量，而包装可包含一份或多份，或一个或多个剂量。任选地，组合物还可包含钙。

组合物可包含选自以下的食品添加剂：酸化剂、增稠剂、用于pH调节的缓冲剂或试剂、螯合剂、着色剂、乳化剂、赋形剂、调味剂、矿物质、渗透剂、药学上可接受的载体、防腐剂、稳定剂、糖、甜味剂、质构剂、维生素、矿物质及其组合。

除了橄榄苦苷或其代谢物中的至少一者以及任选的钙之外，该组合物可还包含来自动物或植物起源的蛋白质源，例如乳蛋白、大豆蛋白和/或豌豆蛋白。在一个优选的实施方案中，所述蛋白质源选自乳清蛋白质；酪蛋白蛋白质；豌豆蛋白质；大豆蛋白质；小麦蛋白质；玉米蛋白质；水稻蛋白质；来自豆类、谷类食物和谷物的蛋白质；以及它们的组合。除此之外或另选地，所述蛋白质源可包含来自坚果和/或籽粒的蛋白质。

所述蛋白质源优选包含乳清蛋白质。乳清蛋白质可以是未水解的或水解的乳清蛋白质。乳清蛋白质可以是任何乳清蛋白质，例如乳清蛋白质可以选自乳清蛋白质浓缩物、乳清蛋白质分离物、乳清蛋白质胶束、乳清蛋白质水解物、酸乳清、甜乳清、改性甜乳清(其中已去除酪蛋白-糖巨肽的甜乳清)、乳清蛋白质的级分及其任何组合。在一个优选的实施方案中，所述乳清蛋白质包括乳清蛋白质分离物和/或改性甜乳清。

如上所述，所述蛋白质源可以来自于动物或植物来源，例如乳蛋白质、大豆蛋白质和/或豌豆蛋白质。在一个实施方案中，所述蛋白质源包含酪蛋白。酪蛋白可以从任何哺乳动物获得，但优选从牛乳获得，并且优选为胶束酪蛋白。

所述组合物可包含一种或多种支链氨基酸。例如，所述组合物可包含亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸。所述组合物中的蛋白质源可包括游离形式的亮氨酸和/或结合成肽和/或蛋白质的亮氨酸(诸如乳制品、动物或植物蛋白质)。在一个实施方案中，所述组合物包含其量最多达组合物干物质的10重量％的亮氨酸。亮氨酸可以D-亮氨酸或L-亮氨酸形式存在，优选为L-形式。如果所述组合物包含亮氨酸，则该组合物可以每千克体重提供0.01至0.04g亮氨酸、优选每千克体重提供0.02至0.035g亮氨酸的日剂量施用。这样的剂量特别适用于完全营养组合物，但是普通技术人员将容易地认识到如何针对口服营养补充剂(ONS)调整这些剂量。

可在组合物中使用除任何钙之外的一种或多种其它矿物质。合适的矿物质的非限制性示例包括硼、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、镍、磷、钾、硒、硅、锡、钒、锌、以及它们的组合。

可在组合物中使用除任何之外的一种或多种其它维生素。合适的维生素的非限制性示例包括维生素A、维生素B1(硫胺)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸或烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡多胺或盐酸吡哆醇)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)和维生素B12(各种钴胺素；在维生素补充剂中通常是氰钴胺)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、叶酸、生物素)，以及它们的组合。“维生素”包括以天然方式获自植物和动物食物或以合成方式制备的此类化合物、前维生素、其衍生物以及它们的类似物。

所述组合物还可包含碳水化合物和/或脂肪源。合适的脂肪的非限制性示例包括低芥酸菜子油、玉米油和高油酸葵花油。合适碳水化合物的非限制性示例包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精以及它们的混合物。除此之外或另选地，可添加膳食纤维。膳食纤维通过小肠而不被酶消化，并且起到天然填充剂和轻泻剂的功能。膳食纤维可为可溶的或不溶的，并且一般来说两种类型的混合物是优选的。合适膳食纤维的非限制性示例包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、部分水解的瓜尔胶、阿拉伯树胶、低聚果糖、酸性低聚糖、低聚半乳糖、唾液酸乳糖和来自动物乳汁的低聚糖。优选的纤维混合物是菊粉与较短链低聚果糖的混合物。在一个实施方案中，纤维含量介于2和40g/L组合物之间，例如介于4和10g/L之间。

