一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法 (Thermostable nucleic acid vaccine adjuvant and preparation method thereof ) 是由 雍金贵 潘红 刘宗文 刘倩 武新春 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法,属于疫苗佐剂制备技术领域,包括以下重量份原料：25.8-31.2份油相、50-60份水相、3.5-4.6份改性微球和0.5-1.1份无机填料,将无机填料和水相混合,频率40-60kHz下超声分散后,加入油相和改性微球,继续超声处理20min,即得一种热稳定核酸疫苗佐剂,为乳液状,其内部物质吸附抗原后,具有凹凸不平的表面,抗原可以被吸附在其缝隙中,从而起到保护抗原的作用,使抗原在一定温度下可以对抗热损伤,保持生物活性,此外乳液中的小粒径颗粒会在油水界面产生较高的堆积效率,形成更加均一的颗粒膜,从而阻隔乳液之间的相互碰撞,保持核酸疫苗佐剂的状态稳定。(The invention relates to a thermostable nucleic acid vaccine adjuvant and a preparation method thereof, belonging to the technical field of vaccine adjuvant preparation and comprising the following raw materials in parts by weight: 25.8-31.2 parts of oil phase, 50-60 parts of water phase, 3.5-4.6 parts of modified microspheres and 0.5-1.1 part of inorganic filler, mixing the inorganic filler and the water phase, performing ultrasonic dispersion at the frequency of 40-60kHz, adding the oil phase and the modified microspheres, and continuing ultrasonic treatment for 20min to obtain the heat-stable nucleic acid vaccine adjuvant which is emulsion-shaped, has an uneven surface after antigen is adsorbed by an internal substance, and can adsorb the antigen in gaps of the antigen so as to play a role in protecting the antigen, so that the antigen can resist thermal injury and keep bioactivity at a certain temperature, and in addition, small-particle-size particles in the emulsion can generate higher accumulation efficiency at an oil-water interface to form a more uniform particle film, thereby preventing mutual collision between the emulsions and keeping the state stability of the nucleic acid vaccine adjuvant.)
技术领域
本发明属于疫苗佐剂制备技术领域，具体地，涉及一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法。
背景技术
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。
疫苗佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂(如氢氧化铝)、有机佐剂(如脂多糖、分枝杆菌)及合成佐剂穴如双链多聚肌苷酸，胞苷酸眼。
