新型冠状病毒等温扩增引物、检测方法及应用
阅读说明：本技术 新型冠状病毒等温扩增引物、检测方法及应用 (Novel coronavirus isothermal amplification primer, detection method and application ) 是由 孙佳姝 田飞 刘超 陈清华 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新型冠状病毒等温扩增引物,所属引物为针对新型冠状病毒选自以下一种或多种基因的引物组：N基因、E基因、ORFlab基因。还提供了其检测方法及检测试剂和试剂盒。本发明引物结合其他市售试剂,可以组成新型冠状病毒LAMP检测试剂盒,用于新型冠状病毒感染筛查。本发明操作简单,灵敏度高,特异性好,在新冠病毒感染筛查领域具有很广阔的应用前景。(The invention provides a novel coronavirus isothermal amplification primer, which is a primer group for the novel coronavirus, wherein the primer group is selected from one or more of the following genes: n gene, E gene, ORFlab gene. Also provides a detection method, a detection reagent and a kit thereof. The primer disclosed by the invention can be combined with other commercially available reagents to form a novel coronavirus LAMP detection kit for screening novel coronavirus infection. The method is simple to operate, high in sensitivity and good in specificity, and has a wide application prospect in the field of new coronavirus infection screening.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒等温扩增引物、检测方法及应用。
背景技术
目前对新型冠状病毒筛查主要有核酸检测和血清学检测两种方式。与核酸检测相比，血清学检测依赖于新冠肺炎病毒特异性IgM或者IgG的产生，由于免疫应答需要一定时间，因此在患者感染初期，血清学检测无法确诊。核酸检测以新冠肺炎特异性核酸序列的存在为诊断依据，因此可以在感染初期对患者进行确诊。目前新冠病毒核酸检测主要以逆转录聚合酶连式扩增反应(RT-PCR)为主，但RT-PCR需要核酸提取、cDNA合成、PCR扩增等众多步骤，操作复杂、耗时久且依赖专业技术人员进行，限定了其应用范围。因此迫切需要新型的病毒核酸检测方法进行新型冠状病毒快速筛查。
环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种新型的等温核酸扩增手段，具有扩增高效，灵敏度高，成本低廉等优点。相比于PCR扩增，LAMP在恒温下进行，无需变温控制；对于包括新型冠状病毒在内的RNA病毒而言，可同时进行逆转录与扩增过程，操作更简单，是一种适合现场快速筛查的核酸扩增手段。
现有技术针对新冠病毒ORF1ab基因设计LAMP扩增引物，并采用荧光染色法，检测灵敏度达到了5拷贝/微升。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种新型冠状病毒等温扩增引物、检测方法及应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“N基因”是指：新冠病毒基因中编码病毒核衣壳磷蛋白 (Nucleocapsid)的基因序列。
术语“E基因”是指：新冠病毒基因中编码病毒包膜蛋白(Envelope)的基因序列。
术语“ORF1ab基因”是指：新冠病毒基因中开放阅读框1ab(Opening ReadingFrame 1ab)基因序列。
术语“Betaine”是指：甜菜碱。
术语“dNTPs”是指：三磷酸脱氧核苷酸。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种新型冠状病毒等温扩增引物，所属引物为针对新型冠状病毒选自以下一种或多种基因的引物组： N基因、E基因、ORFlab基因。
根据本发明第一方面的新型冠状病毒等温扩增引物，其中，所述引物组针对新型冠状病毒N基因时，所述引物组包括如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的外侧正向引物F3，SEQID NO:2或SEQ ID NO:8的外侧反向引物 B3，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的内侧正向引物FIP，SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:10的内侧反向引物BIP，SEQ ID NO:5的环引物LF，和/或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11的环引物LB。
