一种利用y染色体单核苷酸遗传标记鉴定瘤牛公牛来源的方法
阅读说明：本技术 一种利用y染色体单核苷酸遗传标记鉴定瘤牛公牛来源的方法 (Method for identifying source of bull ruminants by utilizing Y chromosome mononucleotide genetic markers ) 是由 陈宁博 雷初朝 许星龙 夏小婷 党瑞华 黄永震 蓝贤勇 陈宏� 于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定瘤牛公牛来源的方法。本发明利用基因组重测序结果,对主要瘤牛群体的Y染色体DNA序列进行扫描,发现了东亚瘤牛、非洲瘤牛等瘤牛群体特有的Y染色体SNP位点,根据这些SNP位点可以在DNA水平上准确鉴别瘤牛公牛所属群体,能有效用于不同瘤牛群体的地方品种的引种及分子标记辅助育种,为快速建立遗传资源优良的瘤牛种群奠定基础。(The invention discloses a method for identifying a source of a bull tumor by utilizing a Y chromosome mononucleotide genetic marker. The invention utilizes the genome re-sequencing result to scan the Y chromosome DNA sequence of the main tumor cattle group, finds the specific Y chromosome SNP sites of the tumor cattle groups such as east Asia tumor cattle, Africa tumor cattle and the like, can accurately identify the tumor cattle bull group on the DNA level according to the SNP sites, can be effectively used for the introduction of local varieties of different tumor cattle groups and the molecular marker assisted breeding, and lays a foundation for quickly establishing the tumor cattle group with excellent genetic resources.)
技术领域
本发明属于引种和育种的分子标记辅助鉴别技术领域，涉及利用瘤牛(Bosindicus)Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP)鉴定瘤牛公牛所属群体。
背景技术
单核苷酸多态(SNP，single nucleotide polymorphism)是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。人类基因组计划已经鉴别出了许多的SNPs，它是生物体基因组中存在最为广泛的一类变异，是由于单个核苷酸的插入、缺失、转换和颠换而引起的。
哺乳动物Y染色体雄性特异区(Male specific region，Y chromosome；MSY)在减数分裂时不与X染色体发生重组，因此呈典型的父系遗传，仅存在于雄性个体。Y-SNPs标记已广泛用于世界牛群的遗传多样性和起源研究，目前已经报道瘤牛具有2种Y染色体单倍型Y3A和Y3B，但是发现这两种单倍型的瘤牛主要为中国瘤牛和美洲瘤牛，美洲瘤牛不能代表南亚瘤牛和非洲瘤牛；而且由于SNP数目非常有限，尚不能用于区分东亚瘤牛、南亚瘤牛和非洲瘤牛群体。
发明内容
针对目前用于鉴别瘤牛(Bos indicus)群体的SNP位点数目有限，仅能将瘤牛分为Y3A和Y3B两个父系起源，而不能精细的区分出各群体(东亚瘤牛、南亚瘤牛、非洲瘤牛群体)的问题，本发明提供一种利用Y染色体单核苷酸遗传标记鉴定瘤牛公牛来源的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明通过对东亚瘤牛、南亚瘤牛以及非洲瘤牛公牛进行重测序，探寻用于区分东亚瘤牛、南亚瘤牛以及非洲瘤的Y染色体遗传标记。根据对不同群体公牛的个体Y染色体重测序结果，结合一定的实验和分析手段，确定了对应群体公牛的特有SNP在牛Y染色体参考基因组序列(Btau5.0.1)中的位点信息(SNP位点必须雄性特异)，其中：
