一种虾天然防黑变剂及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种虾天然防黑变剂及其制备方法和用途 (Natural anti-blackening agent for shrimps as well as preparation method and application thereof ) 是由 曹敏杰 杜雪莉 章骞 杨汝晴 翁凌 陈玉磊 孙乐常 张凌晶 刘光明 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种虾天然防黑变剂及其制备方法和用途,制备方法包括以下步骤：粗提：绿豆浸泡后捣碎,进行离心处理取上清液,得到粗提液；热处理：将所述粗提液加热后,冷却离心取上清液,得到粗溶液；超滤膜分离：将所述粗溶液采用截留分子量为11-16KDa的超滤膜进行分离,收集透过液；将透过液用截留分子量为4-6KDa的超滤膜进行分离,收集未透过超滤膜的液体,得到浓缩液；干燥制粉：将所述浓缩液干燥制粉,即为虾天然防黑变剂。本发明所述虾天然防黑变剂可以显著延长虾黑变的时间,满足虾运输时间的要求,保证虾的品质和价值,具有极强的市场运用前景。(The invention relates to a natural anti-blackening agent for shrimps as well as a preparation method and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: crude extraction: soaking semen Phaseoli Radiati, mashing, centrifuging, and collecting supernatant to obtain crude extractive solution; and (3) heat treatment: heating the crude extract, cooling, centrifuging and taking supernatant to obtain a crude solution; and (3) ultrafiltration membrane separation: separating the crude solution by adopting an ultrafiltration membrane with the molecular weight cutoff of 11-16KDa, and collecting a permeate; separating the permeate with ultrafiltration membrane with molecular weight cutoff of 4-6KDa, and collecting the liquid which does not permeate the ultrafiltration membrane to obtain concentrated solution; drying to prepare powder: and drying the concentrated solution to prepare powder, thus obtaining the natural shrimp blackening preventing agent. The natural shrimp blackening preventing agent can obviously prolong the shrimp blackening time, meets the requirement of shrimp transportation time, ensures the quality and value of the shrimps, and has strong market application prospect.)
技术领域
本发明涉及虾保鲜技术领域，尤其是一种虾天然防黑变剂及其制备方法和用途。
背景技术
在我国南方地区如海南、广东、广西、福建等省，由于水域辽阔，气候适宜，虾已经成为水产养殖的支柱产业。虾的品种繁多，以对虾为例，对虾营养丰富、壳薄体肥、味道鲜美，具有脂肪含量低、蛋白含量高、营养平衡性好、含有丰富的维生素和矿物质，深受广大消费者的喜爱。
但是，虾死后容易产生黑变，失去其营养价值和经济价值。虾死后的黑变现象主要是由于多酚氧化酶存在引起的一些酶促反应。黑变一般从头部开始，逐渐扩散到前泳足然后到甲壳下部分从而扩散到全身。虾死后，酚氧化酶酶原被激活，被激活的多酚氧化酶即使在较低的温度下保存仍然具有一定的活性。当有氧气存在的条件下多酚氧化酶与虾体中的酪氨酸及酚类物质发生反应，氧化产生大量黑色素，而这些黑色素大多可以和蛋白质结合，因此很难去除掉。为此，现有技术中采用特定的保鲜剂来进行虾的处理。例如，申请公布号CN107156263A的发明专利，公开了一种海水虾的保鲜剂及其使用方法，针对直接复配化合物获得保鲜剂对人体健康具有潜在危害以及天然保鲜剂的保鲜效果仍不够理想的问题，提供了一种源于天然植物的保鲜剂，该保鲜剂可有效延缓海水虾的黑变和挥发性盐基氮的增加，延长海水虾的保鲜期。本发明海水虾的保鲜剂包括如下重量份的原料：中药粉3～5份、酵素粉5～8份、大豆粉2～5份、麦芽糊精30～45份、黄原胶0.5～1.5份、蜂蜜1～2份、食用香精0.01～0.05份、水150～200份。该发明低温保藏海水虾防黑变效果可保持7天。但该方法成分复杂，使用成本较高，防黑变效果有待提高，不易于大规模应用。