核酸疫苗是一类需要精心管理的敏感产品，将其置于适当的温度下进行保护和运输极为重要，热应激会降低疫苗的效价，或甚至会使其失去活性，无法激活免疫反应，存在巨大潜在风险，针对这一问题，提供一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种热稳定核酸疫苗佐剂及其制备方法，以解决上述背景技术中所提及的技术问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种热稳定核酸疫苗佐剂，包括以下重量份原料：25.8-31.2份油相、50-60份水相、3.5-4.6份改性微球和0.5-1.1份无机填料；
该热稳定核酸疫苗佐剂由以下步骤制成：
将无机填料和水相混合，频率40-60kHz下超声分散后，加入油相和改性微球，继续超声处理20min，即得一种热稳定核酸疫苗佐剂。
进一步地，所述改性微球由以下步骤制成：
步骤A1、将聚乙烯亚胺、乙腈和三乙胺加入圆底烧瓶中，摇荡均匀，先后加入六氯环三磷腈的乙腈溶液和壳聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超声反应8h，超声功率180W，频率40Hz，然后于转速1000-1500r/min条件下离心20-30min，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，最后于-45℃下干燥24h，得到复合微球，以聚乙烯亚胺、壳聚糖和六氯环三磷腈为底物，制备了交联型聚磷腈复合微球，具有较高的生物相容性和可降解性，并且N、P的六元杂环具有较高稳定性，具有一定的耐高温性能；
步骤A2、将DMF置于三口烧瓶中，冰浴条件下，向三口烧瓶中滴加氯磺酸，边滴加边搅拌，反应体系温度保持0-5℃，滴加结束后，室温下搅拌至澄清，得到处理剂，将氯磺酸和DMF混合得到处理剂；
步骤A3、将复合微球和无水乙醇加入三口烧瓶中，超声分散30min后，向三口烧瓶中滴加处理剂，滴加结束后，在微波辐射条件下反应1min，反应结束后于4℃冰箱中沉淀30min后取出，用蒸馏水洗涤并加入浓度2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7-8，过滤，滤饼于蒸馏水中透析72h后，冷冻干燥至恒重，得到改性微球，利用复合微球表面的氨基与氯磺酸发生取代反应，使聚合物微球表面接枝磺酸基团，提高复合微球的水溶性。
进一步地，步骤A1中聚乙烯亚胺、乙腈、三乙胺、六氯环三磷腈的乙腈溶液和壳聚糖的醋酸溶液的用量比为0.42-0.48g：80-90mL：4mL：10-15mL：20mL，其中六氯环三磷腈的乙腈溶液由六氯环三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中壳聚糖的醋酸溶液由壳聚糖和质量分数6-8％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成。
进一步地，步骤A2中DMF和氯磺酸的体积比为5：1。
进一步地，步骤A3中复合微球、无水乙醇、处理剂的用量比为50mg：100mL：8.5-9.1mg。
进一步地，所述无机填料由以下步骤制成：
步骤B1、将三乙胺、十六烷基三甲基氯化铵和去离子水加入三口烧瓶中，频率40-45kHz下超声分散15min，升温至60℃，转速150r/min条件下搅拌反应1h，向三口烧瓶中滴加氯苯，滴加结束后搅拌20min，滴加正硅酸乙酯，保温搅拌反应12h，反应结束后，转速30000rpm离心处理10min，沉淀用无水乙醇洗涤3-5次，最后于600℃马弗炉中煅烧8h，冷却至室温，得到介孔二氧化硅；
步骤B2、氮气保护下，将介孔二氧化硅、2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和二甲基亚砜加入三口烧瓶中，控制温度50-60℃，搅拌反应10min，然后加入氢氧化钾，之后升温至180-185℃，，搅拌速度为120-150r/min，回流反应3-5h，反应结束后，离心，沉淀用去离子水洗涤3-5次，最后于80℃下干燥至恒重，得到无机填料。
进一步地，所述B1中三乙胺、十六烷基三甲基氯化铵、去离子水、氯苯和正硅酸乙酯的用量比为0.18g：2.7-3.3g：36-40mL：2.6-4.1mL：1mL。
进一步地，所述B2中介孔二氧化硅、2，3-环氧丙基三甲基氯化铵、二甲基亚砜和氢氧化钾的用量比为0.5-0.8g：0.2-0.4g：25.8-26.4mL：0.5g。
进一步地，所述油相为生物相容性油脂和矿物油中的一种。
进一步地，所述水相包括纯化水、注射用水、甘油水溶液、质量分数0.9％生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液中的一种或多种按照任意比混合而成。
