检测galnt4基因的产品在制备用于冠心病的诊断和/或预后的工具中的应用
阅读说明：本技术 检测galnt4基因的产品在制备用于冠心病的诊断和/或预后的工具中的应用 (Application of product for detecting GALNT4 gene in preparation of tool for diagnosis and/or prognosis of coronary heart disease ) 是由 黄榕翀 叶智帅 徐鸣悦 李泽亚 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了检测GALNT4基因的产品在制备用于冠心病的诊断和/或预后的工具中的应用。根据该应用,通过检测受试者中GALNT4的表达,可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险、或判断受试者的预后是否良好,从而指导临床医师为受试者提供有效的预防手段或者治疗方案,有利于提供受试者生存率。(The invention discloses an application of a product for detecting GALNT4 gene in preparing a tool for diagnosing and/or prognosing coronary heart disease. According to the application, by detecting the expression of GALNT4 in the subject, whether the subject has coronary heart disease or not can be judged, whether the subject has the risk of having coronary heart disease or not can be judged, or whether the prognosis of the subject is good or not can be judged, so that a clinician is guided to provide an effective preventive means or treatment scheme for the subject, and the survival rate of the subject is favorably provided.)
技术领域
本发明涉及基因诊断和生物制药技术领域，具体涉及一种多肽乙酰半乳糖氨基转移酶4(pp-GalNAc-T4，GALNT4)基因在冠心病的诊断和预后工具中中的应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是威胁人类健康的主要疾病之一，具有发病率高、致死率高的特点。据统计，2019年中国冠心病介入治疗例数预计超过110万，虽然以经皮冠状动脉介入治疗技术为代表的一系列新技术的开展和推广，但过去几年间我国冠心病人群的患病率和病死率并未下降，因此深刻认识冠心病的病因机制对冠心病的防治具有重要意义。动脉粥样硬化是冠心病的重要病理改变，基本表现为：动脉内膜的脂质沉积，内膜纤维化、粥样斑块的形成，致管壁变硬，管腔狭窄，同时合并继发性斑块内出血、血栓、破裂，引起相应器官缺血性改变。
大量的流行病学研究证实冠心病是复杂的多因素共同作用疾病，除了传统的吸烟、糖尿病、高脂血症、高血压、肥胖、年龄作为冠心病的独立危险因素，其他的非传统危险因素、遗传因素、环境因素在冠心病中同样发挥了重要作用。而冠心病和其他慢性病同样是复杂的多基因共同作用的多基因疾病，正因为导致冠心病的病因繁多，发病机制尚未完全阐明，所以直到如今，尚不能精准地预测和预防心肌梗死的发生，而需要更为有效的检测手段。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种检测GALNT4基因的产品在制备用于冠心病的诊断和/或预后的工具中的应用。
具体地，上述检测GALNT4基因的产品包括检测GALNT4基因的表达水平的试剂。
上述试剂包括能够定量GALNT4基因mRNA的试剂。
上述试剂包括能够定量GALNT4蛋白的抗体或其片段的试剂。
具体地，上述能够定量GALNT4基因mRNA的试剂可包括特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针。
在本发明的一个实施例中，上述特异性扩增GALNT4基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
具体地，上述能够定量GALNT4蛋白的试剂可包括能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
上述检测GALNT4基因的产品可以为试剂盒、芯片、试纸等，其包含能够定量GALNT4基因mRNA的试剂(例如特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针)和/或能够定量GALNT4蛋白的试剂(例如能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体))。
上述检测GALNT4基因的产品可以为高通量测序平台，其使用能够定量GALNT4基因mRNA的试剂(例如特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针)和/或能够定量GALNT4蛋白的试剂(例如能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体))对GALNT4基因进行检测。
本发明的检测GALNT4基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、高通量测序平台等，特别是PCR方法，例如实时荧光定量PCR法。
上述检测GALNT4基因的产品为试剂盒，其包含实时荧光定量PCR反应体系，具体包含：特异性扩增GALNT4基因的引物、SYBR Primix Ex Taq、无核酸酶双蒸水、ROX ReferenceDye II、cDNA模板；其中，上述引物包含如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：2所示的反向引物。
上述实时荧光定量PCR反应条件包括：94℃预变性30秒；40个循环：94℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃30延伸秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒；以GAPDH基因为内参基因。
本发明的检测GALNT4蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
具体地，上述冠心病可以为慢性冠脉疾病(CAD)(包括稳定型心绞痛、缺血性心肌病、隐匿性冠心病等)、急性冠状动脉综合征(ACS)(包括不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死)，特别是慢性冠脉疾病。
具体地，用于上述GALNT4基因的检测的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料。
上述样本为受试者的血液，特别是外周血。
本发明还提供一种用于冠心病的诊断和/或预后的工具，其包含检测GALNT4基因的产品。
具体地，上述检测GALNT4基因的产品包括检测GALNT4基因的表达水平的试剂。
