具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验材料：

1、实验细胞株

人源HepG2肝癌细胞是购自中科院细胞典藏库。

2、实验干预物与造模物

实验中所用胆固醇和25-羟基胆固醇均购自美国Sigma-Aldrich公司，C3G及Cpycy-3-glu均为根据课题组前期实验基础进行自提得到。

3、引物使用信息

实施例中涉及到的引物序列见表1。

表1：PCR引物信息

所有引物均委托上海生工生物工程有限公司合成。

实验方法

一、细胞内总胆固醇含量测定

1、细胞内总胆固醇含量测定

根据总胆固醇(Total cholesterol，TC)试剂盒说明书完成，主要步骤如下：

(1)取对数生长期的HepG2细胞，消化离心重悬后于6孔板(5×105个/孔)铺板，每孔体系为2mL，过夜孵育于37℃细胞培养箱。

(2)铺板12h后，吸取旧的培养液弃掉，用PBS按1mL/次洗2遍，每组加入含有造模物或Ator或不同浓度的C3G和Cpycy-3-glu的细胞培养液，过夜孵育于37℃细胞培养箱。

(3)加药(C3G或Cpycy-3-glu或Ator+造模物)24h后，吸取旧的培养液弃掉，用PBS按1mL/次洗2遍，，再每孔加入胰酶300μL，在培养箱中孵育1min后转入超净台用900μL培养基终止消化。

(4)吹打并转移细胞到1.5mL EP管中，1000r/min离心3min。然后进行细胞计数。

(5)细胞计数完毕后，将计数完的管重复上述离心弃上清操作，按100μL裂解液/100万细胞，加入对应的细胞裂解液。

(6)将加入细胞裂解液的样品依次进行涡旋，每个样品30s，重复以上操作，样品置于冰上30min，使其充分裂解。

(7)吸取至少75μL静置后的上清转入新的1.5mL EP管(第1次转移)，金属浴70℃加热10min，低速离心机室温2000g离心5min，随后将之前的1.5mL EP管插冰盒上待用。

(8)小心吸取离心后的上清液，尽量不要带出细胞碎片，转移到新1.5mLEP管(第2次转移)，待用。

(9)取胆固醇试剂盒中5mM胆固醇标品，用无水乙醇稀释胆固醇标品，配制成0、39、78、156、312μM的梯度浓度，待用。

(10)避光条件下配制工作液。工作液按照R1:R2＝4:1体积比配制，涡旋混匀；将工作液加入96孔板中，每个孔先加入183μL工作液，再加入17μL的待测样品、空白对照(即无水乙醇)、不同浓度胆固醇标品，标曲每组两个复孔，待测样品组每组三个复孔。

(11)之后96孔板在37℃的恒温培养箱中避光孵育20min，并通过酶标仪震荡15s，在590nm下测定OD值，胆固醇含量根据胆固醇标准曲线和BCA结果计算。

2、细胞蛋白浓度的测定

(1)将新的1.5mL EP管做好标记，每管加36μL超纯水，将之前插于冰盒上的样品取4μL，转入EP管中最终稀释10倍，涡旋均匀待用。

(2)BCA工作液按照试剂A:试剂B＝50:1的体积比配制。

(3)将4mg/mL的蛋白标品以超纯水稀释配成0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL的梯度标品浓度。

(4)加样操作过程是先加样品再加工作液。样品每孔10μL，BCA工作液每个孔200μL；每个样品组设定三个复孔，标曲组两个复孔。

(5)在37℃恒温培养箱孵育30min，在测定前用酶标仪先震荡15s，562nm下测OD值，原样品的蛋白浓度根据标曲计算。

二、RNA提取及RT-PCR

1、参考湖南艾科瑞生物科技有限公司的RNA提取试剂盒说明书操作，主要试剂均来自于试剂盒，主要步骤如下：

(1)取对数生长期的HepG2细胞，消化离心重悬后在6孔板中铺板接种(5×105个/孔)，每个孔的总体系为1mL，过夜孵育在37℃细胞培养箱。

(2)铺板12h后，吸取旧的培养液弃掉，用PBS洗2遍，1mL/次，再向每个实验组中分别加入相应的造模物与Cpycy-3-glu的细胞培养基，过夜孵育在37℃细胞培养箱中。

(3)加药24h后，吸取旧的培养液弃掉，用PBS按1mL/次洗2遍，再每孔加入1mL的Trizol，为使其充分裂解，于冰上静置20min。

(4)裂解完毕后，吹打每个孔中的细胞，并分别转移至1.5mL的EP管中(此过程注意时间控制)，随后加入200μL的三氯甲烷，再将每个管涡旋15s，然后置于冰上5min。

