IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用

文档序号：1604422 发布日期：2020-01-10 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用 (Application of IU1 in preparation of drugs for treating p53 defective tumors ) 是由符达马雨水于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用,属于肿瘤药物技术领域。具有如式I所示的结构的IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。应用小分子抑制剂IU1对去泛素酶USP14的特异性抑制导致p53缺陷小鼠体内淋巴瘤和肉瘤的持久性肿瘤消退,而不影响正常组织,治疗反应与COPS5泛素增加有关。通过USP14的COPS5去泛素和p53依赖和独立调节机制,IU1特异性抑制USP14导致了持久的肿瘤消退。(The invention provides application of IU1 in preparation of a drug for treating p53 defective tumors, and belongs to the technical field of tumor drugs. Application of IU1 with a structure shown as a formula I in preparation of drugs for treating p53 deficient tumors. Specific inhibition of deubiquitinase USP14 with the small molecule inhibitor IU1 resulted in persistent tumor regression of lymphomas and sarcomas in p53 deficient mice without affecting normal tissues, and the therapeutic response was associated with increased COPS5 ubiquitin. Specific inhibition of USP14 by IU1 results in sustained tumor regression through COPS5 deubiquitinating and p53 dependent and independent regulatory mechanisms of USP 14.)

技术领域

本发明属于肿瘤药物技术领域，具体涉及IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。

背景技术

癌基因及抑癌基因在癌症的发生中起着非常重要的作用，癌基因是控制细胞生长和***的正常基因(又称原癌基因)的一种突变形式，能引起正常细胞癌变。癌基因编码的蛋白质主要包括生长因子、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调节因子和细胞周期调控蛋白等几大类型。抑癌基因是正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白往往在细胞周期检验点上起阻止周期进程的作用。癌症的发生是基因突变积累的结果。在1979年，David Lane和Lionel Crawford正在研究一种致癌病毒：SV40。他们找到了该病毒表达的两种蛋白(大T抗原与小T抗原)，并认识到与这两个抗原相作用的蛋白会是理解癌症发病的关键。通过抗原抗体反应，科学家将两个蛋白和其他任何与他们相连的分子提取出来，于是他们发现了一种新的蛋白，其分子量显示为53kd左右，因此被命名为p53。

正常情况下，调控细胞周期启动p53蛋白会监测细胞的“身体状况”。当细胞DNA受到损伤(DDR)时，p53蛋白就会引发细胞周期停滞(cell cycle arrest)状态，继而诱导细胞衰老或凋亡。而当细胞出现异常的有丝***，如中心体的扩增或端粒功能失常时，p53也会毫不留情地清除这些异样细胞，以限制染色体不稳定性的产生。p53同时还控制很多“非经典”通路，如自噬活动、改变新陈代谢和细胞可塑性。除了诱导细胞周期停滞，衰老和凋亡以响应急性DNA损伤，p53还调节细胞行为的其他方面。p53可以保持基因组稳定性。基于p53在急性DNA损伤反应中的作用，p53一直被称为“基因组的守护者”。除了这个角色之外，最近的研究显示p53可以通过其他机制维持基因组完整性。首先，p53反式激活各种DNA修复基因，并直接控制不同形式的DNA修复，包括错配修复、碱基切除修复和核苷酸切除修复。另外p53也被描述为表观基因组的守护者。p53抑制DNA甲基转移酶Dnmt3a和3b，并激活Tetl和Tet2，促进DNA去甲基化。p53通过抑制诸如Glut1和Glut4葡萄糖转运蛋白等基因以及通过激活Sco2等来促进线粒体氧化磷酸化来抑制糖酵解。在肿瘤抑制过程中，p53确实对某种类型的DNA损伤有反应。p53也可能通过细胞外的微环境应激如缺氧和营养饥饿来激活肿瘤抑制效应。

正因为编码蛋白p53的基因具有控制细胞周期、细胞凋亡及控制新生血管形成等多种功能，因此p53已成为癌症研究中一个很有吸引力的药物靶点。针对p53基因突变的药物研究主要有两方面：直接作用于突变型p53基因(恢复p53野生型活性及诱导突变型p53蛋白的降解)和间接作用于突变型p53蛋白。