上述试剂包括能够定量GALNT4基因mRNA的试剂。
上述试剂包括能够定量GALNT4蛋白的试剂。
具体地，上述能够定量GALNT4基因mRNA的试剂可包括特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针。
在本发明的一个实施例中，上述特异性扩增GALNT4基因的引物包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
具体地，上述能够定量GALNT4蛋白的试剂可包括能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体或其片段)。
上述检测GALNT4基因的产品可以为试剂盒、芯片、试纸等，其包含能够定量GALNT4基因mRNA的试剂(例如特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针)和/或能够定量GALNT4蛋白的试剂(例如能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体))。
上述检测GALNT4基因的产品可以为高通量测序平台，其使用能够定量GALNT4基因mRNA的试剂(例如特异性扩增GALNT4基因的引物和/或特异性识别GALNT4基因的探针)和/或能够定量GALNT4蛋白的试剂(例如能够特异性结合GALNT4蛋白的物质(例如抗体))对GALNT4基因进行检测。
本发明的检测GALNT4基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如聚合酶链式反应(PCR)、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、高通量测序平台等，特别是PCR方法，例如实时荧光定量PCR法。
上述检测GALNT4基因的产品为试剂盒，其包含实时荧光定量PCR反应体系，具体包含：特异性扩增GALNT4基因的引物、SYBR Primix Ex Taq、无核酸酶双蒸水、ROX ReferenceDye II、cDNA模板；其中，上述引物包含如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：2所示的反向引物。
在本发明的一个实施例中，上述实时荧光定量PCR反应条件包括：94℃预变性30秒；40个循环：94℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃30延伸秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒；以GAPDH基因为内参基因。
本发明的检测GALNT4蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
具体地，上述冠心病可以为慢性冠脉疾病(CAD)(包括稳定型心绞痛、缺血性心肌病、隐匿性冠心病等)、急性冠状动脉综合征(ACS)(包括不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死)，特别是慢性冠脉疾病。
具体地，用于上述GALNT4基因的检测的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料。
在本发明的一个实施例中，上述样本为受试者的血液，特别是外周血。
具体地，上述工具可以为试剂盒、芯片、试纸，其包含上述检测GALNT4基因的产品，也可以为高通量测序平台，其使用上述检测GALNT4基因的产品对GALNT4基因进行检测。
本发明还提供了一种诊断冠心病或冠心病预后的方法，其包括检测受试者中GALNT4基因表达水平的步骤。
在本发明的一个实施方式中，上述检测受试者中GALNT4基因表达水平的步骤包括实时荧光定量PCR反应步骤。
在本发明的一个实施例中，上述实时荧光定量PCR反应条件包括：94℃预变性30秒；40个循环：94℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃30延伸秒；溶解曲线和扩增曲线95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒；以GAPDH基因为内参基因。
具体地，上述方法可包括如下步骤：
(1)获取受试者样本；
(2)检测受试者样本中的GALNT4基因表达水平；
(3)将测得的GALNT4基因的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
特别是，与正常对照相比，GALNT4基因表达水平升高，则该受试者可被诊断为冠心病或患冠心病风险高，或该受试者被确定为预后不良。具体疾病风险、严重程度、预后情况，还需临床医生结合该受试者的其他检测指标综合评估。
具体地，上述冠心病可以为慢性冠脉疾病(CAD)(包括稳定型心绞痛、缺血性心肌病、隐匿性冠心病等)、急性冠状动脉综合征(ACS)(包括不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死)，特别是慢性冠脉疾病。
具体地，用于上述GALNT4基因的检测的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体，例如，组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料。
上述样本为受试者的血液，特别是外周血。
根据本发明上述应用，通过检测受试者中GALNT4的表达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险、或判断受试者的预后是否良好，从而指导临床医师为受试者提供有效的预防手段或者治疗方案，有利于提供受试者生存率。
附图说明
图1所示为GALNT4基因荧光定量PCR的扩增曲线。
图2所示为GALNT4基因荧光定量PCR特异性引物的溶解曲线。
图3所示为冠心病和对照组人群外周血GALNT4基因mRNA表达水平对比图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明中，“表达水平”是指样品中由GALNT4基因产物的可测量的量，其中基因产物可以是转录产物或翻译产物。因此，表达水平与核酸基因产物(如mRNA或cDNA)或多肽基因产物有关。
在本发明中，“引物”通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下形不成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。本发明中“正向引物”是指与靶DNA的一条特定链退火的寡核苷酸，“反向引物”是指与靶DNA的相反链退火的寡核苷酸。总之，正向引物和反向引物通常以类似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其5'末端更接近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“G”、“A”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可作为本发明的引物。
在本发明中，引物可以通过使用本领域技术人员已知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备；探针可以通过使用本领域技术人员已知的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
