具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。

下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

下述实施例中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、西瓜潜隐病毒(citrullus lanatuscryptic virus，CiLCV)、辣椒内源病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus，SqMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)均为本领域常规生物材料。

实施例1：引物的设计与合成

基于GenBank登录号为KT727022的甜瓜内源病毒基因组，经过大量序列分析、序列设计、人工筛选优化、效果验证，针对病毒编码区域，获得了用于鉴定甜瓜内源病毒polyprotein gene的特异引物对。特异引物对由CMEV-755-F和CMEV-755-R组成，扩增polyprotein gene的623位-1377位。引物序列如下：

CmEV-755-F：5'-CGTGGAAATTGCACTTCCGAGAT-3'(SEQ ID NO.1)；

CmEV-755-R：5'-CTAGCAACTTGTTTGCTGGCACACG-3'(SEQ ID NO.2)；

其中，CmEV-755-F为正向引物，CmEV-755-R为反向引物。

上述特异引物对的理论扩增产物大小为755bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所示，对应的RNA序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

5'-CGTGGAAATTGCACTTCCGAGATGTTAGAGGTTTTAAACAAACTTGTGGCTAAATTTGGAGAATATGAGGCTTATTATAACGTTTATTTAGAAACTCAACATAGACATTTCGGATACCTACAGAAAGAAGACAATGGGAAGTACTCCTTCATCAATGCAAAATTCAATCCACTCAAGAAGTGCTCAGTGTGTAAGTACATGAACCATTATGAGGAGATGATAAGGGGTCTTAGGATGGTCCATTACAGTTTAAAACATTACAGACCAAAATCGAAGGTAGTGACTGATGAATTCTTAACCACATATAATGTGGGAGATGTAATAGAGGATGTCCCTTGGCGTTGTGGATACTGTTTTTCAGATTTAAATTTGCAAGTGTTTATGCGAGAGGATAGATTACAAGAATTAATCCAGATTGTCACTCAGCATTTGTTTGTGCTTATGGGAGACATAGAGCAACTTCTAAAGATGGGTTATGGAGACCTATATGATGATATGGACGTGGCTAGCAAAGAAAAATTAAAATCAGCTGATCAAGTGATCGTTAACGAGTATTTTTACCATTTGCAACGCAAAATAATACCAGTGGGGCGCGATTTTGATGCTGCACAGAGTAAGACTATTACAGAAGTATTGGGTGGTTGTTTCTTTAAGCCACAAAGCAAATTAAATAGTGTGAAACCCGAATTTATAGCTGAACTATCAACTTTAACTGAACTAATTGAAAAATCGTGTGCCAGCAAACAAGTTGCTAG-3'(SEQ ID NO.3)。

5'-CGUGGAAAUUGCACUUCCGAGAUGUUAGAGGUUUUAAACAAACUUGUGGCUAAAUUUGGAGAAUAUGAGGCUUAUUAUAACGUUUAUUUAGAAACUCAACAUAGACAUUUCGGAUACCUACAGAAAGAAGACAAUGGGAAGUACUCCUUCAUCAAUGCAAAAUUCAAUCCACUCAAGAAGUGCUCAGUGUGUAAGUACAUGAACCAUUAUGAGGAGAUGAUAAGGGGUCUUAGGAUGGUCCAUUACAGUUUAAAACAUUACAGACCAAAAUCGAAGGUAGUGACUGAUGAAUUCUUAACCACAUAUAAUGUGGGAGAUGUAAUAGAGGAUGUCCCUUGGCGUUGUGGAUACUGUUUUUCAGAUUUAAAUUUGCAAGUGUUUAUGCGAGAGGAUAGAUUACAAGAAUUAAUCCAGAUUGUCACUCAGCAUUUGUUUGUGCUUAUGGGAGACAUAGAGCAACUUCUAAAGAUGGGUUAUGGAGACCUAUAUGAUGAUAUGGACGUGGCUAGCAAAGAAAAAUUAAAAUCAGCUGAUCAAGUGAUCGUUAACGAGUAUUUUUACCAUUUGCAACGCAAAAUAAUACCAGUGGGGCGCGAUUUUGAUGCUGCACAGAGUAAGACUAUUACAGAAGUAUUGGGUGGUUGUUUCUUUAAGCCACAAAGCAAAUUAAAUAGUGUGAAACCCGAAUUUAUAGCUGAACUAUCAACUUUAACUGAACUAAUUGAAAAAUCGUGUGCCAGCAAACAAGUUGCUAG-3'(SEQ ID NO.4)。