由于p53基因有很强的抑制细胞生长与启动细胞凋亡的能力，人们设想能否给p53缺陷型肿瘤细胞一个野生型p53基因拷贝，从而达到***的目的。l993年Roth等人提出了利用p53等手段治疗非小细胞肺癌的临床方案。自此有关p53用于各种肿瘤研究的报道越来越多，总的结论是：p53基因治疗具有毒副作用较小的特点。在细胞水平上较易观察到抑癌基因导人肿瘤细胞后产生的控制肿瘤生长的效果。用野生型p53恢复缺陷p53功能的动物肿瘤实验报道也较多，如用脂质体做载体将p53导入肺的原位癌和转移癌使动物的生存期明显延长，用病毒做载体在p53突变鼠表达野生型p53，诱导了肿瘤细胞的凋亡。但限于技术手段，目前还不能将抑癌基因导人活体生长的肿瘤中的大部分细胞，因此难以取得较好的临床疗效。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于恢复p53功能的药理策略的发展及其在p53缺陷小鼠靶向治疗中的应用，因此提供一种小分子抑制剂IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。

本发明提供了具有如式I所示的结构的IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。

优选的，所述IU1通过特异性地抑制USP14的去泛素化活性实现治疗p53缺陷型肿瘤的目的。

本发明提供的具有如式I所示的结构的IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。应用小分子抑制剂IU1对去泛素酶USP14的特异性抑制导致p53缺陷小鼠体内淋巴瘤和肉瘤的持久性肿瘤消退，而不影响正常组织，治疗反应与COPS5泛素增加有关。通过USP14的COPS5去泛素和p53依赖和独立调节机制，USP14的抑制导致了持久的肿瘤消退。

附图说明

图1为IU1治疗导致p53基因缺陷小鼠肿瘤持续退变结果图，图1-A为KAPLAN-MEIER生存分析用于评价IU1对野生型、杂合型和纯合型小鼠OS的治疗效果；图1-B～图1-E为IU1对野生型、p53杂合敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠全身的影响(图1-B)、肿瘤检出时间(图1-C)、肿瘤体积(图1-D和图1-E)的影响；CTRL，对照；MOCK，未经治疗的小鼠；ND，未检测；WT，野生型；所示数据为平均值±SDS。采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)；

图2为p53基因纯合缺陷小鼠原发性肿瘤的X线、MICRO-CT和MRI分析及分型，图2-A为p53基因纯合缺陷小鼠MLT的X线、MICRO-CT和MRI分析结果，图2-B为p53基因纯合缺陷小鼠STS的X线、MICRO-CT和MRI分析结果；图2-C为p53基因纯合缺陷小鼠OSA的X线、MICRO-CT和MRI分析结果；图2-D为野生型小鼠、p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠中IU1对癌症类型数的影响结果；图2-E为p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠中患有MLT或OSA的小鼠数量结果；CTRL，对照组；MLT，胸腺恶性淋巴瘤；MOCK，未经治疗的小鼠；NA，不适用；OSA，骨肉瘤；STS，软组织肉瘤；WT，野生型；

图3为IU1对USP14调控p53依赖机制的影响结果图；图3-A为Western blotting用于检测p53杂合子敲除小鼠细胞周期、衰老和凋亡相关标记的蛋白水平；图3-B和图3-C为用流式细胞术分析了p53杂合子敲除小鼠IU1对细胞周期(图3-B)和分布(图3-C)的影响结果图；所示数据为平均值±SDS，采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)；

图4为IU1通过抑制USP14去泛素化COPS5间接上调p53结果图；图4-A为用Westernblotting法测定p53杂合子敲除小鼠OSA、STS和MLT组织中COPS5蛋白水平；图4-B为在体外检测293T细胞在USP14过度表达或MG-132处理后的COPS5泛素水平；图4-C和图4-D为经二甲基亚砜(C，CTRL，N＝26)或IU1(D，N＝27)处理的p53杂合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中p53、USP14和COSP5的表达和关联结果图；

图5为IU1对COPS5体内外诱导的下游效应器的影响结果图；图5-A和图5-B为经二甲基亚砜(图5-A，CTRL，N＝28)或IU1(图5-B，N＝28)处理的p53纯合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中p53、USP14和COSP5的表达及其相关性结果图；图5-C为用Western blotting方法检测p53纯合子敲除小鼠中USP14、COSP5和COSP5下游效应器的蛋白水平结果图；所示数据为平均值±SDS。采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)。