本发明的有益效果：
1)本发明以油相、水相、改性微球和无机填料为原料制备了一种热稳定核酸疫苗佐剂，为乳液状，其内部物质吸附抗原后，具有凹凸不平的表面，抗原可以被吸附在其缝隙中，从而起到保护抗原的作用，使抗原在一定温度下可以对抗热损伤，保持生物活性，此外乳液中的小粒径颗粒会在油水界面产生较高的堆积效率，形成更加均一的颗粒膜，从而阻隔乳液之间的相互碰撞，保持核酸疫苗佐剂的状态稳定。
2)本发明以聚乙烯亚胺、壳聚糖和六氯环三磷腈为底物，制备了交联型聚磷腈复合微球，通过处理剂处理使复合微球表面接枝磺酸基团，提高聚合物微球的水溶性，复合微球具有较高的生物相容性和可降解性，含N、P的六元杂环具有较高的热稳定性，壳聚糖具有良好的固有免疫和特异性免疫的刺激能力，并且能诱导黏膜免疫，对抗原有高效保护性，能增强抗原免疫原性，其巨大的分子量及复杂的空间结构可以将抗原包裹其中，并且溶液携带大量正电荷，而有强有力的静电作用保护疫苗在运输过程中不易被酶解，疫苗结合壳聚糖会比直接裸露的疫苗有更强的稳定性，微球吸附后的抗原具有持续释放特性，并且吸附后的微球被摄入细胞后能够改变抗原在提呈细胞内的加工和呈递方式，促进更多的抗原经MHCI途径实现交叉提呈，诱导高水平的细胞免疫应答。
3)本发明中的无机填料是以介孔二氧化硅为载体，利用介孔二氧化硅表面的羟基与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的环氧基在碱性条件下发生开环反应，得到表面接枝阳离子官能团的无机填料，由于其表面具有阳离子官能团具有电正性，能够与带负电的蛋白抗原进行静电吸附，能够与细胞表面进行静电吸附，从而具有较好的抗原负载能力和细胞靶向能力，并且介孔二氧化硅本身具有高比表面积和多空隙的特点，具有多个附着位点，能够实现蛋白抗原的稳定负载，改性后的介孔二氧化硅与油相的相容性也有了进一步的提升。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
改性微球由以下步骤制成：
步骤A1、将0.42g聚乙烯亚胺、80mL乙腈和4mL三乙胺加入圆底烧瓶中，摇荡均匀，先后加入10mL六氯环三磷腈的乙腈溶液和20mL壳聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超声反应8h，超声功率180W，频率40Hz，然后于转速1000r/min条件下离心20min，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，最后于-45℃下干燥24h，得到复合微球，其中六氯环三磷腈的乙腈溶液由六氯环三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中壳聚糖的醋酸溶液由壳聚糖和质量分数6％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成；
步骤A2、将5mL DMF置于三口烧瓶中，冰浴条件下，向三口烧瓶中滴加1mL氯磺酸，边滴加边搅拌，反应体系温度保持0℃，滴加结束后，室温下搅拌至澄清，得到处理剂；
步骤A3、将50mg复合微球和100mL无水乙醇加入三口烧瓶中，超声分散30min后，向三口烧瓶中滴加8.5mg处理剂，滴加结束后，在微波辐射条件下反应1min，反应结束后于4℃冰箱中沉淀30min后取出，用蒸馏水洗涤并加入浓度2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7，过滤，滤饼于蒸馏水中透析72h后，冷冻干燥至恒重，得到改性微球。
实施例2
改性微球由以下步骤制成：
步骤A1、将0.46g聚乙烯亚胺、85mL乙腈和4mL三乙胺加入圆底烧瓶中，摇荡均匀，先后加入12mL六氯环三磷腈的乙腈溶液和20mL壳聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超声反应8h，超声功率180W，频率40Hz，然后于转速1200r/min条件下离心25min，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，最后于-45℃下干燥24h，得到复合微球，其中六氯环三磷腈的乙腈溶液由六氯环三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中壳聚糖的醋酸溶液由壳聚糖和质量分数7％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成；