申请公布号CN 106259829 A的发明专利，公开一种天然防黑变剂，按质量份数计，包括以下组分：银合欢种子冻干粉0.5～0.8份，去离子水100～160份，天然增稠剂1.2～3；还涉及该天然防黑变剂的制备方法和应用。该发明中的天然防黑变剂以纯天然的银合欢种子为原料，对南美白虾具有明显的防黑变以及保鲜作用。该发明低温保藏虾防黑变效果可保持10-14天。但该方法需要采用低温等离子体处理，并且采用银合欢种子作为原料，使用成本较高，不易于大规模应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的虾保鲜剂存在的问题，提供一种虾天然防黑变剂，以绿豆为原料，经过特殊的提取工艺获得，在虾的保鲜上具有显著效果，适用于对虾、南美白虾、水晶虾、北极虾等。
发明人研究发现，虾头部存在一种可使虾产生黑变的多酚氧化酶，这是一种活性中心含有Cu2+的金属酶。在活虾中，多酚氧化酶以酚氧化酶酶原(Prophenoloxidase，proPO)形式存在，此时并不具备活性。当虾死后，虾胰腺破裂，虾体内酶平衡被打破，酚氧化酶原被激活成具有活性的多酚氧化酶，催化体内单酚类物质转变为黑色素，引起虾的黑变，从而导致感官品质的下降以及营养的流失，降低其市场价值。发明人认为，找到能够抑制酚氧化酶原被激活成多酚氧化酶的物质，则可以从根本上解决虾黑变问题。
如何找到这种物质是本发明的关键。发明人研究发现，酚氧化酶原激活系统是一个有丝氨酸蛋白酶(SP)参与的复杂系统，进行精密的级联反应，从而将酚氧化酶原(ProPO)激活为多酚氧化酶(PO)，其激活机制如图1所示。因此，抑制丝氨酸蛋白酶的活性，从而抑制酚氧化酶原被激活成多酚氧化酶，有望从源头上抑制虾的黑变。
发明人早期研究绿豆的深加工处理时，经分离纯化得到绿豆胰蛋白酶(参见CN102295700 A)，绿豆胰蛋白酶(MBTI)属于Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为8883Da，对热、酸、碱、酶消化的稳定性很高。进一步深入研究发现，该绿豆胰蛋白酶(MBTI)对丝氨酸蛋白酶具有强抑制作用，即在5ng/mL的极低浓度下使得和肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的活力下降至10％左右。因此，本发明对该现有技术进行改进，创造性的通过粗提、热处理、超滤膜分离从绿豆中分离出含有较高浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂的浓缩液，并通过干燥制成粉剂，方法简单，得率高，在防止虾黑变上具有显著的效果。
在本发明所述虾天然防黑变剂制备方法中，粗提的作用为从绿豆中提取出活性组分,热处理的作用为热变性去除杂蛋白，因为目标对象丝氨酸蛋白酶抑制剂具有强耐热性。超滤膜分离的作用为纯化、富集得到高浓度的虾天然防黑变剂，干燥制粉的作用为将对虾天然防黑变剂浓缩液干燥后制成粉末，便于储存和使用。
具体方案如下：
一种虾天然防黑变剂的制备方法，包括以下步骤：
粗提：绿豆浸泡后捣碎，进行离心处理取上清液，得到粗提液；
热处理：将所述粗提液在80-100℃下加热30-60min后，冷却后离心处理取上清液，得到粗溶液；
超滤膜分离：将所述粗溶液采用截留分子量为11-16KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；将透过液用截留分子量为4-6KDa的超滤膜进行分离，收集未透过超滤膜的液体，得到浓缩液；
干燥制粉：将所述浓缩液干燥制粉，即为虾天然防黑变剂。
进一步的，粗提步骤中，将绿豆浸泡于3-5倍体积的水中8-10h，然后捣碎，进行离心处理的重力加速度为8000-12000g，离心10-30min取上清液。
进一步的，热处理步骤中，进行离心处理的重力加速度为8000-12000g，离心10-30min取上清液。
进一步的，超滤膜分离步骤中，将所述粗溶液采用截留分子量为14-16KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；将透过液用截留分子量为5-6KDa的超滤膜进行分离，收集未透过超滤膜的液体，得到浓缩液。
进一步的，所述干燥制粉为冷冻干燥制粉或喷雾干燥制粉。
本发明还保护一种虾天然防黑变剂，运用所述虾天然防黑变剂的制备方法制备得到。
进一步的，所述虾天然防黑变剂含有能够抑制丝氨酸蛋白酶活性的组分，分子量为8-9KDa。
本发明还保护所述虾天然防黑变剂在虾保鲜上的运用。
本发明还保护一种虾保鲜的方法，采用所述虾天然防黑变剂，包括：将所述虾天然防黑变剂溶于水中，得到防黑变溶液；将虾浸没于所述防黑变溶液中浸泡处理；之后取出虾沥干水分。
进一步的，将所述虾天然防黑变剂溶于水中，得到浓度为0.1-0.3wt％的防黑变溶液；将虾浸没于所述防黑变溶液中，0-4℃浸泡20-30min后取出，沥干水分，最后置于0-4℃环境下储藏备用。
有益效果：