一种或多种食品级乳化剂诸如单甘油酯和二甘油酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和/或单甘油酯和二甘油酯可掺入组合物中。还可包含合适的盐和稳定剂。

实施例

以下非限制性实施例提供了支持本文所公开的组合物和方法的实验数据。

实施例1

为了测试橄榄苦苷、其代谢物以及钙补充/缺乏在活细胞中的效应，发明人测量了HeLa细胞中和从小鼠C2C12细胞和人类原代成人肌肉细胞分化的肌管中的线粒体钙升高。海拉细胞和C2C12细胞购自ATCC。人骨骼肌成肌细胞(HSMM)购自Lonza。将HSMM从正常供体的上臂或腿肌肉组织分离，并在第二次传代后使用。将海拉细胞以50000个细胞/孔的密度接种于96孔板的基本必需培养基(DMEM，Gibco)(高葡萄糖+10％胎牛血清)中。将C2C12细胞以8000细胞/孔的密度接种于96孔板的DMEM高糖(Gibco)+10％胎牛血清中。通过使细胞在含有2％马血清的DMEM中生长4天，使肌管由C2C12细胞分化。将HSMM以8000细胞/孔的密度接种于96孔板的DMEM/F-12(Gibco)中。通过使细胞在含有2％马血清的SKM-M培养基(ZenBio)中生长4天，使肌管有HSMM分化。

线粒体钙测量使用感染有表达线粒体靶向钙传感器线粒体突变的水母发光蛋白的腺病毒(来自Sirion biotech)的海拉细胞或肌管进行(Monange等人，2004)。对于水母发光蛋白重构，在感染后24小时，将细胞或肌管在室温(22±℃)下在具有1μM野生型腔肠素的标准培养基(145mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、1mM MgCl₂、10mM葡萄糖和10mM Hepes，pH7.4)中温育2小时。

对于处理，在测量前2小时将化合物直接添加到细胞培养物或肌管培养物中。在Cytation 3细胞成像阅读器(Biotek)或FLIPR Tetra Aequorin(Molecular Devices)处测量发光。使用如前所述的算法将光密度数据校准为钙浓度(Alvarez&Montero,2002)。基于Excel(Microsoft)和GhaphPad Prism 7.02(GraphPad)软件的定制模块分析用于定量。

如图4所示，在刺激期间，橄榄苦苷增加了海拉细胞中线粒体钙的升高。如图5所示，橄榄苦苷活化由人骨骼肌成肌细胞(HSMM)分化的咖啡因刺激的人肌管中的线粒体钙。如图6所示，橄榄苦苷的酚类代谢物活化咖啡因刺激的HSMM肌管中的线粒体钙。如图7所示，Ca²⁺补充在来源于C2C12的肌管中以剂量/响应方式活化线粒体Ca²⁺升高。如图8所示，橄榄苦苷在C2C12衍生的肌管中拯救钙耗尽条件下的线粒体活化。

实施例2

为了测试橄榄苦苷和羟基酪醇对线粒体呼吸作用的效应并评估这些化合物对呼吸作用的ATP合酶依赖性组分的效应，发明人测量了人骨骼肌肌管中的氧消耗。对于呼吸作用实验，使用XF96仪器(Seahorse Biosciences,MA)在肌管中测量氧气消耗。在第2天和第2天后，将人肌管接种到包被聚鸟氨酸的Seahorse组织板中，将细胞在含有(以mM为单位)140NaCl、3.6Kcl、0.5NaH₂PO₄、0.5MgSO₄、1.5CaCl₂、10Hepes、5NaHCO₃、10葡萄糖、pH7.4的Krebs-Ringer碳酸氢盐Hepes缓冲液(KRBH)中洗涤两次。在37℃下每6分钟测定一次呼吸速率。ATP合酶依赖性呼吸作用计算为添加寡霉素之前和之后的呼吸速率的差值。实验在37℃下进行。

