一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用
阅读说明：本技术 一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用 (Molecular marker for identifying beef components and application thereof ) 是由 张丽 杨瑶 斯能武 吴智华 覃瑞 王海英 刘虹 于 2021-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用,通过基于SYBR Green I染料的实时荧光定量PCR技术,利用细胞核中牛的单拷贝基因作为分子标记,建立具有特异性强、灵敏度高的牛肉成分检测的方法。本发明建立的方法可以准确区分牛与其他12种动物和6种植物,对9种市场上的肉制品进行实际检测,可准确判断出是否含有牛源性成分。本发明建立的牛特异性实时荧光定量PCR检测方法可以为混合肉制品中牛源性成分的定性、定量检测提供技术参考。(The invention discloses a molecular marker for identifying beef components and application thereof, wherein a beef component detection method with strong specificity and high sensitivity is established by using a single copy gene of a cow in a cell nucleus as a molecular marker through a real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) technology based on SYBR Green I dye. The method established by the invention can accurately distinguish cattle from other 12 animals and 6 plants, carry out actual detection on meat products in 9 markets, and accurately judge whether the meat products contain cattle-derived components. The cattle specific real-time fluorescent quantitative PCR detection method established by the invention can provide technical reference for qualitative and quantitative detection of cattle-derived components in mixed meat products.)
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定食品中牛肉成分的分子标记 及其应用。
背景技术
牛属于动物界(Animalia)，脊索动物门(Chordata)，哺乳纲(Mammalia)，偶 蹄目(Arti odactyla)，牛科(Bovidae)，牛亚科(Bovinae)，牛属(Bos)。牛肉是优 质肉类食品，其所含必须氨基酸品种多、含量高且氨基酸组成与人体氨基酸组成 接近，具强健筋骨、滋养脾胃等功效。随着人们对牛肉食用营养价值的认可度提 升以及西餐文化的影响，牛肉消费市场不断扩大；同时，近年的非洲猪瘟使我国 居民肉类消费结构中，作为仅次于猪肉、禽类的世界第三消耗肉品的牛肉占比持 续上涨。然而受各类因素影响，我国牛肉生产量远小于需求量，需依靠进口以填 补缺口，牛肉价格不断提高。
许多经过加工、冷冻、冷藏的食品从外观上很难辨别肉类成分，在没有明确 标签的情况下，为了经济效益，不法商家将商业价值低的肉制品冒充或是掺入价 值高的肉制品中，会对消费者进行误导，甚至是欺骗消费者。同时在销售肉制品 方面缺失标签这种行为造成消费者恐慌的现象也不断出现。在国家加强肉类掺假 监管力度的情况下，仍存在较多生产商家用成本低于牛肉的猪肉、鸭肉、鸡肉或 大豆掺假甚至完全替代牛肉以谋取利益，其中以餐饮店最为严重，不仅会损害消 费者利益，甚至会造成传染病、特定人群的过敏或代谢紊乱等健康隐患。
通常，在现有技术中对于物种的鉴定采用蛋白质鉴定方法或DNA条形码技 术。蛋白质鉴定方法是鉴定物种的一种相对成熟及有效的方法，包括电泳、色谱 和免疫学检测。基于蛋白质的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是免疫学鉴定的一种方法，ELISA是基于抗原抗体特异性反应和 酶与底物专一性反应，在肉制品的检测中，可通过肉眼观察反应产物颜色来判断 成分物种来源。目前可以通过此方法检测的物种包括牛、猪、马、绵羊、鱼、家 禽等。但是，蛋白质检测方法却具有以下限制性：1、不易检测腌制食品和深度 加工的食品，因为大部分蛋白质会在动物死亡后或高温、高压等深度加工后发生 变性，从而改变其抗原性；2、不适合混合肉制品的检测，因为目前的抗体特异 性不显著，可能对不同的动物蛋白质有交叉反应，所以无法通过检测混合肉制品 中的蛋白质来推断动物物种来源。
