重组prrsv病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法

文档序号：25840 发布日期：2021-09-24 浏览：28次 >En<

阅读说明：本技术 重组prrsv病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法 (Recombinant PRRSV virus-like particle antigen-antibody complex and preparation method thereof ) 是由陈瑞王晶钰南雨辰武春燕于 2021-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明通过对GP5-M蛋白进行改造,得到了能够高效复制的重组杆状病毒,其培养滴度相对更高,且利用制备得到的PRRSV病毒粒子相似的病毒样颗粒与IgM进一步复合制备得到IgM-RPPSV VLPs免疫复合物,所述IgM-RPPSV VLPs免疫复合物能够更早地刺激机体产生高浓度的抗体。(According to the invention, the GP5-M protein is modified to obtain the recombinant baculovirus capable of efficiently replicating, the culture titer of the recombinant baculovirus is relatively higher, the prepared PRRSV virus particle-like virus particles are further compounded with IgM to prepare an IgM-RPPSV VLPs immune complex, and the IgM-RPPSV VLPs immune complex can stimulate an organism to generate high-concentration antibodies earlier.)

重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法

技术领域

：

本发明属于生物

技术领域

，涉及重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称“蓝耳病”，其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV），主要引发妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸障碍，通常表现为仔猪咳嗽、呼吸困难，母猪早产、流产甚至死胎。从20世纪80年代末在北美被发现至今，该病在世界范围内的流行与数次暴发导致了世界各地养猪业的巨大经济损失。

PRRSV属于动脉炎病毒科，同科的有猴出血热病毒、马动脉炎病毒和促乳酸脱氢酶病毒。而根据最新分类结果显示RRSV被划分到尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arterividae）下的β动脉炎病毒属（Betaarteri virus），同属成员还包括大鼠动脉炎病毒（Rat arteri virus，RatAV）的2个种。随着诊断技术的不断进步，发现PRRSV毒株基因和抗原存在广泛的多样性，总体上把PRRSV划分欧洲型和美洲型，两种型的基因组同源性、抗原性、毒力等方面存在明显的不同，核苷酸水平上的同源性差异在30～45%。又有学者把PRRSV划分为不同的谱系，中国现在流行的主要有：经典PRRSV-2（谱系5）、高致病性PRRSV（谱系8）、类QYYZ PRRSV-2（谱系3）以及类NADC30 PRRSV-2（谱系1）。该病毒于1996年在中国首次分离到，于2006年在国内全面暴发，主要特点为传染性高、体温高、发病率高、死亡率高，直至目前也一直困扰着养猪行业。依据基因特征分为北美型与欧洲型两个亚型，目前我国主要以HP-PRRS株、NADC30-like株等北美型PRRSV为主要流行毒株。

PRRSV的结构基因包括8个开放阅读框，包括ORF2、ORF2a、ORF3~ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，主要编码病毒的功能性蛋白。其中GP2、GP3、GP4、GP5是属于被糖基化修饰的囊膜糖蛋白，而M蛋白、N蛋白、GP2a、GP5a均属于非糖基化囊膜蛋白（未被糖基化修饰）。其中，GP5和M蛋白在病毒粒子中所占的比例比较高是主要的囊膜蛋白（Mokhtar et al. 2016），GP5可产生高水平的中和抗体和细胞免疫（Popescu et al. 2017; Kim et al. 2013）。