具体实施方式

本发明提供了具有如式I所示的结构的IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用。

在本发明中，所述IU1是一种细胞渗透性的，可逆的proteasome(蛋白酶体)选择性抑制剂，可以特异性地抑制USP14的去泛素化活性。所述IU1的分子量为300.37，本发明对所述IU1的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的IU1的来源即可。在本发明实施例中，所述IU1购自Selleck(中国，上海蓝木化工有限公司，美国Selleck Chemicals在上海设立的子公司)。

在本发明中，所述IU1优选通过特异性地抑制USP14的去泛素化活性实现治疗p53缺陷型肿瘤的目的。研究结果表明，IU1的作用可以挽救p53蛋白水平，阻断由USP14依赖的COPS5去泛素和调节p53引起的p53泛素降解。鉴于IU1已经在晚期实体恶性肿瘤的临床评估中，临床前研究结果可能也适用于人体临床，以供患者使用。

下面结合实施例对本发明提供的IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

用p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠观察自发肿瘤形成和IU1的治疗效果。

所有实验程序均获得同济大学医学院(SYDW-19-215)动物管理和使用委员会(IACUC)指南的批准。实验在9个月大的野生型和p53杂合子敲除(p53+/-)小鼠以及3个月大的p53纯合敲除(p53-/-)小鼠中进行。采用基于Trp53的聚合酶链反应(PCR)对尾部活检的基因组DNA进行基因分型。PCR的反应体系如下：

其中，oIMR7777 5'ACAGCGTGGTGGTACCTTAT3'(SEQ ID No.1)；

oIMR7778 5'TATACTCAGAGCCGGCCT3'(SEQ ID No.2)；

oIMR8306 5'CTATCAGGACATAGCGTTGG3'(SEQ ID No.3)。

PCR的扩增程序如下：

小鼠治疗按每周两次腹腔注射给药。所用的注射试剂主要成分包含IU1(5mg/kg体重)，溶剂为1％DMSO、30％PEG300、1％TWEEN80和ddH₂O(IU1治疗组)。p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠模型，以腹腔注射溶剂(1％DMSO、30％PEG300、1％TWEEN80和ddH₂O)为对照(Ctrl组)。p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠模型，以腹腔注射溶剂为ddH₂O为空白组(Mock组)。所有小鼠每周接受三次X光、磁共振成像(MRI)或显微CT诊断，以确定肿瘤的表现。

结果见图1。图1为IU1治疗导致p53基因缺陷小鼠肿瘤持续退变。图1-A为KAPLAN-MEIER生存分析用于评价IU1对野生型、p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠OS的治疗效果。图1-B～图1-E为IU1对WT、p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠全身体重的影响(图1-B)、肿瘤检出时间(图1-C)、肿瘤体积(图1-D和图1-E)的影响。CTRL，对照；MOCK，未经治疗的小鼠；ND，未检测；WT，野生型。所示数据为平均值±SDS。采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)。

由图1可知，蛋白酶IU1去泛素活性的抑制导致体内肿瘤的消退。成体p53敲除小鼠死于癌症，主要是由于在4到6个月的早期(4到6个月之间)发生淋巴瘤，除胸腺恶性淋巴瘤(MLT)外，还出现肉瘤(包括骨肉瘤(OSA)和软组织肉瘤(STS))，并在较小程度发生其它类型的癌(图1-A)，p53杂合子敲除小鼠的寿命相对较长(12到16个月之间)。观察到IU1给药后，p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠的OS明显延长(图1-A)。对照组小鼠体重显著下降。相反，IU1处理的小鼠显示正常体重(图1-B)和主要器官重量(如肝和肺)恢复正常。与未经治疗组的小鼠相比，IU1治疗组的可观察肿瘤延迟发作(图1-C)和肿瘤消退(图1-D和图1-E)。