DNA条形码技术也是物种鉴定的方法之一，其方法是利用线粒体基因中编 码细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome c oxidase subunit 1,COI)的短核酸序 列、线粒体中D环区域或者是12S rRNA上的核酸序列。通过对不同物种中的这些 核酸序列进行测序和序列比对分析，找到一些具有物种特异性的位点，作为该物 种的DNA条形码。目前，已被广泛应用于鉴定鸟类、水生动物、昆虫和哺乳动 物。然而，目前对于食品中牛肉成分的检测，大多数都是使用线粒体DNA来鉴 定，如牛肉的12S rRNA，牛肉细胞色素c上的基因，线粒体中D环区域上的核苷 酸序列。由于不同细胞中线粒体数量不同，线粒体DNA拷贝数在不同组织也会 有所不同，因此并不适合进行定量检测。
由此可见，如何获得一种能够代表牛的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标 记，进而达到对肉制品中的牛肉成分进行精确鉴定和定量检测，是目前急需解决 的问题。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，发明人通过多次，反复的实验和摸索获得了能 够代表牛的基因组拷贝数和细胞数DNA分子标记，设计出灵敏度高，特性好的 扩增引物并摸索出适合该引物的扩增体现和程序，实现了精确鉴定和定量检测肉 制品中牛肉成分的目的。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的分子标记，其特征在于， 所述分子标记由上游引物CHR11F326和下游引物CHR11R411扩增牛基因组 DNA获得，所述上游引物CHR11F326的序列如SEQ ID NO.3，所述下游引物 CHR11R411的序列如SEQ ID NO.6。优选的，所述引物也可以以牛特异性基因 (GenBank登录号XR_003037141.1)为扩增靶标，扩增获得鉴定牛肉成分的分 子标记。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的引物，其特征在于，所 述引物为上游引物CHR11F326和下游引物CHR11R411，所述上游引物 CHR11F326的序列如SEQ IDNO.3，所述下游引物CHR11R411的序列如SEQ ID NO.6，所述引物的具体序列为：
CHR11F326：GCCATCCTCTCCCAGTTTGT；
CHR11R411：AAGCCCTTTCCCTTAATCTACC。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的分子标记在鉴定食品或 肉制品中牛肉成分中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的引物在鉴定食品或肉制 品中牛肉成分中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含 权利要求2所述的鉴定牛肉成分的引物。优选的，所述上游引物CHR11F326的 序列如SEQ IDNO.3，所述下游引物CHR11R411的序列如SEQ ID NO.6，所述 引物的具体序列为
CHR11F326：GCCATCCTCTCCCAGTTTGT；
CHR11R411：AAGCCCTTTCCCTTAATCTACC。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的分子标记在制备鉴定食 品或肉制品中牛肉成分的试剂盒中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的引物在制备鉴定食品或 肉制品中牛肉成分的试剂盒中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴定牛肉成分的方法，其特征在于，所 述方法的步骤为：
1)提取待鉴定样本的基因组DNA；
2)采用权利要求2的引物对步骤1)中提取的基因组DNA进行扩增；
3)出现特异性扩增的样本，含有牛肉成分。
优选的，所述步骤2)采用荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量PCR的 反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，10μM 的引物各0.4μL，ddH2O补足至20μL。
进一步优选的，所述步骤2)采用荧光定量PCR进行扩增，所述荧光定量 PCR的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸30s， 40个循环；65-95℃每隔0.5℃读板一次，16℃保温。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、建立了一种基于核酸的检测方法。相比于蛋白质检测，DNA不会受到高 温及复杂加工条件的影响，也不会受到混合肉制品的影响，在同种动物同种组织 易得到相同检测结果，较为可靠。