(a)本发明从绿豆中制备的虾天然防黑变剂，含有高浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有良好的热稳定性和pH稳定性，产品耐储存，可以长期保持活性。
(b)本发明中虾天然防黑变剂对抑制虾黑变具有显著效果，解决了虾黑变给保鲜、贮藏、运输和加工带来诸多不便，提高了虾制品的品质，延长了货架期，具有很高的推广应用价值。
(c)本发明以绿豆为原料开发的虾天然防黑变剂，成本低，能够实现大规模应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1是本发明提供的丝氨酸蛋白酶参与的酚氧化酶原激活机制图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1：虾天然防黑变剂及其制备
第一步，粗提：绿豆浸泡于3倍体积蒸馏水中10h，进行捣碎处理，于8000g(重力加速度)，离心30min取上清，所得上清即为粗提液；
第二步，热处理：粗提液在80℃下加热60min后，立即冷却至室温，于8000g，离心30min取上清，所得上清即为粗溶液；
第三步，超滤膜分离：所述粗溶液采用截留分子量为16KDa的超滤膜进行分离，收集透过液，将透过液用截留分子量为4KDa的超滤膜进行分离和浓缩，收集未透过液，得到虾天然防黑变剂浓缩液；
第四步，干燥制粉:将虾天然防黑变剂浓缩液喷雾干燥制粉后即为虾天然防黑变剂成品。
实施例2：虾天然防黑变剂及其制备
第一步，粗提：绿豆浸泡于5倍体积蒸馏水中8h，进行捣碎处理，于12000g，离心10min取上清，所得上清即为粗提液；
第二步，热处理：粗提液在100℃下加热30min后，立即冷却至室温，于12000g，离心10min取上清，所得上清即为粗溶液；
第三步，超滤膜分离：所述粗溶液采用截留分子量为15KDa的超滤膜进行分离，收集透过液，将透过液用截留分子量为6KDa的超滤膜进行分离和浓缩，收集未透过液，得到虾天然防黑变剂浓缩液；
第四步，干燥制粉:将虾天然防黑变剂浓缩液喷雾干燥制粉后即为虾天然防黑变剂成品。
实施例3：虾天然防黑变剂及其制备
第一步，粗提：绿豆浸泡于4倍体积蒸馏水中9h，进行捣碎处理，于10000g，离心20min取上清，所得上清即为粗提液；
第二步，热处理：粗提液在90℃下加热45min后，立即冷却至室温，于10000g，离心20min取上清，所得上清即为粗溶液；
第三步，超滤膜分离：所述粗溶液采用截留分子量为11KDa的超滤膜进行分离，收集透过液，将透过液用截留分子量为4KDa的超滤膜进行分离和浓缩，收集未透过液，得到虾天然防黑变剂浓缩液；
第四步，干燥制粉:将虾天然防黑变剂浓缩液冷冻干燥制粉后即为虾天然防黑变剂成品。
实施例4：虾天然防黑变剂在虾保鲜中的应用
1)将实施例1制备的虾天然防黑变剂溶于无菌水中，配制成0.1％天然防黑变溶液；
2)挑选新鲜虾洗净后浸没于所述天然防黑变溶液中，0-4℃浸泡30min
3)捞出虾，置于纱网上沥水，沥水后的虾置于0-4℃低温环境下储藏。
未经本发明天然防黑变剂处理(新鲜虾洗净沥水后直接0-4℃冷藏)的冷藏虾第5天出现黑变，采用本发明实施例4处理的冷藏虾第15天出现黑变。
实施例5：虾天然防黑变剂在虾保鲜中的应用
1)将实施例2制备的虾天然防黑变剂溶于无菌水中，配制成0.3％天然防黑变溶液；
2)挑选新鲜虾洗净后浸没于所述天然防黑变溶液中，4℃下浸泡20min
3)捞出虾，置于纱网上沥水，沥水后的虾置于0-4℃低温环境下储藏。
未经本发明天然防黑变剂处理(新鲜虾洗净沥水后直接0-4℃冷藏)的冷藏虾第5天出现黑变，采用本发明实施例5处理的冷藏虾第16天出现黑变。
实施例6：虾天然防黑变剂在虾保鲜中的应用
1)将实施例3制备的虾天然防黑变剂溶于无菌水中，配制成0.2％天然防黑变溶液；
2)挑选新鲜虾洗净后浸没于所述天然防黑变溶液中，4℃下浸泡25min
3)捞出虾，置于纱网上沥水，沥水后的虾置于0-4℃低温环境下储藏。
未经本发明天然防黑变剂处理(新鲜虾洗净沥水后直接0-4℃冷藏)的冷藏虾第5天出现黑变，采用本发明实施例6处理的冷藏虾第16天出现黑变。
对比例1
参照实施例1，区别仅在于用黄豆替换绿豆，按照相同的方法得到虾天然防黑变剂成品，运用在虾保鲜处理上，处理方法同实施例4，发现经黄豆提取出的虾天然防黑变剂成品在效果上与新鲜虾洗净沥水后直接0-4℃冷藏的效果相当，即冷藏虾第5天出现黑变。
对比例2
参照CN 102295700 A得到高纯度绿豆胰蛋白酶抑制剂，用来虾保鲜，由于该方法步骤多、流程长，生产成本高，产品得率低，造成使用成本高，不具有作为虾保鲜剂的现实意义。
另一方面，该方法制备过程中使用硫酸、碱、Tris-HCl等试剂，这些试剂的残留会对虾的保鲜极为不利。
最后，该方法采用NaCl梯度的盐淋洗，使得产品中含盐量高，运用在虾保鲜上会影响虾的口感，降低其新鲜度。
因此，本发明通过粗提、加热和膜处理形成一套简便的加工方法，同时避免引入额外试剂，通过控制上述步骤的具体条件，保证目前产物的活性不丧失，结合膜分离进行高效的分离和浓缩，产品含盐量低，非常适合虾保鲜。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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