实施例2

影像学分析IU1抑制p53基因纯合缺陷小鼠生成肿瘤的数量和类型

利用常规X线、MICRO-CT和MRI分析小鼠肿瘤的部位，数量和类型。

结果如图2所示。图2为p53基因纯合缺陷小鼠原发性肿瘤的X线、MICRO-CT和MRI分析及分型。p53基因纯合缺陷小鼠MLT(图2-A)、p53基因纯合缺陷小鼠STS(图2-B)和p53基因纯合缺陷小鼠OSA(图2-C)的X线、MICRO-CT和MRI分析。图2-D为野生型、p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠中IU1对癌症类型数的影响。图2-E为p53杂合子敲除小鼠和p53纯合子敲除小鼠中患有MLT或OSA的小鼠数量。CTRL，对照组；MLT，胸腺恶性淋巴瘤；MOCK，未经治疗的小鼠；NA，不适用；OSA，骨肉瘤；STS，软组织肉瘤；WT，野生型。

当比较IU1对包括胸腺恶性淋巴瘤MLT、软组织肉瘤STS和骨肉瘤OSA在内的p53缺陷小鼠的主要癌症类型的治疗效果时(图2-A～图2-C)，证实p53杂合子敲除小鼠的MLT小鼠数量明显减少，p53纯合子敲除小鼠的OSA小鼠数量明显减少。IU1治疗的小鼠组织形态恢复。

实施例3

利用小鼠自发成瘤的原代癌细胞和瘤体组织验证IU1抑癌的分子机制

在含有10％(V/V)胎牛血清(FBS)、100μg/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM培养基中培养小鼠自发成瘤原代癌细胞，并进行流式细胞术，分析p53杂合子敲除小鼠IU1对细胞周期和分布的影响的实验。

常规Western blotting分析用于检测p53杂合子敲除小鼠细胞周期、衰老和凋亡相关标记的蛋白水平。

详细实验步骤如下：使用裂解液，裂解组织样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳，选用PVDF膜转膜过夜，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭过夜。一抗孵育，二抗孵育，使用ECL试剂来检测蛋白，使用X光片自动洗片机显影定影。

图3为IU1对USP14调控p53依赖机制的影响；图3-A为Western blotting用于检测杂合子p53纯合子敲除小鼠细胞周期、衰老和凋亡相关标记的蛋白水平。图3-B和图3-C为用流式细胞术分析了杂合子p53阳性小鼠IU1对细胞周期(图3-B)和分布(图3-C)的影响；采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)。

IU1诱导细胞生长停滞、凋亡及衰老的体内外治疗

最近的研究表明，去泛素酶(DUBS)在细胞周期的调节中起着关键作用。本发明研究发现，IU1诱导显著的G2/M期生长停滞(图3-A～图3-C)。根据这些发现，IU1治疗降低了G2/M期细胞周期调节蛋白细胞***周期25C(CDC25C)及其下游蛋白CDC2和CYCLIN B1(图3-A)。

最近的研究已经导致了一些蛋白的鉴定，这些蛋白的表达在衰老前肿瘤病变中增加，其中包括CDK抑制剂P15-INK4B和P16-INK4A，以及诱饵受体2(DCR2)。证实p53杂合子敲除小鼠的IU1治疗诱导了P15-INK4B、P16-INK4A和DCR2的表达，提示IU1治疗导致的癌细胞衰老(图3-A)。

体内p53杂合子敲除小鼠的细胞凋亡标记物(C-CASP-3、BAX和BCL-2)是否同样被p53恢复所诱导。观察发现p53杂合子敲除小鼠中IU1的促凋亡作用是p53依赖性的，但是p53杂合子敲除小鼠在OSA中表现不明显，这表明IU1在体内抑制肿瘤生长，并且不同的分子机制与p53的不同肿瘤亚型有关。

实施例4

用pMSCV逆转录病毒质粒进行USP14或COPS5基因过度表达，具体步骤如下：扩增USP14(基因号REFSEQ mRNAs:NM_001037334.1)或COPS5(基因号REFSEQ mRNAs:NM_006837.3)，并克隆到慢病毒载体pMSCV中，构建慢病毒表达载体pMSCV并测序鉴定。应用脂质体将pMSCV过表达载体或pMSCV对照与VSVG、GAG-POL共转染293T细胞，48h后收集细胞上清，感染细胞，48h后加入嘌呤霉素4d，筛选出稳定过表达USP14或COPS5的细胞株，检测USP14或COPS5的mRNA和蛋白表达。

利用短发夹RNA和逆转录病毒转导产生敲低表达细胞系。具体步骤如下：针对USP14或COPS5的基因区域设计shRNA序列，应用Lipofectamine TM2000方法转染至细胞，荧光显微镜下观察shRNA的转染效率。采用实时定量PCR方法检测USP14或COPS5的mRNA表达，Western blot方法检测USP14或COPS5的蛋白表达。