所述东亚瘤牛的特有SNP定位在牛Y染色体参考基因组第3839042、3861238、42456991、42685548、42882874、43143941位，这些位点(不存在杂合状态基因型)中相应的用于鉴定东亚瘤牛的等位基因为突变碱基G、T、T、T、T、C；
所述非洲瘤牛的特有SNP定位在牛Y染色体参考基因组第43180361、42393839、3467637位，这些位点(不存在杂合状态基因型)中相应的用于鉴定非洲瘤牛的等位基因为突变碱基C、C、C；
所述南亚瘤牛和非洲瘤牛共有的特有SNP定位在牛Y染色体参考基因组第42282365、43282424位，这些位点(不存在杂合状态基因型)中相应的用于鉴定南亚瘤牛和非洲瘤牛的等位基因为突变碱基A、A。
优选的，所述南亚瘤牛还可以采用由上述第3467637、43180361和42393839位三个特有SNP所在位点的等位基因(参考碱基G、T和A)与上述第42282365、43282424位中的一个以上的特有SNP所在位点的等位基因(突变碱基A、A)构成的单倍型进行鉴定。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过所发现的不同群体瘤牛Y染色体上特有的SNP位点，利用这些SNP位点可以有效区分不同群体来源的瘤牛公牛，可以用于种用瘤牛公牛群体鉴定、引种及分子标记辅助育种，为快速建立遗传资源优良的瘤牛种群奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明提供一种利用瘤牛Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP标记)鉴定瘤牛公牛所属群体的方法
(一)利用基因组重测序技术及生物信息学分析方法确定准确区分瘤牛公牛群体来源信息的牛Y染色体遗传变异信息
(1)公牛基因组重测序(以母牛基因组序列作对照)
对191个东亚瘤牛、南亚瘤牛以及非洲瘤牛公牛进行重测序，并且从NCBI下载了85头其他公牛基因组重测序结果(包含Simental、Jersey、Angus、Gelbvieh、Hereford、Holstein、Kazakh、Mongolian、Chaidamu、Yakutian、Yanbian、Hanwoo、Tibetan、Muturu、N'Dama、Abergelle、Arado、Arsi、Bale、Afar、Bagaria、Begait、Ethiopia、Semien、Choke、Erob、Fogera、Goffa、Horro、Mursi、Raya、Ogaden、Boran、Kenana、Sri Lanka、Cholistani、Tharparkar、Bhagnari、Gabrialli、Achai、Nari_Master、Dhanni、Red_Sindhi、Dajal、Hariana、Lohani、Sahiwal、Nepal、Nelore、Gir、Brahman、Shigatse、Bangladesh、Burma、Dehong、Jiangcheng、Dianzhong、Longling、Nandan、Yiling、Dabieshan、Jinjiang、Guangfeng、Wenling、Minnan、Ji'an、Wannan、Leiqiong、Weizhou)，以20头母牛序列作对照。
(2)基因组比对
用BWA软件将每一头公牛的重测序结果比对到牛参考基因组Btau5.0.1(NCBI版本号GCF_000003205.7)。
(3)用Samtools软件和GATK软件找出所有的SNP位点，再对位于Y染色体上的SNP位点进行过滤，标准如下：SNP必需只存在于公牛个体，所有母牛个体没有(即只存在于Y染色体雄性特异区的SNP)；SNP位点在公牛个体中均为纯合，保证其位于Y染色体单拷贝区。
(4)利用Beagle软件对缺失位点进行填充。
(5)筛选各群体特有的单核苷酸突变位点(即特有SNP)
经筛选发现了东亚瘤牛、南亚瘤牛和非洲瘤牛三个群体特有的SNP位点，参见表1，部分特有SNP在对应群体的频率为100％，在其他群体频率基本为0；部分特有SNP在对应群体的频率不到100％，但在其他群体频率为不超过5％。
