Dnb双末端测序方法
阅读说明：本技术 Dnb双末端测序方法 (DNB double-end sequencing method ) 是由 王卉 陈莹 杨晋 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明提出了DNB双末端测序方法,所述方法包括：以DNA纳米球作为模板链进行测序；测序完成后,利用外切酶对合成的测序链进行消化；消化完成后,重新对所述模板链进行测序；或者以所述模板链生成互补链,并对所述互补链进行测序。利用外切酶将测序链进行消化,可以彻底去除测序链且基本不影响DNB状态,有助于重新测序或互补链的生成,最终保证测序数据的质量。(The invention provides a DNB double-end sequencing method, which comprises the following steps: sequencing by taking the DNA nanospheres as a template chain; after sequencing is completed, digesting the synthesized sequencing chain by utilizing exonuclease; re-sequencing the template strand after digestion is complete; or generating a complementary strand from the template strand and sequencing the complementary strand. The sequencing chain is digested by exonuclease, so that the sequencing chain can be completely removed, the DNB state is basically not influenced, the re-sequencing or complementary chain generation is facilitated, and the quality of sequencing data is finally ensured.)
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及DNB双末端测序方法。
背景技术
第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，但存在测序成本高、通量低等方面的缺点，严重影响了其大规模应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术不仅大大降低了测序成本，而且还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。双末端测序在序列拼接上显得尤其重要，针对DNB-SEQ平台，互补链的生成质量对整个pair-end测序影响较大。DNB测序包括SE测序和pair-end测序，在SE测序过程中，可能出现失误导致这轮测序失败，造成样品损失及数据不可用，而在双末端测序中，完成SE测序后，通过链置换反应生成待测的互补链，再对其互补链进行测序，以保证测序数据的质量。
然而，目前DNB双末端测序方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的问题至少之一。为此，本发明提出了DNB双末端测序方法和试剂盒以及外切酶在DNB双末端测序中的用途，在DNB双末端测序过程中，利用外切酶将测序链进行消化，可以彻底去除测序链且基本不影响DNB状态，有助于重新测序或互补链的生成，最终保证测序数据的质量。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种DNB双末端测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：以DNA纳米球作为模板链进行测序；测序完成后，利用外切酶对合成的测序链进行消化；消化完成后，重新对所述模板链进行测序；或者以所述模板链生成互补链，并对所述互补链进行测序。
在DNB双末端测序过程中，以DNA纳米球作为模板链进行一链测序后，由于测序链(生成链)经过长cycle测序后，一些测序酶结合在测序链上以及带荧光阻断的dNTP切除后残留的scar都会影响Phi29酶的置换效果，从而影响互补链的拷贝数。
进而，发明人通过利用外切酶对合成的测序链进行消化，外切酶可以特异性的识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响，便于进行重新测序或是互补链生成，最终保证测序数据的质量。
根据本发明的实施例，上述DNB双末端测序方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述外切酶选自外切酶III。由此，采用外切酶III可以进一步特异性地识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响。
根据本发明的实施例，所述外切酶III的终浓度为0.2～0.9U/μL。由此，可以进一步提高消化效果。若浓度过低，无法完全有效地除去合成的测序链，从而对后续测序产生影响；若浓度过高，增加了测序成本。
根据本发明的实施例，所述消化的反应温度为35～40℃，时间为8～14分钟。由此，可以进一步提高消化效果，且缩短消化时间。若反应温度过低或时间过短，无法完全有效地除去合成的测序链，从而对后续测序产生影响；若反应温度过高，容易导致酶活性降低。
在本发明的又一方面，本发明提出了外切酶在DNB双末端测序中的用途。外切酶可以特异性的识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响，便于进行重新测序或是互补链生成，最终保证测序数据的质量。
根据本发明的实施例，所述外切酶选自外切酶III。由此，采用外切酶III可以进一步特异性地识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种DNB双末端测序试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：外切酶以及说明书，所述说明书包括DNB双末端测序方法；所述DNB双末端测序方法包括：以DNA纳米球作为模板链进行测序；测序完成后，利用外切酶对合成的测序链进行消化；消化完成后，重新对所述模板链进行测序；或者以所述模板链生成互补链，并对所述互补链进行测序。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒中的外切酶可以特异性的识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响，便于进行重新测序或是互补链生成，最终保证测序数据的质量。
根据本发明的实施例，所述外切酶选自外切酶III。由此，采用外切酶III可以进一步特异性地识别双链DNA的齐平末端或3’凹陷末端，从3’OH末端方向逐步切去单核苷酸，从而移除合成的测序链，恢复DNB的单链状态而质量不受影响。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的DNB双末端测序方法流程示意图；
图2显示了根据本发明实施例1的信号值和质量比较示意图；
图3显示了根据本发明实施例2的信号值和质量比较示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
根据本发明的实施例，参见图1，DNB双末端测序方法包括：
(1)制备DNB(DNA纳米球)并装载到芯片上，并杂交混合好的一链引物；
(2)对DNB一链进行上机测序；
(3)DNB一链测序完成后，用外切酶III(Exo III)对一链进行消化。
(4)消化完成后，重新进行一链测序或是生成互补链，进行互补链测序。
注：图1中WB1和WB2为清洗缓冲液；IP1为一链测序引物。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法进行DNB双末端测序：
1)应用DNB make试剂盒制作DNB；
2)利用loader将DNB装载到芯片表面，杂交引物到DNB上；
3)在BGISEQ500上先进行一链的SE100测序；
4)完成一链测序后，用0.5U/μL ExoⅢ对一链进行消化，温度37℃，时间10min；
表1反应体系
组分
终浓度
100U ExoⅢ
0.5U/μL
10X reaction buffer
1x
5)泵WB1清洗3次，将ExoⅢ洗掉；
6)杂交一链引物，重新测序100cycle；
7)Basecall分析(表2)。
结果显示，ExoⅢ外切酶处理后重测序，一链信号有稍微下降6-8％，但Q30及ESR没有明显差别。信号值及质量比较见图2，其中Control为消化前一链测序结果。由此，表明ExoⅢ消化一链后再重新进行一链测序，DNB质量基本不受影响。
表2 Basecall分析数据
CL100138262
Control
ExoⅢ消化后重测序
Reference
hg19
hg19
CycleNumber
100
100
ImageArea
266
266
TotalReads(M)
3.05
2.97
MappedReads(M)
2.91
2.82
AvgDuplicationRate(％)
1.4
1.17
Q30(％)
93.45
92.76
Runon(％)
0.07
0.07
Lag(％)
0.09
0.09
ESR(％)
88.84
87.31
MappingRate(％)
95.42
95.15
AvgErrorRate(％)
0.25
0.27
AvgErrorRate！N(％)
0.23
0.23
实施例2
在该实施例中，按照下列方法进行DNB双末端测序：
1)应用DNB make试剂盒制作DNB；
2)利用loader将DNB装载到芯片表面，杂交引物到DNB上；
3)在DIPSEQ T1上先进行一链的SE100测序；
4)完成一链测序后，用0.5U/μL ExoⅢ对一链进行消化，温度37℃，时间10min；
表3反应体系
组分
终浓度
100U/ul ExoⅢ
0.5U/μL
10X reaction buffer
1x
5)泵WB1清洗3次，将ExoⅢ洗掉；
6)杂交MDA primer，按照常规方法进行MDA反应；
7)对合成的互补链测序100cycle；
8)Basecall分析(表4)。
PE100结果显示，ExoⅢ外切酶处理后生成互补链，互补链回升信号值较对照组高约14％，Q30提升2-3％；PE100整体Q30及ESR提升约2％。信号值及质量比较见图3，其中常规PE100为不含步骤4和5。由此，可以看出相比于常规PE100，预先经过Exo III消化后，测序数据质量更佳。
表4 Basecall分析数据
ExoⅢ消化-MDA
对照(常规PE100)
Slide
DP800005911BR
DP800005909BR
CycleNumber
200
200
ImageArea
600
600
TotalReads(M)
699.93
696.92
Q30(％)
91.3
89.88
read1 Q30(％)
93.94
93.86
read2 Q30(％)
88.67
85.91
read1 EstErr％
0.17
0.14
read2 EstErr％
0.44
0.49
Runon1(％)
0.09
0.09
Runon2(％)
0.13
0.13
Lag1(％)
0.13
0.13
Lag2(％)
0.18
0.17
ESR(％)
73.77
73.57
RecoverValue(A)
1.89
1.59
RecoverValue(C)
2.23
1.98
RecoverValue(G)
2.39
2.07
RecoverValue(T)
2.1
1.66
RecoverValue(AVG)
2.15
1.83
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。