VLPs疫苗是新型基因工程疫苗，将PRRSV中能产生免疫效应的结构蛋白基因重组到表达载体中表达，能准确模拟病毒颗粒抗原的结构。VLPs疫苗不存在遗传物质，免疫效果良好，有望成为预防PRRS的新型疫苗。此类疫苗开发主要难点在于基因序列的选择与优化、表达系统的选择、表达量的提高、VLPs的大规模纯化、如何降低成本、佐剂的选择和添加比例、如何评估疫苗效力等。VLPs疫苗可以刺激产生B淋巴细胞介导反应、CD4⁺T细胞增殖反应、细胞毒性体细胞反应。VLPs和B淋巴细胞受体存在交叉联系，能高效识别MHCⅠ类经典途径，以树突状细胞为靶细胞，引起高效的细胞和体液免疫反应。GP5和M蛋白基因重组到大肠杆菌体，表达的蛋白可以引发高效价中和抗体反应和Th1型细胞介导的免疫反应。GP5蛋白表面有A、B两个拮抗表位，A表位削弱中和抗体的产生，对能引起中和效应的B表位有覆盖作用，其次，A表位还先于B表位表现出作用。且研究表明（HP-PRRSV囊膜蛋白5糖基化位点突变及功能初探），对A表位的氨基酸进行定点突变，对于病毒的复制具有一定的影响，导致病毒滴度下降，因而，如何减少A表位对B表位的拮抗作用是重组PRRSV病毒样颗粒类疫苗中亟需解决的技术问题，发明人与2018年制备得到具有免疫原性的重组PRRSV病毒样颗粒（ZL201811114020.6），然而，在实际生产中仍面临中和抗体滴度产生较晚的问题，仍然存在改进的空间。

抗原-抗体复合物疫苗，又称免疫复合物（immune complex, IC）疫苗，是由特异性抗体按照恰当的比例与抗原混合而制成。抗原抗体复合物形成后，抗体分子的Fc片段与抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）的Fc受体有很高的亲合性，使得与抗体结合的病毒更易更有效地与APC结合，抗原-抗体复合物被APC吞噬和内化后，即可激活B淋巴细胞和T淋巴细胞，刺激B淋巴细胞成为浆细胞，从而引起强烈的体液免疫和细胞免疫应答。在体外构成的免疫复合物对机体所刺激的体液免疫反应是自然抗原的100倍。此外，Fc受体广泛分布于APC等免疫效应细胞表面，抗体通过与Fc受体结合，能够介导免疫效应细胞对抗原的摄取等作用，参与对抗原诱生的免疫应答调节作用。

目前，禽病和其他物种疾病的抗原抗体复合物疫苗研究较多，主要有鸡传染性法氏囊IC疫苗、新城疫IC疫苗、马立克IC疫苗、鸡传染性喉气管炎IC疫苗、鸡呼肠病毒IC疫苗、小鹅瘟IC疫苗以及犬细小病毒IC疫苗等。其中，美国罗曼公司研制的鸡法氏囊和新城疫的抗原-抗体复合物疫苗已获美国农业部批准上市，是目前在世界范围内广泛应用的疫苗之一。然而，关于猪的抗原抗体复合物疫苗少有报道。抗原抗体复合物疫苗也存在着不足之处，例如传统使用血清多克隆抗体与病原相混合制备疫苗的方法受到血清多抗制备的影响，存在制备工序复杂，不同批次间血清抗体含量不稳定，动物来源的血清容易引入外源性的病原污染等缺点，因此具有一定的局限性，而使用单克隆抗体则不存在此类问题。西北农林科技大学南雨辰教授（CN111138535A 一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用，申请号为CN202010069365.5）制备得到对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒都具有中和活性的单克隆抗体5D9并将其作为免疫增强剂，所形成的免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，IFN-γ分泌T细胞显著升高，提示在灭活病毒免疫过程中，PRRSV特异性抗体5D9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强CTL反应。动物试验表明，制备的免疫复合物的免疫保护率相比仅采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。本发明在此基础上，进一步将特异性抗体与PRRSV VLPs进行组合，探索其对动物的保护效力。

发明内容

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基于目前国内PRRSV疫苗的发展状况，本发明旨在提供一种重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法，通过对GP5和M蛋白进行研究，本发明对GP5和M蛋白的基因进行人工改造，采用杆状病毒表达系统进行表达得到了包含GP5-M重组蛋白的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒相对未改造的蛋白序列能够更早的产生中和抗体，且免疫原性更好，产生抗体的滴度更高；本发明进一步将制备得到的RPPSV VLPs与南雨辰教授提供的单克隆抗体5D9进行结合形成“IgM-RPPSV VLPs”免疫复合物，所述“IgM-RPPSV VLPs”复合物型疫苗对于疫苗诱导的细胞免疫应答的提升作用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案。

一种重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物，其特征在于，所述抗原抗体复合物是由氨基酸序列如SEQ ID No：2所示的重组PRRSV病毒样颗粒与Ig M抗体制备而成。