在本发明中，抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽，抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测GALNT4蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的GALNT4蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对GALNT4蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
在本发明中，“GALNT4基因”包括GALNT4基因本身以及GALNT4基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中GALNT4基因DNA序列具有70％以上(例如80％以上，90％以上，95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上，99.5％以上)同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
在本发明中，“诊断冠心病”既包括判断受试者是否已经患有冠心病，也包括判断受试者是否存在患有冠心病的风险。
在本发明中，“预后”是指冠心病患者在通过手术处理等抑制或缓解冠心病后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解冠心病后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后通过检查生物标志物即GALNT4基因或GALNT4蛋白来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解冠心病之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解冠心病后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中GALNT4基因或GALNT4蛋白的水平升高或降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：病例收集
1、入选人群
2019年8月至2017年11月于首都医科大学附属北京友谊医院住院接受治疗并接受冠脉造影的患者，共纳入58名冠心病患者，及同期入院55名排除冠心病诊断的对照组人群。
2、检测标准
冠心病诊断标准为左主干和3条心外膜下冠状动脉(前降支、左回旋支、右冠状动脉)及其大分支任何一段直径狭窄≥50％。
3、入选标准
(1)年龄在18-80岁之间(含18和80岁)；
(2)经胸心脏超声证实LVEF≥45％；
(3)自愿接受研究方案要求的所有检查；
(4)受试者(或法定监护人)理解研究要求和治疗程序，在执行方案规定的检查或操作前，签署了书面知情同意书。
4、排除标准
(1)合并风湿性心脏病、冠状动脉炎、肥厚型心肌病、扩张型心肌病者；
(2)合并恶性肿瘤或伴随癌症、免疫系统疾病、血液系统疾病、近期(2周内)服用糖皮质激素类药物者、使用免疫抑制剂者、脑梗死者；
(3)近1个月内有急慢性感染、手术及外伤者；
(4)继发性高血压、严重肝功能不全(转氨酶升高超过正常值上限3倍以上)、严重肾功能者(eGFR<30ml/(min·1.73m2))；
(5)有甲状腺功能异常及对碘剂过敏者；
(6)拒绝采血者；
(7)拒绝签署知情同意书或研究中退出。
实施例2：冠心病及对照组人群外周血GALNT4基因表达含量检测
1、收集外周血、提取mRNA
(1)留取各研究对象晨起空腹外周静脉血5ml，离心收集血细胞；
(2)加入Trizol试剂充分研磨细胞或组织直至糊状；
(3)加入1/5体积氯仿，上下剧烈震荡混匀15s，室温静置15min，12000g，4℃离心15min；
(4)从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分3层，即为无色的上清液为RNA、中间的白色蛋层及带有颜色的下层有机相；小心吸取上层水相转移到另一个新的EP管中，切勿吸出白色中间层；
(5)向上清液中加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰盒上放置10min；
(6)12000g，4℃离心10min，离心后，试管底部出现沉淀，弃上清，取白色沉淀；
(7)小心弃去上清，缓慢沿EP管壁缓慢加入RNA-Free水配制的75％乙醇500μL，轻轻上下颠倒洗涤EP管壁；
(8)12000g，4℃离心5min，小心弃去乙醇，取沉淀；
(9)室温干燥5-10min，加入约30μL RNA-Free水溶解定容；
(10)利用核酸仪测RNA浓度。
2、反转录PCR获得cDNA
(1)去除基因组DNA反应
反应体系和反应条件分别如表1和2所示。
表1反应体系
表2反应条件
(2)反转录反应获取cDNA
反转录反应体系和反应条件分别如表3和4所示。
表3反转录体系(20μL)
表4反转录反应条件
测定cDNA溶度。
3、实时荧光定量PCR
本部分实验涉及引物设计、反应体系和RT-PCR反应条件分别如表5-7所示。
表5引物设计
表6反应体系(20μL)
表7RT-PCR反应条件
记录样品Ct值，所获数据采用2-ΔΔCt方法进行分析计算，以GAPDH作为内参，目的基因的相对表达量采用倍数形式呈现。公式为倍数＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)。
4、统计分析
采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据分析，分类资料以数字和百分比的形式表示，组间比较采用卡方检验。连续资料服从正态分布的以平均值±标准误(SEM)的形式表示，采用t检验比较两组间均数。连续资料不服从正态分布的，以中位数(下四分位数-上四分位数)形式描述，组间比较采用Kruskai-Wallis秩和检验,双侧P<0.05被认为具有统计学差异。
5、临床基线资料比较
入选患者临床基线资料结果如表8所示，其表明：冠心病患者(CHD)和对照组患者间低密度脂蛋白(LDL-C)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平存在统计学差异(p<0.05)；而年龄、性别，及高血压、糖尿病、血脂、吸烟、血压等冠心病危险因素未见统计学差异。
表8入选患者临床基线资料结果
6、GALNT4基因实时荧光定量PCR扩增产物鉴定
外周血RNA实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，其中：GALNT4基因扩增曲线为显著平滑的“S型”。溶解曲线如图2所示，其呈现单一的溶解峰，扩增产物特异性较高。
7、冠心病人群外周血GALNT4基因表达含量升高
GALNT4基因mRNA水平相对表达量在冠心病和对照组组间比较分析所得每个样本的ΔCt值均为单个样本重复3次测量所得均值。结果如图3所示，冠心病患者外周血中GALNT4基因mRNA相对表达量明显高于对照组，且其相对表达量为对照组的1.34倍，p值为0.0021，具有统计学差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本文中按照一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
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