针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C1-F和CmEV-C1-R，预期扩增产物长度为413bp，具体序列如下：

CmEV-C1-F：5'-GGTGGAATATGGGTTGATGCTAG-3'(SEQ ID NO.5)

CmEV-C1-R：5'-CGTCGTGATGGACATCAACTCTAC-3'(SEQ ID NO.6)

针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C2-F和CmEV-C2-R，预期扩增产物长度为710bp，具体序列如下：

CmEV-C2-F：5'-GAGGTGAACACAGCACTTGTTG-3'(SEQ ID NO.7)

CmEV-C2-R：5'-CCAGAGAATAATGGACAGCCAC-3'(SEQ ID NO.8)

针对甜瓜内源病毒polyprotein gene设计对照引物对CmEV-C3-F和CmEV-C3-R，预期扩增产物长度为381bp，具体序列如下：

CmEV-C3-F：5'-AAGSGAGAATWATHGTRTGGCA-3'(SEQ ID NO.9)

CmEV-C3-R：5'-CTAGWGCKGTBGTAGCTTGWCC-3'(SEQ ID NO.10)

其中，S代表：g或c，，W代表：a或t/u，H代表：a或c或t/u，R代表：g或a，K代表：g或t/u，B代表：g或c或t/u。

实施例2：鉴定方法的建立

一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法

1、用TRIZOL法或其他可用于提取病毒RNA的试剂盒按照说明提取待测样品的总RNA。

2、以步骤1中提取的总RNA为模板，采用实施例1设计的引物对利用一步法RT-PCR进行扩增。

反应体系如下(25μl)：引物CmEV-755-F 0.5μl(10μmol/L)、引物CmEV-755-R 0.5μl(10μmol/L)、PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl、2x 1step Buffer(Dye Plus)12.5μl、模板1μL(即步骤1提取的总RNA,浓度100ng-200ng/μL)、余量用无RNase的水补足25μl。其中，PrimeScript 1Step Enzyme Mix和2x 1step Buffer(Dye Plus)来源于Takara公司的PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)，货号RR057A。

反应条件如下：

1.50℃反应30min；

2.94℃反应2min；

3.94℃反应30s；

4.55℃反应30s；

5.72℃反应35s；

6.72℃反应5min

其中从步骤3-5反应30个循环。

3、取步骤2的产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。并以甜瓜内源病毒作为阳性对照样品。

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有755bp的DNA片段，则结果为阳性，待测病毒样品中含有甜瓜内源病毒。

若阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段，而检测样品的扩增产物不含有755bp的DNA片段，则结果为阴性，待测病毒样品中不含甜瓜内源病毒。

若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法

1、用TRIZOL法或其他可用于提取植物RNA的试剂盒按照说明提取待测植物的总RNA，样品可为叶片或种子等待测的植物组织。

2、同“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤2。

3、同“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤3。

若阳性对照样品和检测样品的扩增产物均含有755bp的DNA片段，则结果为阳性，待测植物材料已感染甜瓜内源病毒。

若阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段，而检测样品的扩增产物不含有755bp的DNA片段，则结果为阴性，待测植物材料未感染甜瓜内源病毒。

若阳性对照样品无特异性扩增，判断检测过程有误，需重新检测。

实施例3：特异性实验

待测病毒如下：

甜瓜内源病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、西瓜潜隐病毒、辣椒内源病毒、南瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒。

实验组：已经确定分别感染了上述病毒的植物的检测样品，按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法”进行检测。

