基于循环肿瘤dna的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测t细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用
阅读说明：本技术 基于循环肿瘤dna的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测t细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用 (Application of tumor mutation load detection reagent based on circulating tumor DNA in preparation of T cell lymphoma prognosis prediction kit ) 是由 李扬秋 陈存特 黄玲 陈政 欧秋翔 刘思初 江新苗 陈菲莉 魏小娟 郭汉国 邵阳 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了基于循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测T细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用。本发明发明人首次发现T细胞淋巴瘤患者血浆循环肿瘤DNA中13个基因外显子突变计算的肿瘤突变负荷(panel-TMB13)与T细胞淋巴瘤患者的预后相关。当发现panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时,TCL患者预后差的可能性较大。本发明还发现panel-TMB13联合国际预后指数构建的危险分层,比现有的基于国际预后指数的危险分层的更好,可以对TCL患者进行更精确地危险分层,对于TCL患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。(The invention provides an application of a tumor mutation load detection reagent based on circulating tumor DNA in preparation of a kit for predicting T cell lymphoma prognosis. The inventor of the present invention found for the first time that the tumor mutation load (panel-TMB13) calculated from the mutation of 13 gene exons in the plasma circulating tumor DNA of a patient with T-cell lymphoma was correlated with the prognosis of the patient with T-cell lymphoma. When a non-synonymous mutation of greater than 2 exons was found in panel-TMB13, there was a greater likelihood of a poor prognosis for TCL patients. The invention also finds that the risk stratification constructed by combining the panel-TMB13 with the international prognostic index is better than the existing risk stratification based on the international prognostic index, can carry out more accurate risk stratification on TCL patients, and has important guiding significance for prognosis judgment and clinical treatment scheme formulation of the TCL patients.)
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别涉及基于循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测T细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用。
背景技术
T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma，TCL)起源于淋巴母细胞或成熟T细胞，是一种高度侵袭性和异质性的疾病。TCL占非霍奇金淋巴瘤的10-15％，可进一步细分为许多亚型。目前的治疗方案，如化疗、放疗、靶向治疗等，可以提高TCL患者的完全缓解率；然而，他们中的大多数仍然由于复发和进展而导致预后较差，部分的原因是与TCL的异质性有关。这种异质性表现在临床水平和遗传学上。然而，目前基于临床数据的国际预后指数(internationalprognosis index,IPI)的风险分层，包括年龄、分期、体能状态、血清乳酸脱氢酶(serumlactate dehydrogenase，LDH)水平和结外受累程度，无法准确预测所有TCL患者预后。事实上，突变基因的检测可以准确地对急性白血病患者进行危险分层，但遗传学在TCL患者危险分层中的重要性尚不清楚。