根据本发明第一方面的新型冠状病毒等温扩增引物，其中，所述引物组针对新型冠状病毒E基因时，所述引物组包括如SEQ ID NO:12的外侧正向引物F3，SEQ ID NO:13的外侧反向引物B3，SEQ ID NO:14的内侧正向引物FIP，SEQ ID NO:15的内侧反向引物BIP，SEQID NO:16的环引物 LF和SEQ ID NO:17的环引物LB。
根据本发明第一方面的新型冠状病毒等温扩增引物，其中，所述引物组针对新型冠状病毒ORFlab基因时，所述引物组包括选自SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34的外侧正向引物F3，选自 SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35的外侧反向引物B3，选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQID NO:36的内侧正向引物FIP，选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:37的内侧反向引物BIP，SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:38 的环引物LF，和/或选自SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39的环引物LB。
本发明的第二方面提供了一种新型冠状病毒检测方法，所述方法采用环介导等温扩增方法使用如第一方面所述的新型冠状病毒等温扩增引物进行检测；
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测病毒溶液与核酸释放剂混合；
(2)将一组引物与环介导等温扩增所需物质混合，并将混合溶液加入步骤(1)所得样本内并混合得到扩增体系；
(3)对步骤(2)所得体系进行核酸扩增并观测荧光信号。
根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(2)中，所述扩增体系中，外侧正向引物F3浓度为0.1～1M，优选为0.1～0.5M，最优选为0.2 M；外侧反向引物B3浓度为0.1～1M，优选为0.1～0.5M，最优选为0.2M；内侧正向引物FIP浓度为1～5M，优选为1～3M，最优选为1.6M；内侧反向引物BIP浓度为1～5M，优选为1～3M，最优选为1.6M；环引物LF浓度为0～3M，优选为0～2M，最优选为 0.8M；和/或环引物LB浓度为0～3M，优选为0～2M，最优选为 0.8M。
根据本发明第二方面的方法，其中，步骤(3)中，所述扩增温度为 60～70℃，优选为63～67℃，最优选为65℃；和/或
所述扩增时间为50～100分钟，优选为50～80分钟，最优选为60分钟。
本发明的第三方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包括如第一方面所述的新型冠状病毒等温扩增引物。
本发明的第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的新型冠状病毒等温扩增引物或如第五方面所述的检测试剂。
优选地，所述试剂盒中还包括以下一种或多种物质：核酸释放剂、LAMP 扩增所需酶、缓冲体系、荧光判别物质；
优选地，所述LAMP扩增所需酶选自以下一种或多种：Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶；和/或
优选地，所述缓冲体系选自以下一种或多种：Tris–HCl缓冲液,KCl溶液,MgSO4溶液,(NH4)2SO4溶液,Tween20溶液,Betaine溶液,dNTPs溶液；更优选地，所述Tristan-HCl缓冲体系的pH值为8～9，进一步优选地，所述Tristan-HCl缓冲体系的pH值为8.8。
本发明拟构建数组针对新型冠状病毒的LAMP扩增引物，用于新型冠状病毒感染者的快速筛查与诊断。
LAMP共涉及到六条引物，依次为外侧正向引物F3，外侧反向引物B3，内侧正向引物FIP，内侧反向引物BIP，环引物LF和LB，但个别设计中可能缺失LF引物。
本发明根据已公开的新型冠状病毒基因序列(GenBank MN908947)，分别设计了针对数组新型冠状病毒N基因、E基因、ORF1ab基因的LAMP 引物组，用于新型冠状病毒的快速筛查与诊断。
本发明涉及到的引物组序列信息如下(下述引物均依照F3，B3，FIP， BIP，LF，LB顺序)。
针对N基因引物
引物组1：
SEQ ID NO:1(外侧正向引物F3):GGCTTCTACGCAGAAGGGA
SEQ ID NO:2(外侧反向引物B3):GTGACAGTTTGGCCTTGTTG
SEQ ID NO:3(内侧正向引物FIP):CCTACTGCTGCCTGGAGTTGAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATC
SEQ ID NO:4(内侧反向引物BIP):GCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGTTGGCCTTTACCAGACA
SEQ ID NO:5(环引物LF):TCTTGAACTGTTGCGACTACG
SEQ ID NO:6(环引物LB):TGCTGCTGCTTGACAGATTG
引物组2：
SEQ ID NO:7(外侧正向引物F3):GGCAGTCAAGCCTCTTCTC
SEQ ID NO:8(外侧反向引物B3):TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA
SEQ ID NO:9(内侧正向引物FIP):TTCCCCTACTGCTGCCTGGAGTTCCTCATCACGTAGTCGC