USP14的shRNA序列为5’-GCAAGGATGTTCTGTTCTTGA-3’(SEQ ID No.4)，能有效地抑制USP14的mRNA及蛋白表达。

COPS5的shRNA序列为5’-GCTGTTTGGGTGCAGATTCTTGA-3’(SEQ ID No.5)，能有效地抑制COPS5的mRNA及蛋白表达。

实时定量PCR实验使用Taqman通用PCR试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，USA)进行。实时定量PCR的扩增程序为：

94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)30个循环；72℃，5min。

实时定量PCR的扩增体系：10X buffer(含Mg²⁺)，5μl；2.5mM dNTP，2μl；10μM反向引物，1μl；10μM正向引物，1μl；模板2μl；Taq酶0.5μl；ddH₂O 38.5μl。

所用引物序列如下：

引物序列如下：

GAPDH:正向引物5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'(SEQ ID No.6)；

反向引物5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3'(SEQ ID No.7)；

USP14:正向引物5'-GGCGTGTGGAGATGTATAAC-3(SEQ ID No.8)；

反向引物5'-CAGCTCAGCACTATCCAGAC-3'(SEQ ID No.9)；

COPS5：正向引物5'-GTCATGTGGTTGCTGTGATG-3'(SEQ ID No.10)。

反向引物5'-AGGTGACGTGACTGAATGAG-3'(SEQ ID No.11)。

GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCT方法分析基因的表达水平。

常规Western blotting分析用于检测COPS5和GAPDH的蛋白水平。详细实验步骤如下：使用裂解液，裂解组织样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳，选用PVDF膜转膜过夜，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭过夜。一抗孵育，二抗孵育，使用ECL试剂来检测蛋白，使用X光片自动洗片机显影定影。

在体外检测293T细胞在USP14过度表达或MG-132处理后的COPS5进行免疫沉淀分析泛素水平的实验。详细步骤如下：用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；加入预冷的RIPABuffer，用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5mlEP管中，4℃，缓慢晃动15min,4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；准备ProteinA agarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度，每1ml总蛋白中加入100μl ProteinA琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(EP管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子；Bradford法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度；用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度；加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜，加入100μl ProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜，14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，电泳，WB检测。

经二甲基亚砜(L，CTRL，N＝26)或IU1(M，N＝27)处理的p53杂合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中利用免疫组织化学实验检测p53、USP14和COSP5的表达和关联，免疫组织化学实验。

详细步骤如下：切片在脱蜡前，60℃恒温箱中烘烤20min，然后将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，无水乙醇浸泡10min，更换无水乙醇再浸泡10min，然后依次95％乙醇，70％乙醇，50％的乙醇各5min，最后用蒸馏水浸泡5min；用用蒸馏水温柔的冲洗一会，更换PBS冲洗5min，再用PBS冲洗5min；将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液(pH值6.0)中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98℃之间并持续10～15min取出容器，室温冷却30min进行抗原修复。用3％H₂O₂滴加到切片上，封闭5～10min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2～5min，冲洗三次。用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于37℃孵育15～30min，然后甩去封闭用血清；滴加适当比例稀释的一抗，将切片放在保湿盒中于4℃冰箱中过夜孵育或者温箱37℃孵育1～2个小时。过夜后的切片用PBS冲洗2，冲洗3次；滴加生物素标记的二抗在保湿盒中于37℃孵育30min。切片用PBS冲洗2min，冲洗3次；加HRP标记的亲和素，再37℃孵育20min，用PBS冲洗2min，冲洗3次，加入显色剂显色，选择DAB根据显微镜下的观察决定终止显色的时间。自来水充分冲洗10～15min，加一大滴苏木精复染，细胞核蛋白几秒就可以，细胞浆或者细胞膜蛋白需要20～30s，自来水冲洗，再用PBS返蓝5min。

图4为IU1通过抑制USP14对COPS5的去泛素化作用间接上调p53；图4-A为用Western blotting法测定p53阳性小鼠OSA、STS和MLT组织中COPS5蛋白水平。图4-B为在体外检测293T细胞在USP14过度表达或MG-132处理后的COPS5泛素水平。图4-C和图4-D为经二甲基亚砜(L，CTRL，N＝26)或IU1(M，N＝27)处理的p53杂合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中p53、USP14和COSP5的表达和关联。