表1.不同公牛群体SNPs位点及其突变等位基因频率统计
根据表1，非洲瘤牛有3个特有的SNP位点(即SNP1、SNP2、SNP3)，在非洲瘤牛中频率分别为89％(31/35)、89％(31/35)、86％(30/35)。在其他牛品种频率分别为5％(11/241)、5％(11/241)、0(0/241)，非洲瘤牛在这三个位点对应的基因型分别为SNP1-CC、SNP2-CC、SNP3-CC，可利用其中任何一个SNP位点的基因型鉴定非洲瘤牛。
根据表1，东亚瘤牛有6个特有的SNP位点(即SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9)，在东亚瘤牛中的频率分别为84％(73/87)、84％(73/87)、84％(73/87)、84％(73/87)、84％(73/87)、84％(73/87)，在其他牛群体中频率均为0。东亚瘤牛在这六个位点对应的基因型分别为SNP4-GG、SNP5-TT、SNP6-TT、SNP7-TT、SNP8-TT、SNP9-CC，可利用其中任何一个SNP位点的基因型鉴定东亚瘤牛。
根据表1，南亚和非洲瘤牛(南亚瘤牛和非洲瘤牛共有)有2个特有的SNP位点(即SNP10、SNP11)，在南亚和非洲瘤牛中频率分别为93％(80/86)、93％(80/86)，在东亚瘤牛中的频率分别为9.1％(8/87)和9.1％(8/87)，在普通牛中的频率为0。可利用非洲瘤牛的3个特有SNP位点(SNP1、SNP2、SNP3)中的1个、2个或3个位点与SNP10和SNP11其中的1个或2个位点的组合基因型鉴定南亚瘤牛、非洲瘤牛，其中，在这5个位点的基因型为SNP1-GG、SNP2-TT、SNP3-AA、SNP10-AA和SNP11-AA的瘤牛可鉴定为南亚瘤牛。
(二)鉴定瘤牛公牛所属群体
根据以上结果，利用表1中所列SNP1-3位点可以区分不同群体来源的非洲瘤牛公牛，利用SNP4-9位点可以区不同群体来源的东亚瘤牛公牛，利用SNP1-3和SNP10-11的组合基因型可以区分非洲瘤牛和南亚瘤牛。
鉴定公牛个体所属群体时，提取待鉴定公牛的基因组DNA，对该基因组DNA在牛Y染色体参考基因组中特有SNP所对应的单核苷酸位点的多态性进行检测，根据检测结果以及对应群体公牛特有的SNP位点，确定待鉴定公牛所属群体，具体流程举例说明如下。
实例1、利用Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP标记)鉴定瘤牛公牛所属群体的方法(DNA测序法)
以东亚瘤牛为例，利用牛Y染色体参考基因组序列，选择SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8和SNP9中的一个或多个，两侧各延伸一定长度，以此为模板设计PCR扩增引物。以待测公牛基因组DNA为模板，母牛基因组DNA为隐性对照，进行PCR扩增(母牛应不出现扩增条带，公牛有一条明亮的扩增条带)，对扩增产物进行测序。然后利用DNASTAR软件将测序结果与参考基因组序列比对，确认选择的SNP位点是参考碱基还是突变碱基，若为突变碱基则该公牛为东亚瘤牛，否则不是东亚瘤牛。
实验结果表明，该方法鉴定的准确性或一致性达到97％。
实例2、利用Y染色体单核苷酸遗传标记(SNP标记)鉴定瘤牛公牛所属群体的方法(SNP芯片法)
(1)根据表1中每个SNP位点分别设计一段50bp的单链探针引物。
(2)将这些引物按一定次序固定在芯片材料上。
(3)将待测公牛基因组DNA进行全基因组扩增。
(4)将扩增产物用随机内切酶酶切片段化。
(5)将DNA片段与芯片进行杂交，使基因组DNA酶切产物与探针特异性结合。
(6)加入两种荧光标记的双脱氧三磷酸核苷酸(ddATP、ddGTP)进行单碱基延伸，只有与基因组DNA互补结合的探针才能得到延伸。
(7)芯片清洗后进行扫描。
(8)检测每个位点的荧光强度和波长，判定SNP分型结果。
实验结果表明，该方法鉴定的准确性或一致性达到95％，且利用该方法，可一次性检测多个待测公牛的样本，鉴定不同公牛各自所属群体(属于东亚瘤牛、非洲瘤牛或南亚瘤牛公牛)。
总之，本发明提出了在DNA水平上鉴别不同瘤牛群体公牛的方法，适用于快速鉴定东亚瘤牛、非洲瘤牛、南亚瘤牛的公牛，能有效用于对属于这些群体的各个地方品种公牛的引种及分子标记辅助育种，也可用于公牛群体的父系起源标记，为快速建立遗传资源优良的瘤牛种群奠定基础。