结果见图1。图1中，泳道1对应检测含有甜瓜内源病毒的阳性对照甜瓜样品的扩增产物；泳道2对应检测含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道3对应检测含有黄瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道4对应检测含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道5对应检测含有辣椒内源病毒的辣椒样品的扩增产物；泳道6对应检测含有南瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道7对应检测含有西瓜花叶病毒的西瓜样品的扩增产物；泳道8对应检测含有小西葫芦黄花叶病毒的南瓜样品的扩增产物；泳道9对应检测健康的甜瓜样品的扩增产物；泳道M对应DNA DL2000 Marker。除泳道1对应的甜瓜内源病毒的阳性对照样品的扩增产物含有755bp的DNA片段外，其它待检测样品均无特异性扩增条带，表明本发明建立的甜瓜内源病毒RT-PCR检测方法具有良好的特异性。

对照组1：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C1-F和CmEV-C1-R，结果见图2。图2中显示了一些非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。

对照组2：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C2-F和CmEV-C2-R，结果见图3。图3中显示了一些不同程度的非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。针对黄瓜花叶病毒的西瓜样品也有可见扩增条带。

对照组3：与实验组的差别在于，将引物替换成CmEV-C3-F和CmEV-C3-R，结果见图4。图4中显示了一些不同程度的非特异性扩增条带，说明这对引物的特异性不好。针对健康的甜瓜样品之外的其他样品有不同程度的扩增条带，而针对含有西瓜潜隐病毒的西瓜样品有三条肉眼可见条带，特异性较差。

实施例4：灵敏度试验

待测病毒如下：甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus，CmEV)。

1、利用TRIZOL法提取确定含有甜瓜内源病毒的甜瓜叶片总RNA。

2、取步骤1得到的总RNA，用无菌水进行十倍梯度稀释，分别得到如下RNA溶液：RNA浓度为200ng/μl的RNA溶液1，RNA浓度为20ng/μl的RNA溶液2，RNA浓度为2ng/μl的RNA溶液3，RNA浓度为2×10^-1ng/μl的RNA溶液4，RNA浓度为2×10^-2ng/μl的RNA溶液5，RNA浓度为2×10^-3ng/μl的RNA溶液6，RNA浓度为2×10^-4ng/μl的RNA溶液7，RNA浓度为2×10^-5ng/μl的RNA溶液8。

3、以步骤2得到的RNA溶液为模板，每个反应体系中上述RNA溶液的用量均为1μl，采用实施例1设计的引物对进行一步法RT-PCR扩增。

反应体系和反应条件参考实施例2的“一、鉴定待测病毒是否为甜瓜内源病毒的方法”的步骤2，以无菌水作为空白对照。

4、取步骤3的扩增产物，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

结果见图5。图5中，泳道1对应RNA溶液1、泳道2对应RNA溶液2，泳道3对应RNA溶液3，泳道4对应RNA溶液4，泳道5对应RNA溶液5，泳道6对应RNA溶液6，泳道7对应RNA溶液7，泳道8对应RNA溶液8，泳道9对应空白对照(无菌水)，泳道M对应DNA DL2000Marker。结果表明，模板中病毒RNA浓度为2ng/μl或更高(泳道3)时检测结果均为阳性。表明本发明建立的甜瓜内源病毒PCR检测方法具有良好的灵敏性。

实施例5：检测待测植物样本

1、甜瓜样本

取若干具有甜瓜内源病毒病发病症状的甜瓜叶片和不含有甜瓜内源病毒的甜瓜叶片，作为待测植物材料。各个待测植物材料取自不同甜瓜植株。

取待测植物材料，利用TRIZOL法提取待测甜瓜叶片总RNA，然后按照实施例2的“二、鉴定待测植物材料是否感染甜瓜内源病毒的方法”进行检测。

结果见图6。图6中，泳道1、2、3和4示出了采用本发明引物检测待测植物甜瓜中是否感染甜瓜内源病毒的检测结果；泳道5和6示出了不含有甜瓜内源病毒的对照样品检测结果；泳道M对应DNA DL2000Marker；另将泳道1、2、3和4对应的四份样品的扩增产物分别用Sanger法测序，其核苷酸序列均与前述SEQ ID No.3完全相同，且Blast分析后为甜瓜内源病毒。结果表明本发明建立的甜瓜内源病毒RT-PCR检测方法能够有效地从甜瓜样品中鉴定出甜瓜内源病毒。