SEQ ID NO:10(内侧反向引物BIP):TTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCTCTGTCAAGCAGCAGCAAAG
SEQ ID NO:11(环引物LB):GCGGTGATGCTGCTCTT
针对E基因
引物组3：
SEQ ID NO:12(外侧正向引物F3):TTTCGGAAGAGACAGGTAC
SEQ ID NO:13(外侧反向引物B3):AGGAACTCTAGAAGAATTCA GA
SEQ ID NO:14(内侧正向引物FIP):CGCAGTAAGGATGGCTAGTGTAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTT
SEQ ID NO:15(内侧反向引物BIP):TCGATTGTGTGCGTACTGCTGTTTTTAACACGAGAGTAAACGT
SEQ ID NO:16(环引物LF):ACTAGCAAGAATACCACGA
SEQ ID NO:17(环引物LB):ACGTGAGTCTTGTAAAACC
针对ORF1ab基因
引物组4：
SEQ ID NO:18(外侧正向引物F3):TCGTGTTGTCTGTACTGC
SEQ ID NO:19(外侧反向引物B3):GACTGAAGCATGGGTTCG
SEQ ID NO:20(内侧正向引物FIP):AGCACAAGTTGTAGGTATTTGTACACGTTGCCACATAGATCATCC
SEQ ID NO:21(内侧反向引物BIP):AATGACCCTGTGGGTTTTACACTTTTGATCACAACTACAGCCATA
SEQ ID NO:22(环引物LB):TCTGCGGTATGTGGAAAG
引物组5：
SEQ ID NO:23(外侧正向引物F3):TCGTGTTGTCTGTACTGC
SEQ ID NO:24(外侧反向引物B3):GACTGAAGCATGGGTTCG
SEQ ID NO:25(内侧正向引物FIP):AGCACAAGTTGTAGGTATTTGTACACGTTGCCACATAGATCATCC
SEQ ID NO:26(内侧反向引物BIP):AATGACCCTGTGGGTTTTACACTTTTGATCACAACTACAGCCATA
SEQ ID NO:27(环引物LB):AACACAGTCTGTACCGTC
引物组6：
SEQ ID NO:28(外侧正向引物F3):ACTTAAAAACACAGTCTGTA CC
SEQ ID NO:29(外侧反向引物B3):TCAAAAGCCCTGTATACGA
SEQ ID NO:30(内侧正向引物FIP):TGACTGAAGCATGGGTTCGCGTCTGCGGTATGTGGAAAG
SEQ ID NO:31(内侧反向引物BIP):GCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGCATCAGTACTAGTGCCTGT
SEQ ID NO:32(环引物LF):GTTGATCACAACTACAGCC
SEQ ID NO:33(环引物LB):TTTGCGGTGTAAGTGCA
引物组7：
SEQ ID NO:34(外侧正向引物F3):TTGTGCTAATGACCCTGT
SEQ ID NO:35(外侧反向引物B3):TCAAAAGCCCTGTATACGA
SEQ ID NO:36(内侧正向引物FIP):TTGATCACAACTACAGCCATAACCTCACTTAAAAACACAGTCTGTACC
SEQ ID NO:37(内侧反向引物BIP):GCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGCATCAGTACTAGTGCCTGT
SEQ ID NO:38(环引物LF):TTCCACATACCGCAGAC
SEQ ID NO:39(环引物LB):TTTGCGGTGTAAGTGCA
本发明提出了共计七组新型冠状病毒LAMP检测引物，结合市售其他试剂，可以组成新型冠状病毒LAMP检测试剂盒，用于新型冠状病毒筛查。在优化条件下，本发明检测灵敏度达到了0.5拷贝每微升，且具有很好的特异性。本发明包括但不限于荧光读出、浊度读出等读出方式。
本发明的引物具有但不限于以下有益效果：
本发明提出了共计七组新型冠状病毒检测LAMP检测引物，结合其他市售试剂，可以组成新型冠状病毒LAMP检测试剂盒，用于新型冠状病毒感染筛查。本发明操作简单，灵敏度高，特异性好，在新冠病毒感染筛查领域具有很广阔的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1中对照组荧光结果，其中，左侧为阳性结果，右侧为阴性结果。
图2示出了实施例1中引物组1和引物组2的荧光结果，其中，自左至右依次为引物组1实验组、引物组1阴性对照、引物组2实验组、引物组2阴性对照。
图3示出了实施例1中引物组3的荧光结果，其中，自左至右依次为实验组和阴性对照。
图4示出了实施例1中引物组4和引物组5的荧光结果，其中，自左至右依次为引物组4实验组、引物组4阴性对照、引物组5实验组、引物组5阴性对照。
图5示出了实施例1中引物6和引物7的荧光结果，其中，自左至右依次为引物组6实验组、引物组6阴性对照、引物组7实验组、引物组7 阴性对照。
图6示出了实施例2中引物组2的灵敏度测试结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂如下：
S1014核酸释放剂，购自圣湘公司；
LAMP扩增相关酶以及缓冲体系，购自荣研生物科技有限公司；
荧光判别物质，购自荣研生物科技有限公司；
市售阳性对照引物，购自荣研生物科技有限公司。
实施例1
本实施例用于说明本发明引物对新冠病毒的检测。