2、检测靶标为核基因组中的单拷贝基因，单拷贝基因在动物细胞核中单一 存在，该基因可代表牛的基因组拷贝数和细胞数，比现在诸多基于线粒体基因的 物种检测，更具定量检测性。
3、建立的定量检测方法仅需观察是否有熔链曲线及Ct值，而无需进行繁琐 的凝胶电泳实验，也避免PCR产物开盖过程中造成的污染。操作简便，时间成 本较低，特别适合相关检测部门对食品成分检测及对市场上的混合肉成分抽检。
4、本研究建立的牛肉物种特异性PCR检测方法维护肉制品市场有着重要意 义，提高一些对牛肉过敏患者对整个肉制品市场标签的信任程度，降低肉制品行 业因为错误标签引起的各类问题。
5、本发明为进一步深入研究探索Ct值与更多更复杂混合肉制品中牛肉成分 确切含量之间的关系提供了基础。
附图说明
图1 18S rDNA引物对12份动物基因组DNA荧光定量扩增结果，图中为： 驴、牛、羊、鼠、狗、扇贝、鹅、鸭、虾、鸡、鱼、猪的扩增曲线和溶解曲线；
图2 4对引物对牛基因组DNA的实时荧光定量PCR扩增结果；1-4号曲线 分别为CHR11F326-CHR11R411、CHR11F324-CHR11R411、 CHR11F177-CHR11R325、CHR11F465-CHR11R582；
图3 4对引物对牛基因组DNA的实时荧光定量PCR溶解曲线；
图4 CHR11F326-CHR11R411引物对6种植物和12种动物实时荧光定量PCR 扩增结果，图A为CHR11F326-CHR11R411引物对中粮猪、鼠、鸡、鸭、鹅、狗、 羊、牛、鱼、驴、虾、鱿鱼、扇贝13种动物的实时荧光定量PCR扩增结果，其 中1-3号为牛DNA；图B为CHR11F326-CHR11R411引物对大豆、番茄、胡萝 卜、青椒、水稻、萝卜、大豆等6种植物的实时荧光定量PCR扩增结果；
图5牛基因组DNA浓度10倍梯度稀释实时荧光定量PCR扩增结果；图中 1-5号曲线分别为浓度174ng/μL、17.4ng/μL、1.74ng/μL、0.174ng/μL、0.0174 ng/μL模板DNA扩增曲线；
图6 实时荧光定量PCR市场牛基因组DNA浓度5倍梯度稀释的扩增曲线 和标准曲线；图A图中1-5号曲线分别为浓度174ng/μL、34.8ng/μL、6.96ng/μL、 1.392ng/μL、0.2784ng/μL的模板DNA扩增曲线；图B为梯度稀释后牛DNA 浓度对数与相应Ct值的标准曲线；
图7 9种肉制品对18s rDNA引物实时荧光定量扩增结果图；
图8 9种肉制品对CHR11F326-CHR11R411引物实时荧光定量扩增结果图， 图A-B中1-10号曲线分别为品牌肥牛肉卷、品牌牛肉丸、品牌牛肉卷1、品牌 牛肉卷2、番茄牛肉味水饺、品牌牛滑、品牌肥牛片、品牌牛排、散装牛肉丸、 空白对照的扩增曲线。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供 的技术方案。
实施例1DNA提取及可扩增性实验
1.实验材料
1.1动物材料
12种不同动物的材料分别有：牛(Bovine)，猪(Sus scrofa)，羊(Caprinae)， 驴(Equus asinus)，鸡(Gallus domesticus)，鸭(Anatinae)，狗(Canis lupus familiaris)，鼠(Muroidea)，鱼(Piscium)，虾(Fenneropenaeus chinensis)，扇贝 (Patinopectenyessoensis)，鹅(Anser cygnoides orientalis)。
1.2酶与试剂
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR扩增预混和溶液) 购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03。
氯仿、异戊醇、乙醇、NaCl为国产分析纯，均购于国药集团化学试剂有限 责任公司，Tris、EDTA、CTAB、SDS等购于Sigma-Aldrich。
本实验所需要的引物由武汉擎科生物科技有限公司合成。
1.3实验仪器
实时荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；
超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；
其它仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、超纯水仪等。
2.实验方法
2.1动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA采用手提法，具体操作如下：
1、称取1-2g待测样本剔除动物组织中的结缔组织和脂肪，将其剪成小碎 片，放入研钵。
2、缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直至样品磨成细小的粉末状为止。
3、取50mg粉末转入1.5mL灭菌离心管中。
4、加入400μL已预热到55℃的DNA提取液，用悬臂式搅拌器快速搅拌 10-15sec，再用漩涡混合器混匀30sec。
5、再加入8μL蛋白酶K，用手掌式离心机离心10sec，旋涡式混合器混 匀30sec，将离心管转入65℃水浴，温育2h，温育过程中每隔10min颠倒混匀 数次。
6、加入300μL NaCl，在漩涡混合器上高速混合30sec，用离心机10000rpm 离心30min，取上清液于新的1.5mL离心管中。
