Gl-v9在制备抑制胰腺癌药物中的应用
阅读说明：本技术 Gl-v9在制备抑制胰腺癌药物中的应用 (Application of GL-V9 in preparation of pancreatic cancer inhibition drug ) 是由 卢娜 郭青龙 赵凯 赵越 曹汪佳 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：为了研究GL-V9多环节、多途径的抗胰腺癌作用,在抑制胰腺癌细胞生长的基础上,本发明提供了GL-V9在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用,所述GL-V9分子式为C-(24)H-(27)NO-(5),其化学结构式如式Ⅰ所示：本发明还提供一种抑制胰腺癌的药物组合物,所述药物组合物以GL-V9为活性成分,辅以药学上可接受的载体。本发明表明GL-V9能够有效抑制胰腺癌细胞增殖,迁移,侵袭,并抑制胰腺癌细胞转移相关蛋白表达。这些作用表明GL-V9可用于抑制胰腺癌细胞转移的治疗,具有开发药物的前景。(In order to research the pancreatic cancer resistance of GL-V9 through multiple links and pathways, the invention provides application of GL-V9 in preparation of a medicament for inhibiting pancreatic cancer invasion and metastasis on the basis of inhibiting pancreatic cancer cell growth, wherein the molecular formula of GL-V9 is C 24 H 27 NO 5 The chemical structural formula is shown as formula I: the invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting pancreatic cancer, which takes GL-V9 as an active ingredient and is assisted by a pharmaceutically acceptable carrier. The GL-V9 can effectively inhibit proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer cells and inhibit the expression of pancreatic cancer cell metastasis related proteins. These effects indicate that GL-V9 can be used for inhibiting pancreatic cancer cell proliferationThe treatment of cell metastasis has the prospect of developing medicaments.)
技术领域
本发明公开了汉黄芩素衍生物GL-V9在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用，具体涉及GL-V9新用途。
背景技术
肿瘤转移是导致90％的肿瘤相关死亡的原因。在肿瘤转移性散播时，肿瘤细胞从原发灶侵袭到周围组织，进入淋巴和血液系统的微血管，通过血道转移到远端组织的微血管中存活，接着从血管中渗出，在转移灶中生存并增殖形成新的肿瘤组织。在全球范围内，胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率低于1％，是预后最差的肿瘤之一。而在目前对胰腺癌的治疗中，根本的治疗原则仍然是以外科手术治疗为主，结合放化疗等综合治疗，但整体疗效差；同时预后极差。未接受治疗的胰腺癌病人的生存期约为4个月，切除手术后病人一般能生存16个月。同时，胰腺癌极易转移及复发，使胰腺癌的临床治疗面临严峻的挑战。
因此，针对胰腺癌的侵袭及转移，寻找安全有效的抗转移药物对治疗胰腺癌及抑制胰腺癌转移具有重要意义。
发明内容
为了研究汉黄芩素衍生物GL-V9多环节、多途径的抗胰腺癌作用，在抑制胰腺癌细胞生长的基础上，本发明提供了GL-V9在制备抑制胰腺癌侵袭转移药物中的应用，为开发抑制胰腺癌转移药物提供依据。
为达到上述发明目的，本发明技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供GL-V9在制备抑制胰腺癌药物中的应用，所述GL-V9分子式为C24H27NO5，其化学结构式如式Ⅰ所示：
进一步的，所述药物为能够抑制胰腺癌细胞增殖的药物。
进一步的，所述药物为能够抑制胰腺癌细胞迁移的药物。
进一步的，所述药物为能够抑制胰腺癌细胞侵袭的药物。
进一步的，所述药物为能够抑制胰腺癌细胞转移相关蛋白表达的药物。
进一步的，前述胰腺癌细胞为人源胰腺癌细胞PANC-1。
进一步的，前述相关蛋白为MMP-9，MMP-14，Vimentin，CD44中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种抑制胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物以GL-V9为活性成分，辅以药学上可接受的载体。
本发明所述抑制胰腺癌的药物组合物在抑制胰腺癌细胞时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到抑制胰腺癌的目的。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。
相对于现有技术，本发明表明GL-V9能够有效抑制胰腺癌细胞增殖，迁移，侵袭，并抑制胰腺癌细胞转移相关蛋白表达。这些作用表明GL-V9可用于抑制胰腺癌细胞转移的治疗，具有开发药物的前景。
附图说明
图1.GL-V9抑制人胰腺癌细胞PANC-1增殖试验结果图。
图2.GL-V9抑制人胰腺癌细胞PANC-1迁移试验结果图。
图3.GL-V9抑制人胰腺癌细胞PANC-1侵袭试验结果图。
图4.GL-V9抑制侵袭转移相关蛋白表达试验结果图。
图5.GL-V9结构式。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明。
实施例1
一、试验材料
(1)药物
GL-V9(C24H27O5N，分子量：409.47)由中国药科大学提供，淡黄色粉末，纯度为98％，用DMSO配制成母液，-20℃保存。临用前稀释成所需浓度。
(2)细胞株
人源胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海生命科学研究所生物化学与细胞生物学研究所细胞库，用含10％胎牛血清DMEM培养液培养。
(3)试剂
1)培养液：DMEM培养基购自美国GIBCO公司，取DMEM粉末10.4g溶于1000mL灭菌三蒸水中，加入3.7g NaHCO3调pH值至7.2-7.4，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素。