因为在临床上相比原位肿瘤组织，外周血样本更容易获得；因此，血液样本可以作为原位组织的替代品来监测癌症患者的预后。在癌症患者中，凋亡和坏死的癌细胞会将循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)释放到外周血中，这些ctDNA携带肿瘤特异性分子改变。越来越多的证据表明ctDNA测序是监测癌症进展和预后的一种很有前景的方法，并已在各种实体瘤中得到证实。最近，有研究者探讨了ctDNA在预测淋巴瘤预后中的重要性。结果表明，ctDNA和原位肿瘤组织DNA的分析在NK/T细胞淋巴瘤(NK/T-cell lymphoma，NKTCL)中显示出良好的一致性，并且ctDNA在使用全基因组测序(whole-exomesequencing,WES)监测残留病变和预测患者预后方面具有更多优势。此外，血浆ctDNA中的RHOA(ras homolog family member A)突变与外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-celllymphoma，PTCL)患者的进展显著相关。值得注意的是，我们之前的研究表明，在T淋巴母细胞淋巴瘤(T-Cell Lymphoblastic Lymphoma，T-LBL)患者中，较高频率的ctDNA与较高的LDH和IPI评分呈正相关。然而，由于全外显子测序(WES)的成本及其在临床环境中的及时性和信息学方面的挑战；因此，很难在临床上推广。取而代之的是，现在临床上更常见的是应用包含较少数量基因的面板来对癌症患者进行精确地危险分层。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供基于循环肿瘤DNA中基因组合外显子非同义突变的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测T细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用。是基于本发明的发明人首次发现T细胞淋巴瘤患者血浆循环肿瘤DNA中13个基因外显子突变计算的肿瘤突变负荷(panel-TMB13)与T细胞淋巴瘤患者的预后相关，可以作为预测T细胞淋巴瘤患者预后评估的指标。
本发明的另一目的在于提供一种预测T细胞淋巴瘤预后的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
基于循环肿瘤DNA中基因组合外显子非同义突变的肿瘤突变负荷检测试剂在制备预测T细胞淋巴瘤预后试剂盒中的应用；
所述的基因组合由如下基因组成：TET2(Gene ID:54790)、ATM(Gene ID:472)、NF1(Gene ID:4763)、JAK1(Gene ID:3716)、BRAF(Gene ID:673)、STAT5B(Gene ID:6777)、AP3B1(Gene ID:8546)、BCL6(Gene ID:604)、MDM2(Gene ID:4193)、STAT6(Gene ID:6778)、CDKN2B(Gene ID:1030)、FBXO11(Gene ID:80204)、EPCAM(Gene ID:4072)。
在所述的应用中，通过检测临床患者的血浆循环肿瘤DNA中基因组合外显子突变情况，并根据基因组合外显子突变情况计算肿瘤突变负荷，从而预测T细胞淋巴瘤预后。
所述的预测具体指：
①当panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时，T细胞淋巴瘤患者总体生存差的可能性较大；
②当panel-TMB13小于或等于2个外显子非同义突变时，T细胞淋巴瘤患者总体生存好的可能性较大；
③当panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时，T细胞淋巴瘤患者无进展生存差的可能性较大；
④当panel-TMB13小于或等于2个外显子非同义突变时，T细胞淋巴瘤患者无进展生存好的可能性较大。
所述的总体生存差是指3年总体生存率等于0％。
所述的总体生存好是指3年总体生存率大于51％。
所述的无进展生存差是指3年无进展生存率等于0％。
所述的无进展生存好是指3年无进展生存率大于42％。
用于第一检测物的检测试剂联合用于第二检测物的检测试剂在制备T细胞淋巴瘤危险分层试剂盒中的应用；
所述的第一检测物为基于循环肿瘤DNA中基因组合外显子非同义突变的肿瘤突变负荷；所述的基因组合由如下基因组成：TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11、EPCAM；
所述的第二检测物为国际预后指数(international prognosis index,IPI)；
在所述的应用中，包括如下步骤：
S1、检测临床患者的循环肿瘤DNA中基因组合外显子突变情况，并根据基因组合外显子突变情况计算肿瘤突变负荷panel-TMB13；