7、加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，用旋涡式混合器颠倒混匀约30sec 后，置于-20℃冰箱1h。
8、取出离心管后，用离心机10000rpm离心15min，弃上清液。
9、取500μL无水乙醇洗涤沉淀，静置30min，再用离心机离心1min后 倒掉乙醇，干燥后将其溶于100μL ddH2O中。
10、将提取好的DNA，放于4℃冰箱储存，若要长期存放放置于-20℃冰箱。
2.2实时荧光定量PCR扩增
以动物中均存在的18S rDNA保守序列为扩增靶标，扩增引物信息如表1 所示。以1.1中所述的动物材料的基因组DNA为模板，用18S rDNA引物对动 物基因组DNA用实时荧光定量PCR方法进行扩增，根据扩增曲线和熔解曲线判 断所提取的基因组DNA的可扩增性。
表1 18S rDNA引物信息和扩增片段大小
实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃ 退火和延伸30s，40个循环；65-95℃每隔0.5℃读板一次，16℃保温。
实时荧光定量PCR反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，ddH2O补足至20μL。
3.实验结果
3.1动物基因组DNA浓度
用超微量紫外分光光度计测定所提取的动物基因组浓度的大小及纯度，测 定结果见表2，由表可知所提取的动物基因组DNA的浓度和纯度都满足扩增要 求。
表2 不同样品DNA浓度测定结果
3.2动物基因组DNA可扩增性
利用引物18S rDNA F、18S rDNA R对提取的动物基因组DNA进行实时荧 光定量PCR扩增，溶解曲线中的熔链温度及扩增曲线中的Ct值结果如图1、表 3。这表明提取的12种动物的基因组DNA对引物18S rDNA F、18S rDNA R均 有扩增，另外，Ct值均小于36，表明所有样品基因组DNA浓度和纯度满足实 时荧光定量PCR扩增要求，具有可扩增性。
表3 12份动物基因组DNA实时荧光定量PCR扩增结果
实施例2特异性扩增牛源成分的引物筛选
1.实验材料
1.1牛基因组DNA
1.2酶与试剂
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR扩增预混和溶液) 购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03。
氯仿、异戊醇、乙醇、NaCl为国产分析纯，均购于国药集团化学试剂有限 责任公司，Tris、EDTA、CTAB、SDS等购于Sigma-Aldrich。PCR引物由上海 生物工程有限公司合成。
1.3实验仪器
实时荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；
超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；
2.实验方法
2.1引物的设计
以通过Blast分析比对得到的牛特异性基因(GenBank登录号 XR_003037141.1)为扩增靶标，设计引物。引物如表4所示，可组成4对引物 组合，分别是CHR11F326-CHR11R411，CHR11F324-CHR11R411， CHR11F177-CHR11R325，CHR11F465-CHR11R582。
表4 所设计的引物序列及扩增片段长度
2.2实时荧光定量PCR
将牛的基因组DNA利用4对不同引物组合进行实时荧光定量PCR扩增， 实时荧光定量PCR扩增的方法与实施例1中的方法相同。
2.3定性PCR
PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL， 25mM MgCl2 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA 聚合酶0.5U，ddH2O补足至25μL。
3.实验结果
如表5，图2-图3所示，在Ct值差不多的情况下，四对引物的熔解曲线峰 值均单一，其中CHR11F326-CHR11R411与CHR11F324-CHR11R411扩增曲线呈 典型“S”型，但CHR11F326-CHR11R411荧光信号值最高。因此，引物 CHR11F326-CHR11R411为最佳引物组合。
表5 所设计的四对引物实时荧光定量PCR扩增结果
实施例3特异性扩增牛源成分的引物CHR11F326-CHR11R41种间特性分 析
1、实验材料
18种不同动植物的材料分别有：牛(Bovine)、猪(Sus scrofa)，羊(Caprinae)， 驴(Equus asinus)，鸡(Gallus domesticus)，鸭(Anatinae)，狗(Canis lupus familiaris)，鼠(Muroidea)，鱼(Piscium)，虾(Fenneropenaeus chinensis)，扇贝 (Patinopectenyessoensis)，鹅(Anser cygnoides orientalis)，大豆(Glycine max)， 番茄(Lycopersicon esculentum)，青椒(Capsicum annuum)，胡萝卜(Daucus carota)，水稻(Oryza sativa)，萝卜(Raphanus sativus)。