2)胎牛血清：美国GIBICO公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
3)苏木素染液：购自上海生工生物工程股份有限公司。
4)伊红染液：购自上海生工生物工程股份有限公司。
5)Transwell小室(0.8μm)：购自美国Millipore公司。
6)Matrigel(含酚红)：购自美国Corning公司。
7)MTT溶液：MTT粉末购买于美国Sigma-Aldrich公司。称取500mg MTT粉末加入100mL PBS溶液，超声溶解使之混匀成5mg/mL的MTT溶液，并且用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，分装，置于4℃冰箱保存。
二、实验仪器
(1)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo Fisher Scientific公司。
(2)Axiocam ICC5正置荧光显微镜：德国Carl Zeiss公司。
(3)Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司。
(4)Power Pac Basic基础电泳：美国BIO-RAD公司。
(5)Mini-ProteanTetra System全湿型转膜槽：美国BIO-RAD公司。
(6)Varioskan全波长酶标仪；购于美国Thermo Fisher Scientific公司。
(7)血球计数板；购于上海求精生化试剂仪器有限公司。
三、试验方法及试验结果
(1)四甲基偶氮唑盐(MTT)法验证GL-V9抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖
MTT法又被称为MTT比色法，是一种检测细胞活力的方法。其检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可以将MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，而死细胞没有此功能。当用DMSO将甲臢溶解后形成紫色溶液，细胞活力与溶液颜色深浅成正比。因此，根据酶标仪检测到的OD值可以计算出药物对细胞增殖的抑制率。
将处于对数生长期的胰腺癌细胞离心后用新鲜培养基重悬，均以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液体积为100μL，设置三个副孔。设置对照组和加药组，对照组加入0μM GL-V9，加药组分为10组，分别加入0.01μM,0.1μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1000μM的GL-V9。随后，在每个孔中加入100μL相应浓度(0μM，0.01μM,0.1μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1000μM)的GL-V9。24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，并且置于37℃恒温细胞培养箱中避光静置4h。随后，将96孔细胞培养板置于板式离心机中以4000rpm的速度离心20分钟，吸取上清，每孔加入100μLDMSO并置于微型振荡器上震动5分钟使结晶完全溶解。用全波长酶标仪以570nm为检测波长，630nm为参比波长测量吸光度，计算药物对细胞增殖的抑制率(图1)：
抑制率＝(1-加药组平均细胞吸光度/对照组细胞平均吸光度)×100％
结果显示：GL-V9可以明显抑制PANC-1的细胞增殖活力并且呈现出浓度依赖性。当GL-V9作用于PANC-1细胞时，其半数抑制浓度(50％Inhibitory Concentration,IC50)为3.51μM。
(图1)
(2)GL-V9抑制胰腺癌细胞PANC-1迁移
将PANC-1细胞消化接种到6孔板，培养到密度90％时准备划痕。用一个10μl的塑料小枪头在细胞密度90％的孔中央划一条直线，直线应同等粗细。划完后，用PBS把飘起的细胞洗掉。各孔相应加入含不同浓度GL-V9(0μM,2μM,4μM,8μM)的培养基后，放入37℃培养箱培养。分别于24h对各剂量组划痕进行拍照。相同时间点拍照片，直观地观察PANC-1在给予GL-V9处理前后迁移距离的变化。
结果显示：与不给药组相比，给药GL-V9后能剂量依赖性显著减少PANC-1细胞迁移距离，降低PANC-1细胞迁移能力(图2)。
(3)GL-V9抑制胰腺癌细胞PANC-1侵袭
设置对照组和给药组，对照组加入0μM GL-V9；给药组分为3组，分别给PANC-1细胞予GL-V9(2μM,4μM,8μM)。将对照组和给药组放入恒温培养箱培养24h。稀释matrigel(matrigel：无血清培养基＝1:10)，每小室加入100μL已稀释好的matrigel，37℃静置30min以上，造模。消化经GL-V9处理过的PANC-1细胞，用无血清的培养基重悬，将其稀释成2×105个细胞/mL。取出transwell小室放入24孔板孔中。每孔已有600μL含有血清的培养基，小室上层加入细胞悬液400μL。放入孵箱培养24h。取出小室，用棉签擦去微孔滤膜内侧未穿过的细胞。甲醇固定5分钟，纯水清洗。苏木精染色15分钟，纯水清洗；伊红染色20秒，吹水清洗，棉签擦干。显微镜下取左右上下中五个视野，拍照，取平均值。
结果显示：PANC-1细胞分别给予GL-V9(2μM,4μM,8μM)作用24h后，将相同数量的细胞接种入预先铺有Matrigel的transwell小室孵育24h。24h后固定染色可见，给药GL-V9能显著减少PANC-1细胞穿过transwell小室的数量，抑制PANC-1细胞侵袭，且呈剂量依赖性(图3)。
(4)Western blot实验验证GL-V9抑制侵袭转移相关蛋白表达
用不同浓度GL-V9(0μM,2μM,4μM,8μM)处理PANC-1细胞，处理方法为：将PANC-1细胞消化计数并均以30×104个细胞/孔的密度接种到6孔板，培养到密度70-80％时,给药GL-V924h。处理结束后将PANC-1细胞用胰酶消化，收集于tube管中，加入适当体积的细胞裂解液，冰上裂解，离心后所得上清即为提取的蛋白质样品，所述蛋白质样品包括MMP-9,MMP-14,CD44,Vimentin蛋白。计算蛋白质浓度，进行蛋白电泳。将凝胶转移至醋酸纤维素膜上，依次封闭、一抗、二抗孵育(一抗为MMP-9、MMP-14、CD4、Vimentin抗体。二抗为HRP羊抗兔二抗)。最后曝光蛋白条带，分别检测目的蛋白MMP-9,MMP-14,CD44,Vimentin的浓度。
结果显示：PANC-1细胞给予不同浓度的GL-V9结果如图4所示，GL-V9可以有效抑制PANC-1细胞MMP-9，MMP-14，CD44，Vimentin蛋白表达水平。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明保护范围。
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