如图9所示，在人骨骼肌肌管中的刺激期间，橄榄苦苷和羟基酪醇促进呼吸作用的ATP合酶依赖性组分。

实施例3：

为了测试橄榄苦苷对ATP产生的效应，发明人测量了从C2C12细胞分化的肌管中的ATP。用常规的基于发光的荧光素/荧光素酶方法测量ATP。将肌管在KRBH培养基中温育，并加入橄榄苦苷保持15分钟。然后用5mM咖啡因再刺激肌管10分钟。最后，将肌管与萤光素/萤光素酶在裂解缓冲液中温育，并在Cytation 3细胞成像阅读器(Biotek)处测量与ATP的存在量成比例的生物发光信号。如图10所示，橄榄苦苷增加了用咖啡因刺激的C2C12衍生的肌管中的ATP产生。

实施例4

为了测试橄榄苦苷和羟基酪醇对分离的成年小鼠肌纤维中线粒体钙摄取的效应，在体内转染后7-10天分离趾短屈肌(FDB)纤维。肌肉在溶解于含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific)的Tyrode盐溶液(pH7.4)(Sigma-Aldrich)中的胶原酶A(4mg/ml)(Roche)中消化。分离单纤维，铺板于层粘连蛋白包被的盖玻片上，并在补充有10％胎牛血清的具有HEPES的DMEM(42430Thermo Fisher Scientific)中培养，胎牛血清含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)。将纤维保持在37℃和5％CO₂的培养物中。对于线粒体Ca²⁺测 量，用编码线粒体钙传感器4mtGCaMP6f的质粒对FDB肌肉进行电穿孔。在单纤维分离之后，进行实时成像。在实验期间，在室温下，在75μM的N-苄基-对甲苯磺酰胺(BTS，Sigma-Aldrich)的存在下，将肌纤维保持在Krebs-Ringer改性缓冲液(135mM NaCl、5mM KCl、1mMMgCl₂、20mM HEPES、1mM MgSO₄、0.4mM KH₂PO₄、1mM CaCl₂、5.5mM葡萄糖，pH7.4)中以避免纤维收缩。当指示引发钙从细胞内储库释放时，添加60mM咖啡因(Sigma-Aldrich)。在配备有40×/1.3N.A.的Zeiss Axiovert 200显微镜上进行实验。PlanFluor物镜。用配备有75W氙弧灯的DeltaRAM V高速单色仪(Photon Technology International)进行激发。用高灵敏度Evolve 512Delta EMCCD(Photometrics)捕获图像。该系统由MetaMorph 7.5(MolecularDevices)控制并且由Crisel Instruments组装。另选地，每秒分别在410nm和475nm处激发4mtGCaMP6f传感器，并且通过双带发射滤波器(520/40和630/60(Chroma)采集图像。曝光时间设置为50ms。在具有200的EM增益的合并1时进行采集。用ImageJ软件的Fiji分配进行图像分析。减去图像的背景。如图11所示，橄榄苦苷增加了分离的成年小鼠肌纤维中的线粒体钙摄取。如图12所示，橄榄苦苷增加了分离的成年小鼠肌纤维中的线粒体钙摄取。

实施例5

为了测试橄榄苦苷和羟基酪醇对分离的成年小鼠肌纤维中线粒体呼吸作用的效应，如下所述分离趾短屈肌(FDB)纤维。肌肉在溶解于含有10％胎牛血清(Thermo FisherScientific)的Tyrode盐溶液(pH7.4)(Sigma-Aldrich)中的胶原酶A(4mg/ml)(Roche)中消化。分离单纤维，铺板于层粘连蛋白包被的XF24微孔板上并在补充有1mM丙酮酸钠、5mM葡萄糖、33mM NaCl、15mg酚红、25mM HEPES、1mM的L-Glu的DMEM(D5030 Sigma-Aldrich)中在75μM的N-苄基-对甲苯磺酰胺(BTS，Sigma-Aldrich)的存在下培养。将纤维在37℃下在5％CO₂中的培养物中保持2小时。用XF24Extracellular Flux Analyzer(Agilent)实时评估氧气消耗速率，这允许测量在至多四次连续添加化合物之后的氧气消耗速率(OCR)变化。用解耦器FCCP进行滴定，以便利用最大化增加OCR的FCCP浓度(0.6μM)。为了测量橄榄苦苷或羟基酪醇对受刺激呼吸作用的效应，用10mM咖啡因刺激纤维。为了评估呼吸作用的ATP合酶依赖性组分，添加寡霉素(2μM)。针对钙黄绿素(Sigma-Aldrich)的荧光对结果进行归一化。用2μM钙黄绿素加载纤维保持30分钟。使用Perkin Elmer EnVision读板机以孔扫描模式测量荧光，该模式使用480/20nm滤光器进行激发并且使用535/20nm滤光器进行发射。如图13所示，橄榄苦苷增加分离的成年小鼠肌纤维中受刺激的线粒体呼吸作用和呼吸作用的ATP合酶依赖性组分。如图14所示，羟基酪醇增加分离的成年小鼠肌纤维中受刺激的线粒体呼吸作用和ATP合酶依赖性呼吸作用。