(5)静置结束后，将所有样品于预冷好的高速低温离心机离心，4℃，12000g离心10min。离心结束后，小心取出EP管，取上层水相200μL，转入新的EP管中，(注：千万不要吸到下面的细胞碎片及其他杂质)。

(6)随后，向新的EP管中加入等倍体积(200μL)的异丙醇，涡旋15s，再静置10min。

(7)将静置好的样品再高速低温离心机离心，离心条件：12000g，4℃离心15min，即得到RNA沉淀。

(8)将现配制好的75％乙醇(用DEPC水和无水乙醇配制)加到沉淀中，轻轻摇晃洗涤沉淀。12000g，4℃离心15min后弃去75％乙醇。再重复一次上述操作。沉淀洗涤完成。

(9)将EP管倒扣于滤纸上进行晾干，大约晾45min，得到最终沉淀。

(10)根据具体沉淀量的多少加入40-100μL的DEPC水，溶解沉淀。

(11)分别从各个管中取2μL的RNA母液，用Nanodrop测定A260/A280纯度和RNA浓度。

2、RNA逆转录

实验使用艾科瑞公司的逆转录试剂盒合成cDNA，全过程冰上操作。

(1)去DNA反应

按照表2，根据计算结果加入RNase Free dH2O，再将5×gDNA Clean Buffer、gDNAEraser加入进行混合，最后根据最终计算结果加入不同量的RNA。混合后进行去DNA实验，反应条件：42℃，2min，4℃恒温待用。

表2：去DNA反应体系

(2)逆转录反应

按照表3将RNase Free dH₂O、Prime Script RT Enzyme MixⅠ、5×PrimeScriptBuffer 2和RT Primer Mix预先加在一起混合，再转入上一步反应的体系中。在PCR仪中进行逆转录。逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，5min，得到的cDNA样品分装后-80℃存放。

表3：逆转录反应体系

3、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

实验中使用艾科瑞公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行Real-time PCR实验。根据表4加样，依表5进行扩增。

表4：Real-time PCR反应体系

表5：两步法扩增标准程序

4、Real-time PCR结果处理

分析融解曲线和反应扩增曲线，导出数据，根据得到的Ct值，求得Ct(目的)-Ct(内参)＝ΔCt，再计算ΔΔCt及2-ΔΔCt。

三、蛋白免疫印迹(WesternBlot,WB)相关试剂

(1)10×SDS-PAGE电泳缓冲液分别称取甘氨酸150g，Tris-Base30g，SDS10g，加入去离子水定容至1000mL，充分混匀后常温保存待用。

(2)1×SDS-PAGE电泳缓冲液取10×SDS-PAGE电泳缓冲液200mL，加入去离子水1800mL，充分混匀后常温保存待用。

(3)10×SDS-PAGE转膜缓冲液分别称取甘氨酸144g，Tris-Base30g，加入去离子水定容至1000mL，充分混匀后常温保存待用。

(4)1×SDS-PAGE转膜缓冲液取10×SDS-PAGE转膜缓冲液160mL，加入去离子水1440mL，再加入400mL甲醇，充分混匀后置于4℃预冷待用。

(5)10×TBS溶液称取88g氯化钠粉末，加入去离子水1000mL，充分混匀后常温保存待用。

(6)1×TBS溶液取10×TBS溶液100mL，加入去离子水890mL及Tris-HCl(pH＝7.5)10mL配成1000mL溶液，充分混匀后室温保存待用。

(7)1×TBST溶液取10×TBS溶液100mL，加入去离子水890mL及Tris-HCl(pH＝7.5)10mL，再加入0.5mLTween-20，轻轻混匀后，室温保存待用。

(8)5％封闭液称取2.5g脱脂奶粉溶于50mLTBS溶液中，充分混匀后待用。

(9)1MTris-HCl(pH8.8)准确称取Tris6.06g，加入40mL超纯水溶解，用4MHCl调节pH至8.8，再用超纯水定容至50mL，4℃保存待用。

四、数据处理及统计分析

采用ClinxChemi Analysis软件对曝光后的Western Bolot条带进行处理分析，用Graph Pad Prism 8.0对实验的数据进行统计学的分析和图表展现，所有的数据结果以平均值±标准差(Mean±SD)来表示，在组间进行对比时采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。#p＜0.05,##p＜0.01,###p＜0.001,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,****p＜0.0001为具有统计学显著性差异。

结果与分析

1、C3G及Cpycy-3-glu对胆固醇调节作用

选取200μM的C3G和Cpycy-3-glu，10μM的阳性对照Ator以及40μM胆固醇+4μM 25-羟基胆固醇共同作用于HepG2，在细胞培养箱中孵育24h后，测定各组细胞内TC

