京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途
阅读说明：本技术 京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途 (Application of geniposide in preparation of medicine for treating oligospermia ) 是由 余建强 叶瑞娟 海冬梅 杨佳美 任佳玮 池彦南 刘宁 马琳 兰小兵 杜娟 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本申请提供了京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途。实验结果表明,京尼平苷能显著提高精子数量、活力以及降低精子畸形率；能显著抑制睾丸内部的内质网应激、升高线粒体膜电位、调节睾丸组织中相关蛋白表达,改善生精细胞的过度凋亡。(The application provides an application of geniposide in preparing a medicine for treating oligospermia. The experimental result shows that geniposide can obviously improve the number and the vitality of sperms and reduce the sperm aberration rate; can obviously inhibit endoplasmic reticulum stress in the testis, raise mitochondrial membrane potential, regulate the expression of relevant protein in testis tissue and improve the excessive apoptosis of spermatogenic cells.)
技术领域
本申请属于生殖系统疾病领域，具体地，本申请提供了京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途。
背景技术
据统计，在世界范围内约有15％-20％的育龄夫妇存在生育问题，并呈逐年上升趋势。在不能自然怀孕而寻求医学帮助的夫妻中至少有50％的男性存在精子问题。目前精子质量低下是引起引起男性不育的主要原因，其中少弱精子症大约占40％-75％。少弱精子症病因复杂，且往往不是由单一因素所致，其主要与药物、环境、遗传、内分泌、感染、疾病及生活方式有关。目前少弱精子症临床治疗常以经验治疗为主，但目前尚缺乏疗效确切的治疗药物。辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)虽然为少弱精子症的患者提供了生育的可能，但ART技术的成功率仍较低，妊娠率仅为4％-40％，且子代出生缺陷的风险高于自然妊娠。因此研发安全有效的治疗少弱精子症的药物具有重大的社会价值和研究意义。
杜仲为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，《神农本草经》称：“杜仲，主腰脊痛，补中益精气，坚筋骨，强志”。杜仲对于男性生殖系统损伤具有很好的保护作用。京尼平苷(GP,Geniposide)作为杜仲环烯醚萜类主要成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗少弱精子症、抗氧化等多种药理作用。京尼平苷的分子式为C17H24O10，相对分子质量为388.37，常温下为白色结晶状，熔点163-164℃，易溶于水。近年来，国内外研究发现京尼平苷可以缓泻、镇痛、利胆、抗炎、治疗软组织损伤以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用。但关于其治疗少弱精子症的作用目前未见文献报道。因此将其发展为治疗少弱精子症药物具有极高的潜在价值与社会意义。
发明内容
本发明的目的是通过对京尼平苷的药理作用研究，发现京尼平苷能提高少弱精子症小鼠模型的精子数量、活力、生殖器官脏器系数并降低精子畸形率，从而提供京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途。
一方面，本发明提供了京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途，所述京尼平苷的结构式如式(1)所示：
进一步地，所述药物中京尼平苷为唯一活性成分。
进一步地，所述少弱精子症为生精功能损伤。
进一步地，所述少弱精子症为精子数量和活力低下和精子畸形。
进一步地，所述药物为注射或者口服剂型。