步骤A2、将5mL DMF置于三口烧瓶中，冰浴条件下，向三口烧瓶中滴加1mL氯磺酸，边滴加边搅拌，反应体系温度保持2℃，滴加结束后，室温下搅拌至澄清，得到处理剂；
步骤A3、将50mg复合微球和100mL无水乙醇加入三口烧瓶中，超声分散30min后，向三口烧瓶中滴加8.8mg处理剂，滴加结束后，在微波辐射条件下反应1min，反应结束后于4℃冰箱中沉淀30min后取出，用蒸馏水洗涤并加入浓度2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7，过滤，滤饼于蒸馏水中透析72h后，冷冻干燥至恒重，得到改性微球。
实施例3
改性微球由以下步骤制成：
步骤A1、将0.48g聚乙烯亚胺、90mL乙腈和4mL三乙胺加入圆底烧瓶中，摇荡均匀，先后加入15mL六氯环三磷腈的乙腈溶液和20mL壳聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超声反应8h，超声功率180W，频率40Hz，然后于转速1500r/min条件下离心30min，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，最后于-45℃下干燥24h，得到复合微球，其中六氯环三磷腈的乙腈溶液由六氯环三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中壳聚糖的醋酸溶液由壳聚糖和质量分数8％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成；
步骤A2、将5mL DMF置于三口烧瓶中，冰浴条件下，向三口烧瓶中滴加1mL氯磺酸，边滴加边搅拌，反应体系温度保持5℃，滴加结束后，室温下搅拌至澄清，得到处理剂；
步骤A3、将50mg复合微球和100mL无水乙醇加入三口烧瓶中，超声分散30min后，向三口烧瓶中滴加9.1mg处理剂，滴加结束后，在微波辐射条件下反应1min，反应结束后于4℃冰箱中沉淀30min后取出，用蒸馏水洗涤并加入浓度2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为8，过滤，滤饼于蒸馏水中透析72h后，冷冻干燥至恒重，得到改性微球。
实施例4
无机填料由以下步骤制成：
步骤B1、将0.18g三乙胺、2.7g十六烷基三甲基氯化铵和36mL去离子水加入三口烧瓶中，频率40kHz下超声分散15min，升温至60℃，转速150r/min条件下搅拌反应1h，向三口烧瓶中滴加2.6mL氯苯，滴加结束后搅拌20min，滴加1mL正硅酸乙酯，保温搅拌反应12h，反应结束后，转速30000rpm离心处理10min，沉淀用无水乙醇洗涤3次，最后于600℃马弗炉中煅烧8h，冷却至室温，得到介孔二氧化硅；
步骤B2、氮气保护下，将0.5g介孔二氧化硅、0.2g2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和25.8mL二甲基亚砜加入三口烧瓶中，控制温度50℃，搅拌反应10min，然后加入0.5g氢氧化钾，之后升温至180℃，搅拌速度为120r/min，回流反应3h，反应结束后，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，最后于80℃下干燥至恒重，得到无机填料。
实施例5
无机填料由以下步骤制成：
步骤B1、将0.18g三乙胺、2.9g十六烷基三甲基氯化铵和38mL去离子水加入三口烧瓶中，频率42kHz下超声分散15min，升温至60℃，转速150r/min条件下搅拌反应1h，向三口烧瓶中滴加3.8mL氯苯，滴加结束后搅拌20min，滴加1mL正硅酸乙酯，保温搅拌反应12h，反应结束后，转速30000rpm离心处理10min，沉淀用无水乙醇洗涤4次，最后于600℃马弗炉中煅烧8h，冷却至室温，得到介孔二氧化硅；
步骤B2、氮气保护下，将0.7g介孔二氧化硅、0.3g2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和26.1mL二甲基亚砜加入三口烧瓶中，控制温度55℃，搅拌反应10min，然后加入0.5g氢氧化钾，之后升温至182℃，搅拌速度为130r/min，回流反应4h，反应结束后，离心，沉淀用去离子水洗涤4次，最后于80℃下干燥至恒重，得到无机填料。
实施例6
无机填料由以下步骤制成：
步骤B1、将0.18g三乙胺、3.3g十六烷基三甲基氯化铵和40mL去离子水加入三口烧瓶中，频率45kHz下超声分散15min，升温至60℃，转速150r/min条件下搅拌反应1h，向三口烧瓶中滴加4.1mL氯苯，滴加结束后搅拌20min，滴加1mL正硅酸乙酯，保温搅拌反应12h，反应结束后，转速30000rpm离心处理10min，沉淀用无水乙醇洗涤5次，最后于600℃马弗炉中煅烧8h，冷却至室温，得到介孔二氧化硅；