2、实验方法
2.1、植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit(货号69104)，具体操作如下：
1、粉碎样品，取样100mg。
2、加入400μL bufferAP1和4μL RNaseA。涡旋混匀。65℃水浴10分钟。 期间混匀2-3次。
3、加入130μL buffer AP2。混匀。冰上放置5分钟。14000rpm离心5min
4、将裂解液转入QIAshredder Mini spin coLumn，用自带的2mL离心管作 为收集管。14000rpm离心2min
5、将收集液转入一个新的自备的离心管，加1.5倍体积的BufferAP3/E。 吹打混匀。
6、取650μL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650μL的 体积，因此混合液需离心两次)，用自带的2mL离心管作为收集管。8000rpm 离心1min，对剩余的样品同样操作。
7、将柱子置于新的2mL离心管，用500μL buffer AW洗脱，8000rpm离 心1min，弃洗脱液。
8、再用500μL buffer AW洗脱，14000rpm离心2min，弃洗脱液。
9、将柱子置于新的1.5或2mL离心管中，加入100μL洗脱液Buffer AE。 室温放置5min。14000rpm离心1min。重复步骤9。
2.2、动物基因组DNA提取
提取方法与实施例1中的方法相同
2.3、实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR引物采用CHR11F326-CHR11R411，反应条件与实施例 1中的实时荧光定量PCR反应条件相同。
3.结果分析
如图4所示，选取18种动植物，利用本发明的引物组合对这18份基因组 DNA进行实时荧光定量PCR扩增，除牛的DNA外其他动物均为均无任何扩增， 表明本发明公布的基因片段及检测方法中具有较好的物种间特异性。
表6 CHR11F326-CHR11R411特异性检测扩增结果
实施例4特异性扩增牛源成分的引物CHR11F326-CHR11R411的检测灵敏 度分析
1.牛肉基因组DNA。提取方法与实施例1中的方法相同。
2.将牛肉基因组DNA用水梯度稀释至174ng/μL，17.4ng/μL,1.74ng/μL, 0.174ng/μL,0.0174ng/μL，0.00174ng/μL利用本发明的引物组合进行实时荧光定 量PCR扩增，实时荧光定量PCR扩增引物采用CHR11F326-CHR11R411，扩增 的方法条件与实施例1中的方法相同。
3.结果分析：
梯度稀释的DNA扩增Ct值如表7所示，扩增曲线如图5所示，以引物 CHR11F326-CHR11R411构建的荧光定量PCR检测反应体系中，可检测到的模板 DNA浓度低至0.0174ng/μL，表明该方法灵敏度良好。
表7 市场牛基因组DNA浓度梯度稀释实时荧光定量PCR扩增结果
实施例5特异性扩增牛源成分的引物CHR11F326-CHR11R411的标准曲 线的建立
1.市售牛肉基因组DNA。提取方法与实施例1中的方法相同。
2.将牛肉基因组DNA用水梯度稀释至174ng/μL，34.8ng/μL,6.96ng/μL, 1.392ng/μL,0.2784ng/μL，利用本发明的引物组合进行实时荧光定量PCR扩增， 实时荧光定量PCR扩增引物采用CHR11F326-CHR11R411，扩增的方法条件与实 施例1中的方法相同。
3.结果分析：
梯度稀释的DNA扩增Ct值如表8所示，扩增曲线和标准曲线如图6A、B 所示，本实验根据以上扩增结果以引物组合CHR11F326-CHR11R411所构建 SYBR GreenⅠ检测体系标准曲线如图6B所示，其中DNA浓度在174ng/μL-0.2784 ng/μL之间与相应Ct值的线性关系较为显著(R2＝0.998)，线性回归方程为： y＝-3.109x+28.259(扩增效率为：109.7％)。因此该检测体系可以用于牛源性成分 的进一步定量检测。
表8 市售牛肉的基因组DNA浓度梯度稀释实时荧光定量PCR扩增结果
实施例6特异性扩增牛源成分的引物CHR11F326-CHR11R411对于实际样 品中牛肉成分的检测
1.实验材料
1.1动物样品
市售品牌牛滑、品牌肥牛片、品牌牛排、品牌牛肉丸、品牌牛肉卷1、品 牌牛肉卷2、品牌肥牛肉卷、散装牛肉丸、番茄牛肉味水饺。
1.2酶与试剂
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR扩增预混和溶液) 购自上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03。
氯仿、异戊醇、乙醇、NaCl为国产分析纯均购于国药集团化学试剂有限责 任公司，Tris、EDTA、CTAB、SDS等购于Sigma-Aldrich。
本实验所需要的各种引物由上海生物工程科技有限公司合成。
1.3实验仪器
荧光定量PCR仪：CFX Connect(BIO-RAD)；
超微量紫外分光光度计：NanoPhotometer-N80(Implen)；
其它仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、超纯水仪等。