进一步地，所述药物为口服剂型。
另一方面，本发明提供了增强生精功能和精子活力的非治疗方法，包括施用京尼平苷。
进一步地，京尼平苷单次应用剂量为6.25-12.5mg/kg。
进一步地，京尼平苷单次应用剂量为12.5-25mg/kg。
进一步地，京尼平苷单次应用剂量为25mg/kg。
本申请中的非治疗方法包括但不限于保健方法以及科学研究方法，实施对象可以为人或其他哺乳动物如鼠、兔、犬等。
本申请中少弱精子症的症状或指症包括但不限于生精功能损伤、精子数量和活力低下和精子畸形，睾丸组织中的内质网应激，线粒体膜电位降低，生精细胞凋亡。
本申请的可用的药物剂型包括各种注射和口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂、透皮给药制剂，特别优选口服剂型。
除京尼平苷外，本申请中所述的药物还可以包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等，特别优选可用于口服剂型的各种辅料/赋形剂。
本发明的药物中可以包含其他治疗少弱精子症的中西药药物或保健品，或者本发明的药物可以与这些中西药药物或保健品或手术等治疗手段联合使用。所述中西药药物或保健品包括但不限于抗感染药物、促性腺激素类药物、抗氧化剂类药物、能量代谢和血液循环改善剂。
本发明提供的京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途具有以下有益效果：
(1)京尼平苷能显著提高精子数量、活力以及降低精子畸形率；
(2)京尼平苷能抑制睾丸内部的内质网应激、升高线粒体膜电位、降低睾丸组织中的GRP78、CHOP、BAX、Cytc、caspase3蛋白的表达以及升高睾丸组织中的Bcl-2蛋白表达，改善生精细胞的过度凋亡。
本发明首次证实，京尼平苷具有治疗少弱精子症小鼠的作用，可用于制备少弱精子症的治疗药物，为此类药物提供了一种新的选择。
附图说明
图1为京尼平苷对少弱精子症小鼠精子参数的影响图；A：精子数量(x107)；B：精子活力(％)；C：精子畸形率；结果以Mean±SEM(n＝10)表示，***p<0.001与正常组比较,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001与模型组比较。
图2为京尼平苷对少弱精子症小鼠DNA损伤的影响及彗星评分统计图，a:空白对照组；b:模型组；c:模型+阳性药物组；d:模型+京尼平苷6.25mg/kg组；e:模型+京尼平苷12.5mg/kg组；f:模型+京尼平苷25mg/kg组；A:彗星尾部面积、B:尾部DNA含量、C:尾部DNA占总DNA含量百分比、D:尾长、E:Olive尾矩、F:尾矩，结果以mean±SEM(n＝10)表示，***p<0.001表示与正常组比较，#p<0.05,###p<0.001表示与模型组比较。
图3为京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸内的内质网应激的影响图：A:小鼠睾丸ThT染色代表性图像；B:荧光密度统计图；a:空白对照组；b:模型组；c:模型+京尼平苷25mg/kg组，结果以mean±SEM(n＝6)表示.***p<0.001表示与正常组比较,###p<0.001表示与模型组比较。
图4为京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸内线粒体膜电位的影响图：A:小鼠睾丸TMRM染色代表性图像；B:荧光密度统计图；a:空白对照组；b:模型组；c:模型+京尼平苷25mg/kg组，结果以mean±SEM(n＝6)表示.***p<0.001表示与正常组比较,###p<0.001表示与模型组比较。
图5为京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸组织中Cytc表达水平的影像图：A:京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸组织内Cytc免疫荧光染色代表性图像；B:Cyt荧光密度统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.***p<0.001表示与正常组比较,###p<0.001表示与模型组比较。
图6为京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸组织中GRP78、CHOP、BAX、Bcl-2、caspase3表达水平的影响图：A：不同组睾丸组织中GRP78和CHOP的代表性蛋白质印迹分析图；B：GRP78和CHOP蛋白表达统计图；C：不同组睾丸组织中BAX、Bcl-2和caspase3的代表性蛋白质印迹分析图；B：BAX、Bcl-2和caspase3蛋白表达统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示与正常组比较,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001表示与模型组比较。