本发明涉及的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
通过如下实验为了证明本发明引物检测有效性：
1.将4微升106拷贝每微升浓度的新冠病毒假病毒溶液或去离子水与4 微升核酸释放剂混合；室温下静置10分钟待假病毒核酸释放；另用8微升市售RNA及8微升去离子水分别作为反应体系的阳性对照和阴性对照，设为对照组；
2.将一组引物2.5微升与其他LAMP扩增所需物质(包括2×缓冲溶液 12.5微升(含40mM pH＝8.8Tris–HCl缓冲液,20mM KCl,16mM MgSO4,20 mM(NH4)2SO4,0.2％Tween20,1.6M Betaine,2.8mM dNTPs)，Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合溶液1微升，荧光判别物质(本实施例中采用朗报荧光目视检测试剂)溶液1微升)混合，配置成17微升LAMP反应预混溶液，然后将LAMP反应预混溶液加入样本内并混合得到扩增体系。对照组中引物使用对应市售阳性对照引物。
其中，所述LAMP体系中引物含量为：
FIP:40pmol；
BIP:40pmol；
LF:20pmol；
LB:20pmol；
F3:5pmol；
B3:5pmol；
其中，对于引物组2、引物组4和引物组5，所述LAMP体系中不含 LF引物。
3.将体系置于65摄氏度下反应60分钟，完成核酸扩增。
4.取出反应体系，观测荧光信号，结果如图1-5所示。图1示出了市售阳性对照模板扩增结果，相比于右侧阴性对照组，阳性对照组结果更浑浊，表明有效扩增。图2-图5分别示出了引物组1-7的扩增结果，与市售阳性对照组结果类似，各引物均对假病毒产生有效扩增，而阴性对照组无明显变化，表明各引物均可用于新冠病毒LAMP扩增检测。
实施例2
本实施例用于说明本发明引物对新冠病毒的检测灵敏度。
本发明涉及的引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.将4微升新冠病毒假病毒溶液(0.5拷贝每微升)或去离子水与4 微升核酸释放剂混合；室温下静置10分钟待假病毒核酸释放；另用8微升市售RNA及8微升去离子水分别作为反应体系的阳性对照和阴性对照，设为对照组；
2.将一组引物2.5微升与其他LAMP扩增所需物质(包括2×缓冲溶液 12.5微升(含40mM pH＝8.8Tris–HCl缓冲液,20mM KCl,16mM MgSO4,20 mM(NH4)2SO4,0.2％Tween20,1.6M Betaine,2.8mM dNTPs)，Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合溶液1微升，荧光判别物质溶液1微升混合，配置成17微升LAMP反应预混溶液，然后将LAMP反应预混溶液加入样本内并混合得到扩增体系。对照组中引物使用对应市售阳性对照引物。
其中，所述LAMP体系中引物序列为SEQ ID NO.7-11(引物组2)，含量为：
FIP:40pmol；
BIP:40pmol；
LB:20pmol；
F3:5pmol；
B3:5pmol。
3.将体系置于65摄氏度下反应60分钟，完成核酸扩增。
4.取出反应体系，观测荧光信号，结果如图6所示。
引物组均对假病毒(0.5拷贝/微升)产生有效扩增，而阴性对照组无明显变化，表明各引物均可用于新冠病毒LAMP扩增检测，检测灵敏度可以达到0.5拷贝/微升。
本发明针对新冠病毒N基因，E基因，ORF1ab基因分别设计了数组 LAMP扩增引物，并采用荧光信号读出，用于新冠病毒检测，在实施例1 中本发明人用高浓度测试了引物的有效性，后稀释样本，实施例2表明0.5 拷贝/微升浓度样本可以被检出。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 新型冠状病毒等温扩增引物、检测方法及应用
<130> YZDI-200058
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcttctacg cagaaggga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgacagttt ggccttgttg 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctactgctg cctggagttg aagcctcttc tcgttcctca tc 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggtgatgc tgctcttgct ttgttggcct ttaccagaca 40
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttgaactg ttgcgactac g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctgctgct tgacagattg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcagtcaag cctcttctc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgctctcaa gctggttcaa 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcccctact gctgcctgga gttcctcatc acgtagtcgc 40
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttctcctgct agaatggctg gctctgtcaa gcagcagcaa ag 42