实施例6

为了测试橄榄苦苷对健康成年小鼠肌肉疲劳的效应，在立体显微镜下解剖从肌腱到肌腱的趾长伸肌(EDL)肌肉，并将其安装在小型腔室中的测力传感器(KG ScientificInstruments,Heidelberg,Germany)之间，在该腔室中连续循环含氧Krebs溶液并将温度保持在25℃。优化刺激条件，并且增加肌肉的长度直至90Hz刺激期间的力发展最大化。在测量第一力-频率关系之后，将橄榄苦苷以10μM的最终浓度添加到培养基中。接下来，在添加之后每10分钟直到一小时确定力-频率。一小时后，应用疲劳方案，该疲劳方案由每秒重复300ms的持续时间的120强直性收缩(100Hz)组成。疲劳被确定为相对于初始力的力减小。对于两个实验组，在10块肌肉中重复每个实验。如图15所示，与对照肌肉相比，在橄榄苦苷中温育的肌肉在疲劳期间显示出显著较慢的力减小，表明抗疲劳性增加。

实施例7

为了测试针对其橄榄苦苷含量标准化的橄榄叶提取物(≥40％橄榄苦苷)对通过丙酮酸脱氢酶(PDH)的去磷酸化进行的线粒体活化的效应，用(BioActor BV，NL)补充20个月大鼠3个月，然后通过Western分析腓肠肌。对PDH和磷酸-PDH的含量进行定量。为了监测蛋白质水平，使用Qiagen Tissue Lyser粉碎冷冻肌肉，并且在适当的缓冲液中制备蛋白质提取物，该缓冲液包含：肌肉裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、10％甘油、2％SDS、1％Triton X-100、不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM PMSF、1mM NaVO3、5mM NaF和3mMβ-甘油磷酸盐)。根据BCA定量加载40μg的总蛋白质。在商业4％-12％丙烯酰胺凝胶(Thermo Fisher Scientific)中通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并且通过湿电泳转移将蛋白质转移到硝化纤维膜(Thermo FisherScientific)上。将印迹在室温下用TBS-tween(0.5M Tris，1.5M NaCl，0.01％Tween)溶液中的5％脱脂奶粉(Bio-Rad)封闭1小时，并在4℃下与一抗一起温育。将二抗在室温下温育1小时。使用以下抗体：抗磷酸PDH(1:5000，Abcam)、抗PDH(1:1000，细胞信号传导)。HRP缀合的二抗购自Bio-Rad并且以1:5000稀释度使用。线粒体PDH的活化测量为总PDH和磷酸-PDH水平之间的比率。如图16所示，(BioActor BV，NL)，在补充有(BioActorBV，NL)3个月的老年大鼠中通过丙酮酸脱氢酶的去磷酸化促进线粒体活化，

参考文献

Alvarez,J.,&Montero,M.(2002).Measuring[Ca2+]in the endoplasmicreticulum with aequorin.Cell Calcium,32(5-6),251-260.

Montero,M.,Lobaton,C.D.,Hernandez-Sanmiguel,E.,Santodomingo,J.,Vay,L.,Moreno,A.,&Alvarez,J.(2004).Direct activation of the mitochondrial calciumuniporter by natural plant flavonoids.Biochem J,384(Pt 1),19-24.doi:10.1042/BJ20040990

应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明主题的实质和范围且不减弱其预期优点的前提下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。