IU1诱导COPS5泛素化和降解

去泛素化酶与底物相互作用，然后去泛素化底物以抑制其蛋白。在26S蛋白酶体中，去泛素化酶与底物相互作用，然后去泛素化底物，通过泛素化途径抑制蛋白质降解。

此外，USP14的过度表达显著降低了COPS5的泛素化水平；相反，USP14的敲除显著增加了体外COPS5的泛素化(图4-B)。

通过COPS5诱导并依赖于p53杂合子敲除小鼠p53的调节机制，USP14的抑制导致了持久的肿瘤消退。

COPS5通过肿瘤抑制因子p53诱导蛋白质泛素化降解，从而促进细胞增殖。因此，IU1可能通过诱导COPS5途径中p53的降解，在p53缺乏的肿瘤中起到抗肿瘤的作用。

p53杂合子敲除小鼠不同类型肿瘤的COPS5蛋白水平显著升高(图4-C)，IU1治疗后COPS5蛋白水平降低，COPS5蛋白水平变化与p53蛋白水平呈显著负相关(图4-D)。

实施例5

p53纯合子敲除小鼠中IU1治疗的分子机制。

二甲基亚砜或IU1处理的p53纯合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中p53、USP14和COSP5的表达及其相关性的免疫组织化学实验，详细步骤如下：切片在脱蜡前，60℃恒温箱中烘烤20min，然后将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，无水乙醇浸泡10min，更换无水乙醇再浸泡10min，然后依次95％乙醇，70％乙醇，50％的乙醇各5min，最后用蒸馏水浸泡5min；用蒸馏水轻柔的冲洗一会，更换PBS冲洗5min，再用PBS冲洗5min；将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液(pH值6.0)中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃～98℃之间并持续10～15min取出容器，室温冷却30min进行抗原修复。用3％H₂O₂滴加到切片上，封闭5～10min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2～5min，冲洗三次。用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于37℃孵育15～30min，然后甩去封闭用血清；滴加适当比例稀释的一抗，将切片放在保湿盒中于4℃冰箱中过夜孵育或者温箱37℃孵育1～2个小时。过夜后的切片用PBS冲洗2，冲洗3次；滴加生物素标记的二抗在保湿盒中于37℃孵育30min。切片用PBS冲洗2min，冲洗3次；加HRP标记的亲和素，再37℃孵育20min，用PBS冲洗2min，冲洗3次，加入显色剂显色，选择DAB根据显微镜下的观察决定终止显色的时间。自来水充分冲洗10～15min，加一大滴苏木精复染，自来水冲洗，再用PBS返蓝5min。

用Western blotting方法检测纯合子p53纯合子敲除小鼠中USP14、COSP5和COSP5下游效应器的蛋白水平的实验，详细步骤如下：使用裂解液，裂解组织样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳，选用PVDF膜转膜过夜，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭过夜。一抗孵育，二抗孵育，使用ECL试剂来检测蛋白，使用X光片自动洗片机显影定影。

图5为IU1对COPS5体内外诱导的下游效应器的影响；图5-A和图5-B为经二甲基亚砜(图5-A，CTRL，N＝28)或IU1(图5-B，N＝28)处理的p53纯合子敲除小鼠原发性肿瘤组织中p53、USP14和COSP5的表达及其相关性。图5-C为用Western blotting方法检测纯合子p53纯合子敲除小鼠中USP14、COSP5和COSP5下游效应器的蛋白水平。所示数据为平均值±SDS。采用单因素方差分析进行统计学分析(与对照组比较，P<0.05和**P<0.01)。

通过p53-独立调节机制，抑制USP14可导致p53纯合子缺失小鼠持久的肿瘤消退。IU1的抑瘤机制为通过依赖于USP14对COPS5的调节机制。p53纯合子敲除小鼠不同类型肿瘤的COPS5蛋白水平显著升高(图5-A)，IU1治疗后COPS5蛋白水平降低，COPS5蛋白水平的变化与USP14蛋白水平呈显著负相关，进而导致COSP5下游效应器的蛋白水平改变(图5-B，图5-C)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市第十人民医院

<120> IU1在制备治疗p53缺陷型肿瘤的药物中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA