具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

解释：

根据数量遗传学的理论：数量性状的表现型主要取决于基因型和环境，并且基因型和环境之间存在互作。本发明中的基因型是针对基因组一个位点的两个等位基因的两种纯和组合，表现型是奶牛的体高，环境是不同的奶牛场。

本发明所涉及的某一基因组位点两种基因型在两个不同环境(奶牛场)下对体高的基因型效应、环境效应、基因型与环境互作效应的计算方法如下(表1和表2)：

表中μ_ij表示第i个基因型在第j个环境下的平均表型值。G₁和G₂为基因型1和基因型2的基因型效应，E₁和E₂分别为环境1和环境2的环境效应。GE₁₁为基因型1和环境1的互作效应，GE₁₂为基因型1和环境2的互作效应，GE₂₁为基因型2和环境1的互作效应，GE₂₂为基因型2和环境2的互作效应。

表1.两个基因型在两个环境下的平均表现及基因型效应和环境效应的计算

表2.两个基因型在两个环境下基因型和环境互作效应的计算

所以，本发明中的基因型效应指某一位点不同基因型对奶牛体高变异的贡献，环境效应指不同环境(奶牛场)对奶牛体高变异的贡献，基因型与环境互作效应是指基因型与环境(奶牛场)的相互作用对奶牛体高变异的贡献。

目前已知的主要SNPs只能解释荷斯坦牛体高9.3％的变异，仍有大量与荷斯坦牛体高变异相关的分子标记有待挖掘。为此，提供了一种具体地实施方式，一种筛选牛体高变异相关分子标记的方法，所述方法至少包括：

利用SNP芯片对牛群体中每个个体的DNA样品进行基因分型；

利用基因分型结果计算每头牛的体高基因组估计育种值；

利用GEMMA软件将体高基因组育种值与基因型进行全基因组关联分析；结合基因注释筛选与体高变异显著关联的单核苷酸多态SNPs分子标记以及候选基因；

利用PCR产物直接测序法对具有体高数据的牛的特异SNP位点进行基因分型；计算特异SNP位点对体高的基因型效应、环境效应以及基因型与环境的互作效应，明确高体高优势等位基因型。

进一步地，所述方法具体包括：

S1.牛群体样品的采集及DNA提取；

S2.SNP芯片检测分析及体高基因组育种值计算；

S3.GEMMA全基因组关联分析；

S4.SNP位点处的基因注释并筛选候选基因；

S5.鉴定位于候选基因处与体高变异显著相关的SNPs和相关性最强特异SNP；

S6.PCR产物直接测序法对特异SNP位点进行基因分型；

S7.特异SNP位点对体高的基因型效应、环境效应及基因型与环境互作效应分析，明确特异SNP位点的高体高优势基因型；

更进一步地，S1具体方法包括：

S1.1采集牛群体的血液或毛囊样品；

S1.2提取每头牛的血液或毛囊组织中的DNA；

更进一步地，S2具体方法包括：

S2.1使用SNP芯片对每头牛的DNA样品进行基因分型；

S2.2根据基因型估算每个个体的体高基因组育种值；

更进一步地，S3具体方法包括：

S3.1对SNP数据进行过滤，对符合要求的SNP进行分析；

S3.2使用GEMMA进行全基因组关联分析，分析模型为单变量线性混合模型、协变量为牧场和牛只的月龄；

S3.2采用FDR多重检验方法校正P值；

S3.3使用R语言绘制GWAS结果的曼哈顿图；

S3.4使用UCSC数据库检索注释SNPs；

更进一步地，S4具体方法包括：

S4.1选择P值小于0.05的SNPs，即与体高变异显著相关的SNPs；

S4.2使用UCSC基因组浏览器检索每个SNP所在位置的带注释的参考基因；

S4.3筛选出候选基因；

更进一步地，S5具体方法包括：

S5.1筛查位于候选基因处的P值小于0.05的SNPs，即为与体高变异显著相关的新分子标记；

S5.2筛选分子标记中与牛体高变异的相关性最强的位点，为牛体高性状的特异SNP标记；

更进一步地，S6具体方法包括：

S6.1测量规模化养殖牧场牛群体的体高并采集血液样品；

S6.2提取血液基因组DNA；

S6.3设计覆盖特异SNP位点的PCR引物，PCR扩增；

S6.4 PCR产物直接测序，根据测序峰图，对每头牛的特异SNP位点进行基因分型；

更进一步地，S7具体方法包括：

S7.1计算特异SNP位点对体高的基因型效应和环境效应、基因型和环境互作效应；

S7.2明确优势等位基因型，筛选出高体高性状的牛个体或群体。

基于上述方法筛选到的牛体高变异的新分子标记，具体的，GALNT8基因为影响牛体高变异的新候选基因，其遗传变异可作为荷斯坦牛体高性状的分子标记；同时，牛体高变异相关分子标记包括位于该基因上的4个单核苷酸多态位点：rs133878668、rs135659917、rs210135533和rs110000229，其中rs110000229与荷斯坦牛体高变异的相关性最强，因此，最为适合作为牛体高性状的分子标记；同时，rs110000229位点的基因型GG为高体高优势基因型，可用于选择高体高荷斯坦牛个体或群体。

在一种或多种实施方式中，一种检测单核苷酸多态位点rs110000229的试剂盒，所述试剂盒至少包括如下引物和HhaI限制性内切酶；

F:5‘-GGCAGGTTTGGACTTGGT-3’(SEQ ID NO.1)

R:5‘-GGAAGGGATTGGAGGTTG-3’(SEQ ID NO.2)。

在单核苷酸多态位点rs110000229上下游设计上述引物，该位点的等位基因为G时，临近该位点的位置会出现HhaI限制性内切酶位点，而为A时，则不会出现HhaI酶切位点。据此，可以通过PCR扩增包含该多态位点的片段，通过限制性内切酶HhaI消化扩增片段，可将具有不同突变的PCR产物消化为不同长度的片段；从而区分野生纯合型(AA)个体、杂合型个体(AG)和纯合突变型(GG)个体。

本发明通过对牛进行全基因组关联分析，发现了与牛体高变异相关的新的特异SNP位点，对此特异SNP位点进行基因型效应、环境效应以及基因型与环境效应互作分析，明确在同一牧场中可通过验证单一SNP位点判断荷斯坦牛个体(群体)体高的高低。这对荷斯坦牛体型性状的分子育种工作有着重要意义。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

1、荷斯坦牛样品的采集

在中国11个规模养殖牧场，共采集2709头荷斯坦牛的血液或毛囊样品，提取每头牛的基因组DNA。11个牧场名称、地点及采集样品数目如表1所示。

表1荷斯坦牛采样牧场、地点及样品数

2、采用Illumina Bovine 50K SNP芯片进行基因分型

芯片共有51,386个SNP标记。使用Plink1.9软件对SNP数据进行过滤，过滤后，对剩余47,843个SNPs进行后续的分析。

3、GEMMA全基因组关联分析(GWAS)

GWAS分析采用GEMMA单变量线性混合模型。将体高高矮作为GWAS分析的因变量，将牛场和牛月龄作为协变量，该分析策略可显著提高分析的准确性。使用FDR方法校正P值。使用qqman R软件包绘制GWAS分析结果的曼哈顿图。在UCSC数据库中检索注释SNPs。

4、候选基因及SNPs的筛选

(1)根据GEMMA全基因组关联分析的结果，共筛选到26个差异显著(P<0.05)SNPs，14个SNPs位于8个候选基因内或调控区，见表2。

表2.与体高变异显著相关SNPs及候选基因

(2)有4个与体高变异极显著相关(P<0.01)SNPs(rs110000229 A>G,rs135659917A>G,rs133878668 A>C,rs210135533 G>A)位于GALNT8基因(图2)，并且GALNT8基因为首次筛选到与体高变异相关新候选基因，其中rs110000229与体高变异的相关性最强，因此，最适合作为荷斯坦牛体高性状的分子标记。

(3)进一步分析rs110000229位点不同的基因型对应的体高基因组育种值(表3)，发现GG基因型个体对应的估计育种值均极显著高于AG和AA基因型(P<0.01)，AA基因型对应的估计育种值最低，提示基因型GG是高体高的候选优势基因型，选择该基因型能取得最大的遗传进展。

表3.SNP(rs110000229,A>G)位点不同基因型个体的体高基因组育种值

注释：数字右上角大写字母A\B\C表示差异极显著水平(P<0.01)。

5、PCR直接测序法分析体高新候选基因GALNT8的SNP(rs110000229,A>G)位点的基因型效应和环境效应及基因型和环境互作效应

(1)在山东济南牧场1和泰安牧场2分别选择70头荷斯坦母牛测量体高数据(鬐甲高)，采集血液，提取血液DNA。

(2)设计一对PCR引物，用于扩增包含目标SNP(rs.110000229)位点的DNA片段。

F:5‘-TCGCTTTGGCATTTGTCT-3’(SEQ ID NO.3)