图7为京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸组织中睾丸细胞凋亡的影响图：A：京尼平苷对少弱精子症小鼠睾丸组织TUNEL染色代表性图像；B：TUNEL阳性细胞统计图；结果以mean±SEM(n＝6)表示.***p<0.001表示与正常组比较,###p<0.001表示与模型组比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的京尼平苷均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。
实施例1
京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途，其中，京尼平苷单次应用剂量为小鼠6.25mg/kg，药物的剂型为口服剂型。
实施例2
京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途，其中，京尼平苷单次应用剂量为小鼠12.5mg/kg，药物的剂型为口服剂型。
实施例3
京尼平苷在制备治疗少弱精子症药物中的用途，其中，京尼平苷单次应用剂量为小鼠25mg/kg，药物的剂型为口服剂型。
下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：
一、实验材料
1.1动物处理
体重23-27g之间的SPF级ICR雄性成年小鼠，宁夏医科大学实验动物中心繁殖(动物孵育合格批号：SCXK(宁)2017-0001)。动物饲养参照实验动物饲养标准，饲养房12h人工控制昼夜交替，小鼠自由饮水。
1.2实验药品及仪器
本实验中会涉及到的主要药品和试剂包括：京尼平苷(购自上海源叶生物公司，纯度≥98％)；左卡尼汀(购自美国Alfasigma公司)；环磷酰胺(购自江苏盛迪医药有限公司)；生理盐水(购自天津大茂化学试剂厂)；龙胆紫(购自上海源叶生物公司)；碘化丙啶(购自美国Sigma公司)；硫磺素T(购自上海源叶生物公司)；TMRM线粒体膜电位试剂盒(购自上海贝博科技有限公司)；兔抗GRP78、CHOP、BAX、Cytc、caspase3、Bcl-2、β-actin、FITC山羊抗兔(购自美国proteintech公司)；DAPI(购自北京中杉金桥生物科技公司)；TUNEL试剂盒(购自德国Roche公司)；全蛋白提取试剂盒(购自南京凯基生物公司)；全蛋白定量试剂盒(购自南京凯基生物公司)；脱脂奶粉(购自北京索莱宝科技公司)；PVDF膜(购自美国Millipore公司)；ECL发光液(购自Advansta公司)；Marker(10-180KDa)(购自Thermo fisher)；羧甲基纤维素钠(购自北京索莱宝有限公司)；
本实验中会涉及到的主要仪器包括：血球计数板(购自上海求精玻璃仪器厂)；酶标仪(购自Thermo scientific)；电热恒温水浴锅(购自上海精密实验设备有限公司)；全自动样品冷冻研磨仪(购自上海净信科技有限公司)；SDS-PAGE电泳仪(购自美国Bio-RAD公司)；可见荧光成像仪(购自美国Auzre Biosystems)；电热恒温鼓风干燥箱(购自上海琅玕实验设备有限公司)；荧光显微镜(OLYMPUS)；光学显微镜(OLYMPUS)；电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(德国Eppendorf)。
1.3实验动物分组及给药
1.3.1少弱精子症小鼠模型建立
体重18-22g之间的雄性成年ICR小鼠清洁级饲养间适应性喂养1周后，按体重梯度抽样法将其平均分至对照组和模型组，每天早上称取小鼠体重，模型组腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)60mg/kg，连续给5天，即造成少弱精子症模型。
1.3.2实验分组
造模成功小鼠按体重均匀分为：模型组、模型+阳性药左卡尼汀组，模型+京尼平苷(12.5、25、50mg/kg)组。各组动物除正常饲养外，模型+左卡尼汀组给予左卡尼汀(3.03ml/kg)灌胃，模型+京尼平苷组给予京尼平苷(12.5、25、50mg/kg)灌胃，每组20只。左卡尼汀组和京尼平苷各给药剂量组于每天上午固定时间点连续给药4周，对照组和模型组小鼠均给予相同容量的生理盐水；以每0.1ml/10g的给药容积灌胃给药；其余实验条件相同。
二、实验过程
(一)脏器系数测定
1.1实验方法：