以上结果表明，各个含有甜瓜内源病毒的待测植物材料均检测出含有甜瓜内源病毒，本发明提供的方法的准确性为100％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种用于扩增甜瓜内源病毒的引物对及其应用

<130> C1CNCN210094

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtggaaatt gcacttccga gat 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagcaactt gtttgctggc acacg 25

<210> 3

<211> 755

<212> DNA

<213> 甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus)

<400> 3

cgtggaaatt gcacttccga gatgttagag gttttaaaca aacttgtggc taaatttgga 60

gaatatgagg cttattataa cgtttattta gaaactcaac atagacattt cggataccta 120

cagaaagaag acaatgggaa gtactccttc atcaatgcaa aattcaatcc actcaagaag 180

tgctcagtgt gtaagtacat gaaccattat gaggagatga taaggggtct taggatggtc 240

cattacagtt taaaacatta cagaccaaaa tcgaaggtag tgactgatga attcttaacc 300

acatataatg tgggagatgt aatagaggat gtcccttggc gttgtggata ctgtttttca 360

gatttaaatt tgcaagtgtt tatgcgagag gatagattac aagaattaat ccagattgtc 420

actcagcatt tgtttgtgct tatgggagac atagagcaac ttctaaagat gggttatgga 480

gacctatatg atgatatgga cgtggctagc aaagaaaaat taaaatcagc tgatcaagtg 540

atcgttaacg agtattttta ccatttgcaa cgcaaaataa taccagtggg gcgcgatttt 600

gatgctgcac agagtaagac tattacagaa gtattgggtg gttgtttctt taagccacaa 660

agcaaattaa atagtgtgaa acccgaattt atagctgaac tatcaacttt aactgaacta 720

attgaaaaat cgtgtgccag caaacaagtt gctag 755

<210> 4

<211> 755

<212> RNA

<213> 甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus)

<400> 4

cguggaaauu gcacuuccga gauguuagag guuuuaaaca aacuuguggc uaaauuugga 60

gaauaugagg cuuauuauaa cguuuauuua gaaacucaac auagacauuu cggauaccua 120

cagaaagaag acaaugggaa guacuccuuc aucaaugcaa aauucaaucc acucaagaag 180

ugcucagugu guaaguacau gaaccauuau gaggagauga uaaggggucu uaggaugguc 240

cauuacaguu uaaaacauua cagaccaaaa ucgaagguag ugacugauga auucuuaacc 300

acauauaaug ugggagaugu aauagaggau gucccuuggc guuguggaua cuguuuuuca 360

gauuuaaauu ugcaaguguu uaugcgagag gauagauuac aagaauuaau ccagauuguc 420

acucagcauu uguuugugcu uaugggagac auagagcaac uucuaaagau ggguuaugga 480

gaccuauaug augauaugga cguggcuagc aaagaaaaau uaaaaucagc ugaucaagug 540

aucguuaacg aguauuuuua ccauuugcaa cgcaaaauaa uaccaguggg gcgcgauuuu 600

gaugcugcac agaguaagac uauuacagaa guauugggug guuguuucuu uaagccacaa 660

agcaaauuaa auagugugaa acccgaauuu auagcugaac uaucaacuuu aacugaacua 720

auugaaaaau cgugugccag caaacaaguu gcuag 755

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatat gggttgatgc tag 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtcgtgatg gacatcaact ctac 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggtgaaca cagcacttgt tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagagaata atggacagcc ac 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagsgagaat wathgtrtgg ca 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctagwgckgt bgtagcttgw cc 22