S2、在R语言软件中通过输入panel-TMB13、生存状态和生存时间建立列线图模型，获得基于panel-TMB13的评分1；
S3、根据国际预后指数获得评分2；
S4、依据评分1和评分2的分数总和对临床患者进行危险分层；
所述的危险分层具体指：
①当0≤分数总和≤49，为低风险组；
②当49＜分数总和＜176，为中风险组；
③当分数总和≥176，为高风险组；
所述的低风险是指2年总体生存率大于57％，2年无进展生存率大于48％；
所述的中风险是指2年总体生存率大于等于23％且小于等于57％，2年无进展生存率大于15％且小于等于48％。
所述的高风险是指2年总体生存率小于23％，2年无进展生存率小于15％。
进一步地，所述的肿瘤突变负荷的检测的样本为临床患者的外周血。
进一步地，所述的非同义突变为如下突变情况的至少一种情况或多种情况的组合：错义突变、剪切突变、移码突变、截短突变、非移码缺失突变、非移码插入突变、拷贝数缺失。
进一步地，所述的试剂盒包含用于血浆循环肿瘤DNA提取的试剂、外显子测序的试剂中的任意一种或至少两种。
所述的用于血浆循环肿瘤DNA提取的试剂优选为Qiagen的QIAamp循环核酸提取试剂盒中的试剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明采用提取血浆DNA和外显子测序方法检测TCL患者外周血中循环肿瘤DNA中13个基因TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11和EPCAM的外显子突变情况，首次发现血浆循环肿瘤DNA中13个基因外显子突变计算的肿瘤突变负荷(panel-TMB13)与TCL患者的临床预后有关。panel-TMB13对于TCL患者的预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。
2.本发明可为TCL患者的应用靶向治疗提供更多的临床预后研究资料，在预测TCL患者预后评价及靶向药物应用方面具有广阔的应用前景。
3.本发明使用提取血浆DNA和外显子测序方法检测TCL患者外周血中循环肿瘤DNA中13个基因TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11和EPCAM的外显子突变情况，该方法简单易行，方法稳定。当检测到panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时，TCL患者预后差的可能性较大，可以作为预测TCL患者预后评估的指标。
4.本发明首次发现血浆循环肿瘤DNA中13个基因外显子突变计算的肿瘤突变负荷(panel-TMB13)联合国际预后指数构建的危险分层，比现有的基于国际预后指数的危险分层的更好，可以对TCL患者进行更精确地危险分层。
附图说明
图1是panel-TMB13对初发TCL患者总体生存和无进展生存的影响分析图；其中，图(A)为总体生存分析图，图(B)为无进展生存分析图。
图2是panel-TMB13和国际预后指数联合构建的列线图模型对初发TCL患者1年、2年和3年总体生存率和无进展生存率的预测和可视化图。
图3是panel-TMB13和国际预后指数联合构建的危险分层与现有的基于国际预后指数的危险分层的比较；其中，图(A)、(B)分别为panel-TMB13和国际预后指数联合对初发TCL患者总体生存和无进展生存的影响分析图；图(C)、(D)分别为国际预后指数对初发TCL患者总体生存和无进展生存的影响分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂信息具体如下：
血浆循环肿瘤DNA提取试剂盒(购自Qiagen)；
外显子测序仪(南京世和基因公司的Illumina HiSeq 4000测序仪)。
实施例1
(1)在与患者签署知情同意书的前提下采外周血。收集广东省人民医院淋巴瘤科79例初发TCL患者成人外周血样本，所有标本取自于入院时的外周血肝素抗凝，该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集TCL患者生存时间和生存状态等临床资料。
(2)血浆循环肿瘤DNA提取
2.1将血液样品加入到50mL离心管中，3000g离心5-10分钟，吸取上层10mL血浆于新的50mL离心管中；
2.2向管中加入1mL QIAGEN Proteinase K；
2.3添加8mL缓冲液ACL，充分混匀30秒；
2.4在60℃下孵育30分钟；
2.5向管中的裂解物中加入18mL缓冲液ACB，充分混匀15-30秒；
2.6将管中的裂解液-缓冲液ACB混合物在冰上孵育5分钟；
2.7将QIAamp Mini柱插入到QIAvac 24Plus上的VacConnector中，将20mL的试管扩展器插入到打开的QIAamp Mini柱中；
2.8将步骤2.6中的裂解液-缓冲液ACB混合物加入QIAamp Mini柱的管扩展器中，打开真空泵；当所有裂解液完全通过柱子时，关闭真空泵并将压力释放到0毫巴；小心地取下并丢弃管延长器；
2.9将600μL缓冲液ACW1加到QIAamp Mini柱上；打开柱子的盖子，打开真空泵；当所有缓冲液ACW1通过QIAamp Mini柱后，关闭真空泵并将压力释放至0毫巴；
2.10将750μL缓冲液ACW2加到QIAamp Mini柱上，打开柱子的盖子，打开真空泵；当所有缓冲液ACW2通过QIAamp Mini柱后，关闭真空泵并将压力释放至0毫巴；