最后一次给药24h后称重并记录各组小鼠体重。实验结束后，处死小鼠，用手术剪迅速剪开小鼠腹部，充分暴露双侧睾丸，除去周围的脂肪组织及结缔组织，取出睾丸、附睾以及精囊腺，吸干表面的血液后用电子天平准确称取其重量。
1.2实验结果：
结果如表1所示，模型组小鼠生殖器官睾丸，附睾和精囊腺的脏器系数与正常组相比显著下降(p<0.001)。给予京尼平苷(6.25、12.5、25mg/kg)治疗的小鼠生殖器官的脏器系数比显著增加(p<0.01,p<0.001)，左卡尼汀治疗组也显著增加了生殖器官的脏器系数比(p<0.01,p<0.001)。提示京尼平苷对少弱精子症小鼠生殖器官有一定的改善作用。
表1京尼平苷对少弱精子症小鼠生殖器官脏器系数的影响
***p<0.001与正常组比较,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001与模型组比较
(二)精子参数测定
2.1实验方法：
精子数目：将盛有2ml生理盐水的小平皿置于恒温水浴箱内预热至37℃，将小鼠右侧附睾尾称重并在小平皿剪碎水浴5分钟，得到的精子原浆用生理盐水稀释5倍，在400倍光镜下计数血细胞计数板上4大格精子的数量并计算。
精子活力：半定量法评估精子活力，每个样本取10μl稀释5倍后的精子混悬液，400倍光镜下观察大约100个精子的游动情况，计算游动精子的比例。
精子畸形率：精子原浆采用0.05％龙胆紫染色，记录光镜十个视野里精子的形态变化，其中(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等)、尾部中段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双尾)、尾部主段畸形，然后分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可计为畸形精子。
2.2实验结果：
精子参数结果如图1显示，模型组小鼠精子数量及精子活力与正常组相比显著下降(p<0.001)，精子畸形率显著升高(p<0.001)，而给予京尼平苷(6.25、12.5、25mg/kg)治疗后，小鼠精子数量及精子活力与模型组相比显著提高，精子畸形率显著下降(p<0.05,p<0.01,p<0.001)(图1)，提示京尼平苷对于少弱精子症小鼠的精子质量有很好的保护作用。
(三)睾丸细胞DNA损伤的变化
3.1实验方法：
睾丸用PBS冲洗后，去除被膜，剪碎后适量PBS过200目筛，吹打混匀后使成细胞悬液，取适量细胞悬液与0.8％低熔点琼脂糖混匀(每100μL中含103-104个细胞)后加到浇注过正常熔点琼脂糖的载玻片上，4℃固化15min。固化结束后将载玻片放入新配制的细胞裂解液中，4℃条件下避光裂解2h。裂解完毕后，PBS浸泡载玻片3次(5min/次)，再于新配制的电泳缓冲液中避光裂解30min后200mA，电泳30min。电泳结束后用PBS浸泡玻片3次(5min/次)，用吸水纸稍吸干多余的水分，滴加碘化丙啶染料(100μg/mL)避光染色10min，再用PBS浸泡玻片，吸水纸吸干水分后加盖玻片，于荧光显微镜下观片、采片。之后采用CASP彗星分析软件计算Tail Area、Tail DNA、Tail DNA(％)、Tail Length等相关参数，综合评价DNA损伤程度。
3.2实验结果
由图2可以看出，在对照组(图2a)中可以观察到精子细胞拖尾较短，尾部区域面积的比例也非常低，尾距也相对较小，表明细胞损伤较小。在模型组(图2b)中观察到最大的尾部区域面积比例、最长拖尾细胞及尾距，表明精子细胞损伤较为严重。给予京尼平苷(图2d、图2e、图2f)(6.25、12.5、25mg/kg)治疗后，与模型组相比较，精子细胞拖尾明显降低，尾部面积明显减少，尾距明显缩短，表明给予京尼平苷治疗后精子DNA损伤明显改善，在左卡尼汀治疗组中同样可以看到较小的尾部面积和尾距，精子DNA损伤得到恢复(图2c)。由统计图可以看出，与对照组相比，模型组中睾丸细胞损伤后形成的彗星尾部面积(图2A)、尾部DNA含量(图2B)、尾部DNA占总DNA含量百分比(图2C)、尾长(图2D)、Olive尾矩(图2E)以及尾矩(图2F)均显著增加(p<0.001)；与模型组相比，给予京尼平苷处理后以上指标均显著降低(p<0.05,p<0.001)(图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F)。
(四)内质网应激指标检测
4.1实验方法：
新鲜冷冻的小鼠睾丸切片，收集到盖片上，并保存在-20℃。在ThT染色之前，切片解冻5分钟，然后固定在37％甲醛中2分钟。用水冲洗切片两次后，在室温下用新鲜过滤的溶解在PBS 500μM ThT中培养3分钟后水中冲洗3分钟。为了保持荧光，在载玻片上涂上2滴放荧光淬灭剂，并在成像前盖上盖片。在荧光显微镜(400×)下比较各组荧光密度的变化。
4.2实验结果：