步骤B2、氮气保护下，将0.8g介孔二氧化硅、0.4g 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和26.4mL二甲基亚砜加入三口烧瓶中，控制温度60℃，搅拌反应10min，然后加入0.5g氢氧化钾，之后升温至185℃，，搅拌速度为150r/min，回流反应5h，反应结束后，离心，沉淀用去离子水洗涤5次，最后于80℃下干燥至恒重，得到无机填料。
对比例1
改性微球由以下步骤制成：
步骤A1、将0.42g聚乙烯亚胺、80mL乙腈和4mL三乙胺加入圆底烧瓶中，摇荡均匀，先后加入10mL六氯环三磷腈的乙腈溶液和20mL壳聚糖的醋酸溶液，密封瓶口，在40℃下超声反应8h，超声功率180W，频率40Hz，然后于转速1000r/min条件下离心20min，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，最后于-45℃下干燥24h，得到改性微球，其中六氯环三磷腈的乙腈溶液由六氯环三磷腈和乙腈按照0.1g：20mL混合而成，其中壳聚糖的醋酸溶液由壳聚糖和质量分数6-8％醋酸溶液按照0.1g：20mL混合而成。
对比例2
无机填料由以下步骤制成：
步骤B1、将0.18g三乙胺、2.7g十六烷基三甲基氯化铵和36mL去离子水加入三口烧瓶中，频率40kHz下超声分散15min，升温至60℃，转速150r/min条件下搅拌反应1h，向三口烧瓶中滴加2.6mL氯苯，滴加结束后搅拌20min，滴加1mL正硅酸乙酯，保温搅拌反应12h，反应结束后，转速30000rpm离心处理10min，沉淀用无水乙醇洗涤3次，最后于600℃马弗炉中煅烧8h，冷却至室温，得到无机填料。
实施例7
一种热稳定核酸疫苗佐剂，包括以下重量份原料：25.8份油相、50份水相、3.5份实施例1的改性微球和0.5份实施例3的无机填料；
该热稳定核酸疫苗佐剂由以下步骤制成：
将无机填料和水相混合，频率40kHz下超声分散后，加入油相和改性微球，继续超声处理20min，即得一种热稳定核酸疫苗佐剂。
实施例8
一种热稳定核酸疫苗佐剂，包括以下重量份原料：28.6份油相、55份水相、4.1份实施例2的改性微球和0.8份实施例4的无机填料；
该热稳定核酸疫苗佐剂由以下步骤制成：
将无机填料和水相混合，频率50kHz下超声分散后，加入油相和改性微球，继续超声处理20min，即得一种热稳定核酸疫苗佐剂。
实施例9
一种热稳定核酸疫苗佐剂，包括以下重量份原料：31.2份油相、60份水相、4.6份实施例3的改性微球和1.1份实施例6的无机填料；
该热稳定核酸疫苗佐剂由以下步骤制成：
将无机填料和水相混合，频率60kHz下超声分散后，加入油相和改性微球，继续超声处理20min，即得一种热稳定核酸疫苗佐剂。
对比例3
将实施例7中的改性微球替换成对比例1中的改性微球，其余原料及制备过程不变。
对比例4
将实施例8中的无机填料替换成对比例2中的无机填料，其余原料及制备过程不变。
将实施例7-9和对比例3-4的疫苗佐剂进行性能测试，测试标准如下：
佐剂与抗原的伍配性：
取3nM的DNA分别与9nM的上述佐剂进行复合，复合条件为：室温静置30min，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验考察其复合核酸的能力，电泳实验条件为电压110V，电泳时间30min，电泳结束后，在254nm的紫外灯下进行观察。
观察结果为实施例7-9制备的脂质体核酸疫苗佐剂均具有很强的核酸复合能力，可以负载大量的核酸抗原，增加进入免疫细胞的有效抗原量。
佐剂的热稳定性：
将实施例7-9和对比例3-4的疫苗佐剂在50℃水浴中放置2h，观察其乳液状态，是否分层，甚至有无沉淀产生；
佐剂与抗原的复合稳定性：
将实施例7-9和对比例3-4的疫苗佐剂加入到EV71疫苗液中(1×108pfu/mL)，重复混合后，37℃孵育2h，功率25％，超声2min后，观察有无油层析出，静置5d后，观察有无油层析出，测试结果如下表所示：
由上表可以看出，实施例7-9的佐剂与疫苗的结合能力较好，能够保证运输过程中疫苗的状态稳定，提高其耐热性能，保证疫苗的活性组分不会失效。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
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