R:5‘-TTAGACACCCAGTCACCAT-3’(SEQ ID NO.4)

(3)PCR反应体系为20μL，包括上游引物1.0μL(10μmol/L)，下游引物1.0μL(10μmol/L)，DNA模板1μL(～50μg/L)，2×Taq PCR Master Mix 10.0μL，ddH2O 7μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59.3℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤执行35个循环；72℃延伸10min。扩增获得目的DNA片段长度1146bp。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(4)对PCR产物直接测序，将测序结果与NCBI GenBank数据库提供的牛GALNT8基因序列比对分析，对每头荷斯坦牛的SNP(rs110000229,A>G)位点进行基因分型，野生纯合AA基因型、杂合AG基因型和纯和突变GG基因型个体的测序峰图见图4。

(5)结合每头牛的体高数据与基因型数据，计算SNP(rs110000229,A>G)位点的AA和GG基因型效应和两个牧场的环境效应(表4)，以及基因型和环境互作效应(表5)。如表4所示，SNP(rs110000229,A>G)位点的GG基因型效应使得牛的体高增加1cm，而AA基因型效应使得牛的体高降低1cm，并且牧场1(环境1)的环境效应使得牛的体高增高2cm，牧场2(环境2)的环境效应使得牛的体高降低2cm。如表5所示，两个基因型与两个环境之间存在互作，基因型GG与环境1和环境2的互作效应分别使得体高降低和增加0.4cm，而基因型AA与牧场1(环境1)和牧场2(环境2)的互作效应分别使得体高增加和降低0.4cm。如图5所示，虽然基因型与环境之间存在互作，但是基因型与环境间的互作模式为非交叉互作，并没有改变基因型优劣的顺序，即对奶牛体高而言，GG基因型在两个环境下都优于AA基因型。综上，在两个牧场种GG基因型是牛高体高的优势基因型，AA是高体高的劣势基因型，可以根据rs110000229位点的基因型对体高进行选择。

表4.SNP(rs110000229,A>G)位点对荷斯坦体高性状的基因型效应和环境效应计算结果

表5.SNP(rs110000229,A>G)位点两个基因型在两个环境下基因型与环境互作效应的计算结果

6、体高候选基因GALNT8的SNP(rs110000229,A>G)基因酶切检测方法：

(1)选择体高不同的荷斯坦牛，提取血液DNA。

(2)在SNP(rs110000229,A>G)位点上下游设计PCR引物：

F:5‘-GGCAGGTTTGGACTTGGT-3’(SEQ ID NO.1)

R:5‘-GGAAGGGATTGGAGGTTG-3’(SEQ ID NO.2)

确保引物所扩增的片段内没有其他HhaI酶切位点。只有当该SNP位点为G突变时会出现HhaI酶切位点。因此，HhaI限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段。

(3)PCR-RFLP基因型分析

首先PCR扩增目的片段，PCR反应体系为20μL，包括上、下游引物各1.0μL(10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 10.0μL,DNA模板1μL(～50μg/L)，ddH₂O 7.0μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63.5℃退火30s，72℃延伸15s，此步骤为35个循环；72℃延伸10min。PCR产物长度209bp。

在37℃下，使用HhaI内切酶对PCR产物进行酶切，之后使用2.5％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳检测结果中野生型个体(AA)只有一条电泳条带209bp；杂合型个体(AG)有三条带209bp、148bp、61bp；纯合突变型个体(GG)可分离出两条带148bp、61bp。具体检测结果见图5。

其次，本实施例中还公开了包含上述引物以及酶的试剂盒。

所述试剂盒还包括PCR扩增反应试剂、酶切反应剂。

具体的，PCR扩增反应试剂包括dNTP(25mM each)、MgCl₂(25mM)、PCR Bμffer、ddH₂O等；

酶切反应剂包括ddH₂O、HhaI酶Buffer、HhaI酶(1U/μl)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心

<120> 一种筛选牛体高变异相关分子标记的方法及其应用

<130> 202125283

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggcaggtttg gacttggt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggaagggatt ggaggttg 18