由图3A可以看出，在对照组(图3a)中可以观察到ThT荧光强度弱，表明睾丸内的内质网应激程度弱。在模型组(图3b)中观察到及强的ThT荧光，表明睾丸内的内质网应激程度强。给予京尼平苷(图3c)(25mg/kg)治疗后，观察到ThT荧光强度减弱，表明睾丸内的内质网应激程度收到抑制。根据荧光强度统计图(图3B)可以看出，与正常组相比较，ThT荧光密度显著上升；给予京尼平苷(25mg/kg)治疗后，与模型组相比较，ThT荧光密度显著下降，表明给予京尼平苷治疗后睾丸内的内质网应激明显改善。
(五)线粒体膜电位的检测
5.1实验方法：
新鲜冷冻的小鼠睾丸切片，收集到盖片上，并保存在-80℃。在进行四甲基罗丹明甲基酯(TMRM)法测线粒体膜电位之前，切片解冻20分钟，然后固定在4％甲醛中20分钟。用PBS冲洗切片三次。室温下用现配TMRM染色液A:探针稀释液B(1:9)用PBS稀释5000倍后放入玻片培养3分钟，之后用PBS冲洗玻片3分钟。为了保持荧光，在载玻片上涂上2滴放荧光淬灭剂，并在成像前盖上盖片。在荧光显微镜(400×)下比较各组荧光密度的变化。
5.2实验结果：
由图4A可以看出，在对照组(图4a)中可以观察到很强的红色荧光，表明睾丸内的线粒体健康。在模型组(图4b)中观察到很弱的红色荧光，表明睾丸内的线粒体受到损伤。给予京尼平苷(图4c)(25mg/kg)治疗后，观察到睾丸内红色荧光强度增强，表明睾丸内受损的线粒体恢复健康。根据线粒体膜电位统计图(图4B)可以看出，与正常组相比较，线粒体膜电位显著下降；给予京尼平苷(25mg/kg)治疗后，与模型组相比较，线粒体膜电位显著上升，表明给予京尼平苷治疗后睾丸内的线粒体损伤明显改善。
(六)睾丸组织Cytc蛋白的表达
6.1实验方法：
采用免疫荧光检测睾丸组织Cytc蛋白的表达。新鲜冷冻的小鼠睾丸切片，收集到盖片上，并保存在-80℃。在进行免疫荧光分析之前，切片解冻20分钟，然后固定在4％甲醛中20分钟。用PBS冲洗切片三次后加入山羊血清封闭10分钟。将Cytc抗体采用1:800的比例用PBS稀释后，滴加在玻片上并于4℃冷藏过夜。之后玻片用PBS冲洗三次后，避光加入FITC荧光二抗(1:100)于37℃避光孵育30分钟。最后滴加DAPI封片剂封片后于荧光显微镜(400×)下比较各组荧光密度的变化。
5.2实验结果：
由图5A可以看出，在对照组中可以观察到Cytc表达较弱，在模型组中观察到Cytc表达及强并高表达于间质细胞。给予京尼平苷(25mg/kg)治疗后，观察到睾丸内Cytc表达减弱。根据荧光密度统计图(图5B)可以看出，与正常组相比较，Cytc荧光密度显著上升；给予京尼平苷(25mg/kg)治疗后，与模型组相比较，Cytc荧光密度显著下降，表明给予京尼平苷治疗后可以抑制Cytc的表达水平。
(七)Western blot检测小鼠睾丸组织GRP78、CHOP、BAX、Bcl-2、caspase3蛋白的表达6.1实验方法：
使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将硝酸纤维素膜(PVDF膜)进行湿法转膜。转膜结束后将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭2h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗GRP78(1:5000)、CHOP(1:600)、BAX(1:2000)、Bcl-2(1:2000)、caspase3(1:1000)，4℃过夜，洗膜孵育二抗2h。用PBST洗膜3次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)进行曝光。采用Image J图像分析软件计算目标蛋白的灰度值，并利用相对应的内参灰度值校正误差。
6.2实验结果：
如图6所示，与正常对照组比较，模型组睾丸中GRP78、CHOP、BAX、caspase3蛋白表达明显增多(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，Bcl-2蛋白表达明显减少(p<0.05)；京尼平苷(25mg/kg)组小鼠睾丸组织GRP78、CHOP、BAX、caspase3蛋白表达与模型组比较明显减少(p<0.05,p<0.01,p<0.001)，Bcl-2蛋白表达明显增多(p<0.01)；提示京尼平苷的保护作用可能通过GRP78、CHOP、BAX、caspase3、Bcl-2蛋白的表达与活化，保护内质网和线粒体的完整性，从而对少弱精子症产生保护作用。
(八)TUNEL试剂盒检测生精细胞的凋亡情况
如图7所示，与正常对照组比较，模型组睾丸中凋亡细胞表达明显增多(p<0.001)，京尼平苷(25mg/kg)组小鼠睾丸组织中凋亡细胞表达与模型组比较明显减少(p<0.001)；提示京尼平苷的保护作用可能通过抑制睾丸组织内细胞的过度凋亡，从而对少弱精子症产生保护作用。