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggtgatgc tgctctt 17
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttcggaaga gacaggtac 19
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggaactcta gaagaattca ga 22
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcagtaagg atggctagtg tagcgtactt ctttttcttg ctt 43
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgattgtgt gcgtactgct gtttttaaca cgagagtaaa cgt 43
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
actagcaaga ataccacga 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgtgagtct tgtaaaacc 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgtgttgtc tgtactgc 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gactgaagca tgggttcg 18
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agcacaagtt gtaggtattt gtacacgttg ccacatagat catcc 45
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatgaccctg tgggttttac acttttgatc acaactacag ccata 45
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tctgcggtat gtggaaag 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcgtgttgtc tgtactgc 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gactgaagca tgggttcg 18
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agcacaagtt gtaggtattt gtacacgttg ccacatagat catcc 45
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aatgaccctg tgggttttac acttttgatc acaactacag ccata 45
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aacacagtct gtaccgtc 18
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acttaaaaac acagtctgta cc 22
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcaaaagccc tgtatacga 19
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgactgaagc atgggttcgc gtctgcggta tgtggaaag 39
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gctgatgcac aatcgttttt aaacgcatca gtactagtgc ctgt 44
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttgatcaca actacagcc 19
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tttgcggtgt aagtgca 17
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttgtgctaat gaccctgt 18
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcaaaagccc tgtatacga 19
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttgatcacaa ctacagccat aacctcactt aaaaacacag tctgtacc 48
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gctgatgcac aatcgttttt aaacgcatca gtactagtgc ctgt 44
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<210> 39
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