2.11将750μL乙醇(96-100wt％)加到QIAamp Mini色谱柱上，打开柱子的盖子，打开真空泵；当所有乙醇通过旋转柱后，关闭真空泵并将压力释放至0毫巴；
2.12关闭QIAamp Mini色谱柱的盖子；从真空歧管上取下它，并丢弃VacConnector；将QIAamp Mini柱放入干净的2mL收集管中，全速(20,000g或14,000rpm)离心3分钟；
2.13将QIAamp Mini Column放入新的2mL收集管中；打开盖子，将组件在56℃下孵育10min，使膜完全干燥；
2.14将QIAamp Mini柱放入干净的1.5mL洗脱管中，并丢弃步骤2.13中的2mL收集管；将20-150μL缓冲液AVE加到QIAamp Mini膜的中心；盖上盖子，在室温下孵育3分钟；
2.15在微量离心机中全速(20,000g或14,000rpm)离心1分钟以洗脱DNA。
(3)外显子测序及基因突变的鉴定
血浆DNA送南京世和基因公司在Illumina HiSeq 4000测序仪上进行外显子测序和分析，确定13个基因TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11和EPCAM的外显子突变情况。
13个基因TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11和EPCAM的外显子突变情况如表1所示，以及TCL患者临床预后资料如表2所示。根据13个基因的外显子突变情况计算肿瘤突变负荷。
将panel-TMB13结合TCL患者临床预后资料进行分析，在R语言软件(4.0.2版,https://www.r-project.org/)中通过输入panel-TMB13、生存状态和生存时间，用“survival”R软件包绘制生存曲线。发现当panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时，TCL患者总体生存差的可能性较大；当panel-TMB13小于或等于2个外显子非同义突变时，TCL患者总体生存好的可能性较大(图1(A))。当panel-TMB13大于2个外显子非同义突变时，TCL患者无进展生存差的可能性较大；当panel-TMB13小于或等于2个外显子非同义突变时，TCL患者无进展生存好的可能性较大(图1(B))。
将panel-TMB13结合TCL患者临床预后资料进行分析，在R语言软件(4.0.2版,https://www.r-project.org/)中通过输入panel-TMB13、生存状态和生存时间建立列线图模型；同时根据国际预后指数对临床患者进行评分。其中，国际预后指数的评分标准如表3所示。
panel-TMB13和国际预后指数联合构建的列线图模型可以个性化可视化地预测初发TCL患者1年、2年和3年总体生存率和无进展生存率(图2)。值得注意的是，基于列线图模型中的分数，TCL患者被分为低、中和高风险组，其中小于或等于49分为低风险组，大于49分且小于176分为中风险组，大于或等于176分为高风险组(图3)。中危组比低危组患者的总体生存差(P＝0.009)，以及高危组比中危组患者的总体生存差(P＝0.002)(图3(A))；同时，中危组比低危组患者的无进展生存差(P＝0.025)，以及高危组比中危组患者的无进展生存差(P<0.001)(图3(B))。虽然国际预后指数2-3分比国际预后指数0-1分组的患者总体生存差(P＝0.047)，但是国际预后指数4-5分与国际预后指数2-3分组的患者总体生存无显著差异(P＝0.069)(图3(C))。同时，国际预后指数2-3分与国际预后指数0-1分组的患者无进展生存无显著差异(P＝0.093)，但是国际预后指数4-5分比国际预后指数2-3分组的患者无进展生存差(P＝0.022)(图3(D))。总的来说，panel-TMB13和国际预后指数联合构建的危险分层比现有的基于国际预后指数的危险分层的更好。
为了明确性别、年龄、TCL亚型或治疗方案是否影响了panel-TMB13对总体生存率OS和无进展生存率FPS的预测作用，我们进行了单因素和多因素COX回归分析。结果显示，panel-TMB13是OS(HR＝7.04，95％CI：2.64至18.79，P<0.001)和PFS(HR＝4.15，95％CI：1.77至9.73，P＝0.001)的独立预测因子，panel-TMB13对OS和PFS的预测作用是不受性别、年龄、TCL亚型或治疗方案的影响。
上述实验结果表明panel-TMB13在预测TCL临床预后的评估中具有重要意义，其为临床应用靶向药物和预测预后方面提供研究资料。
表1 TET2、ATM、NF1、JAK1、BRAF、STAT5B、AP3B1、BCL6、MDM2、STAT6、CDKN2B、FBXO11和EPCAM的外显子突变情况
表2 TCL患者的临床资料
表3国际预后指数评分标准
指标
0分
1分
年龄
≤60岁
>60岁
行为状态
0或1
2，3，4
Ann Arbor分期
I或II
III或IV
乳酸脱氢酶(LDH)
正常
高于正常
结外病变受侵部位数目
<2个部位
≥2个部位
从上述测得的基因突变虽然不能直接得出将来诊断结果和健康状况，但其作为中间结果，可以作为患者临床治疗方案制定的参考信息之一。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。