2.实验方法
2.1动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA采用手提法，具体操作如下：
1、称取1-2g待测样本剔除动物组织中的结缔组织和脂肪，将其剪成小碎 片，放入研钵。
2、缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直至样品磨成细小的粉末状为止。
3、取50mg粉末转入1.5mL灭菌离心管中。
4、加入400μL已预热到55℃的DNA提取液，用悬臂式搅拌器快速搅拌 10-15sec，再用漩涡混合器混匀30sec。
5、再加入8μL蛋白酶K，用手掌式离心机离心10sec，旋涡式混合器混 匀30sec，将离心管转入65℃水浴，温育2h，温育过程中每隔10min颠倒混匀 数次。
6、加入300μL NaCl，在漩涡混合器上高速混合30sec，用离心机10000rpm 离心30min，取上清液于新的1.5mL离心管中。
7、加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，用旋涡式混合器颠倒混匀约30sec 后，置于-20℃冰箱1h。
8、取出离心管后，用离心机10000rpm离心15min，弃上清液。
9、取500μL无水乙醇洗涤沉淀，静置30min，再用离心机离心1min后 倒掉乙醇，干燥后将其溶于100μL ddH2O中。
10、将提取好的DNA，放于4℃冰箱储存，若要长期存放放置于-20℃冰箱。
2.2实时荧光定量PCR扩增
以上述2.1步骤中提取的基因组DNA为模板，以18S rDNA引物进行荧光 定量PCR，以ddH20为空白对照，证明提取的基因组DNA的可扩增性。18S rDNA 引物参见表1所示。
以牛特异性的引物组合CHR11F326-CHR11R411为引物，进行荧光定量PCR 扩增，以ddH20为空白对照，检测样品中是否含有牛源性成分。扩增引物信息和 扩增片段大小见表9所示：
表9 引物信息和扩增片段大小
实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃ 退火和延伸30s，40个循环；65-95℃每隔0.5℃读板一次，16℃保温。
实时荧光定量PCR反应体系为：DNA模板1μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix10μL，10μM正、反向引物各0.4μL，ddH2O补足至20μL。
3.实验结果
3.1提取的基因组DNA的可扩增性
对提取得到的9份基因组DNA以18S rDNA引物进行实时荧光定量PCR 的扩增结果如表9、图7所示，均有扩增曲线出现。表明从这些样品中提取得到 了可进行荧光定量PCR扩增的基因组DNA。
对提取得到的6份基因组DNA以引物CHR11F326-CHR11R411进行实时荧 光定量PCR的扩增结果如表10、图8所示，空白对照无扩增表明本次实验无交 叉污染；品牌牛滑、品牌肥牛片、品牌牛排、品牌牛肉丸、品牌肥牛卷1、品牌 肥牛卷2、品牌肥牛肉卷、散装牛肉丸等均有扩增，扩增曲线呈典型“S”型， 且Ct值均小于35，表明这些牛肉制品中均含有牛源性成分；番茄牛肉味水饺的 三个平行实验中仅有一个出现扩增，且Ct值大于35，表面该产品中几乎不含牛 源性成分。实验结果表明，本发明的基于牛特异性序列的引物组合能够准确鉴定 出样品中的牛成分。
表9 九种肉制品实时荧光定量PCR扩增结果
表10 九种肉制品实时荧光定量PCR扩增结果
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明， 凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本 发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一种鉴定牛肉成分的分子标记及其应用
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CTACTGACAC CACCTCCTGC TC 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TCGCCATCCT CTCCCAGTT 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GCCATCCTCT CCCAGTTTGT 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GAGGAAGCCA CGAGCAAAT 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
GACTCACTCT CCTCCACTTCC A 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
AAGCCCTTTC CCTTAATCTAC C 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
GGTGAAAGAA AGCAGCCATG 20
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