结果表明，与造模组相比，阳性对照Ator组胞内TC含量显著下降(p＜0.0.1)，约降低44.07％，而C3G组虽然略有下降却并无显著性差异，但是Cpycy-3-glu的干预却让胞内TC含量显著下降(p＜0.05)，下降比例为33.33％左右(图2A)。

在0-200μM浓度间选取0、50、100、200μM的Cpycy-3-glu和10μM的Ator处理高胆固醇(40μM cholesterol+4μM 25-HC)状态下的HepG2细胞24h，而后测定各组TC含量。

结果表明，不同浓度的Cpycy-3-glu降胆固醇的能力呈现剂量依赖关系，在50μM时基本没有降胆固醇的效果，而当浓度达到100μM时，能使TC的含量降低10.44％左右，当浓度增加到200μM时，TC含量极显著下降(p＜0.0001)，下降幅度达30.46％(图2B)。

2、Cpycy-3-glu对肝脏胆固醇合成通路的调控

本实验采用不同浓度Cpycy-3-glu及Ator分别作用于高胆固醇状态下的HepG2细胞24h。

结果表明，在高胆固醇的HepG2细胞中，SREBP2的mRNA水平显著下调，而HMGCR虽然也有一定的下降趋势，却并没有显著性差异。表明胞内的高胆固醇水平环境会反馈性地抑制SREBP2和HMGCR的mRNA表达，而经过阳性对照物Ator及Cpycy-3-glu干预24h后，SREBP2的mRNA表达水平与造模组相比均出现显著上调，其中Cpycy-3-glu的上调效果呈剂量依赖关系，200μM的Cpycy-3-glu的效果与10μM的Ator效果持平，这可能和负反馈调节有关(图3A)。对于HMGCR，其mRNA表达水平均显著下调，Cpycy-3-glu的下调作用也呈现剂量相关关系(图3B)。与此同时，对HMGCR的蛋白表达水平进行分析，WB条带及作图结果说明，造模组HMGCR蛋白表达与对照组相比并没有差异，而Cpycy-3-glu作用后，出现了显著下降，该趋势与qPCR的结果一致(图3C-D)。以上结果说明Cpycy-3-glu可以通过抑制HMGCR基因的转录表达来降低肝脏胆固醇的内源性合成。

3、Cpycy-3-glu对肝脏胆固醇摄取通路的调控

LDLR是一种膜表面糖蛋白，通过囊泡内吞机制可以清除血浆中的LDL-C，对维持血胆固醇平衡有重要意义，而PCSK9是它的天然降解剂。通过qPCR和WB检测分析得出，HepG2细胞内的高胆固醇环境会促使LDLR以及PCSK9的mRNA水平显著降低，但是经Cpycy-3-glu干预后，LDLR的mRNA表达显著增加，逆转了高胆固醇造成的表达下调，而PCSK9的mRNA水平并无显著变化，说明Cpycy-3-glu可上调LDLR的基因表达，但是对于PCSK9的mRNA水平却并无影响(图4A-B)。对于蛋白结果，虽然造模组PCSK9的蛋白表达较对照组无变化，但是Cpycy-3-glu的干预可以显著下调其蛋白表达。对于LDLR，造模组的蛋白表达有了显著的下降，但是经Cpycy-3-glu干预后，LDLR的蛋白表达水平明显上调，说明Cpycy-3-glu可以促进LDLR的蛋白表达，其结果与qPCR一致(图4C-F)。以上说明Cpycy-3-glu在促进对血胆固醇的摄入清除中发挥重要作用。

4、Cpycy-3-glu对肝脏胆固醇转化外流通路的调控

ABCA1是一种ATP依赖的膜结合转运蛋白，介导胆固醇的向外流出以及胆固醇的逆向运输过程，被认为在抗动脉粥样硬化中有重要作用，而核受体PPARγ被认为是可以促进LDLR的表达来增强胆固醇代谢。结果表明，高胆固醇环境使PPAR的mRNA水平轻微降低，但是经过Cpycy-3-glu干预后PPARγ的mRNA表达有显著提升(图5A)。对于ABCA1，造模组的ABCA1mRNA水平较对照组有轻微的降低但无显著性差异，但经过阳性对照Ator以及Cpycy-3-glu干预后，mRNA的表达显著提升，且随着Cpycy-3-glu浓度的增加其表达也逐渐增强，200μM的Cpycy-3-glu效果与10μM的Ator基本持平，说明Cpycy-3-glu可通过上调ABCA1的mRNA的表达而增加胆固醇向胞外流出(图5B)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。