所述Ig M抗体是西北农林科技大学南雨辰教授（CN111138535A 一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用，申请号为CN202010069365.5）制备得到对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒都具有中和活性的单克隆抗体5D9。

所述重组PRRSV病毒样颗粒由表达猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV和M蛋白的重组杆状病毒制备得到，所述表达猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV和M蛋白的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，表达PRRSV GP5与M蛋白的重组杆状病毒的构建，通过如下步骤：

（1）人工改造PRRSV GP5-M基因，以PRRSV-SD16株的序列为基础（GenbankAccession No：JX087437.1）进行改造，设计得到基因序列如SEQ ID No：1所示的PRRSVGP5-M基因；

（2）杆状病毒转移载体的构建：合成基因序列如SEQ ID No：1所示的PRRSV GP5-M基因，并分别在5’端和3’端设置Bam H I和Hind Ⅲ酶切位点，得到插入片段；以pBAC-5质粒为骨架，通过Bam H I和Hind Ⅲ酶切载体与插入片段，然后通过T4连接酶与16℃过夜连接，转化筛选得到阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定后，获得杆状病毒转移载体pBAC-5-PRRSVGP5-M；

步骤二，重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M的构建：

（1）重组杆粒rBac-PRRSV GP5-M的获得与鉴定：取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pBAC-5-PRRSVGP5-M质粒DNA与DH10 Bac感受态细胞混合，冰浴30分钟后，于42℃进行45秒水浴热激，然后冰浴5分钟，加入SOC液体培养基，37℃振荡培养2小时，按10倍系列稀释之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的筛选试剂盒筛选纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M。

（2）重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M的获得：将上一步提取的重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M，使用脂质体转染试剂Lipofectamine3000，转染至sf9细胞中，在28℃持续培养观察，于转染后24小时、48小时与72小时利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，并于转染后72小时收集细胞上清，得到重组杆状病毒，然后将其再次接种健康sf9细胞扩大培养，收集病毒液作为毒种置于-70℃保存备用。

本发明还请求保护所述重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）RPPSV VLPs的制备：将制备得到的重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M按10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，而后通过LabscaleTFF 切滤仪使用100kD分子量滤膜（EMD Millipore公司)使用100kD分子量滤膜浓缩50倍，再通过液相色谱纯化RPPSV VLPs粒子，即得到RPPSV VLPs；

（2）IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物的制备：将RPPSV VLPs与单克隆抗体5D9（以质量计算）按照1:5的比例混合，37 ℃放置2小时形成复合物。

本发明还进一步请求保护一种疫苗，其特征在于，所述疫苗是由IgM-RPPSV VLPs免疫复合物与佐剂组成。

本发明还请求保护所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：将复合后的“IgM-RPPSVVLPs”免疫复合物（以体积计算）以46:54比值与Montanide ™ ISA 206 油包水佐剂，混合乳化后，得到疫苗组合物。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

首先，发明人在原有发明专利的基础上，进一步专注于GP5-M病毒样颗粒的研究，通过人工设计和改造，对GP5-M蛋白进行改造，特别是通过序列的人工改造使得GP5上的A表位和B表位之间通过刚性的linker连接，从而改善A表位对B表位的影响，使得该病毒样颗粒能够更早的刺激机体产生中和抗体，其相比发明人原有研究所得到的病毒样颗粒能够产生更高滴度的中和抗体，首免6周后，中和抗体效价均达到1:32以上，其中3只小鼠中和抗体效价达到1:64，2只达到1:128，从中和抗体产生的时间和效价水平来看，本发明重组PRRSV病毒样颗粒疫苗相对具有很好的免疫保护效果，其有助于动物在感染早期抵抗病毒和防止病情恶化；

其次，本发明进一步将制备得到的GP5-M病毒样颗粒与单克隆抗体5D9进行复核制备得到IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物，采用IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物对仔猪进行免疫，相比单独采用RPPSV VLPs免疫能够更早的刺激机体产生较高滴度的抗体

综上所述，本发明通过对GP5-M蛋白进行改造，得到了能够高效复制的重组杆状病毒，其培养滴度相对更高，且利用制备得到的PRRSV病毒粒子相似的病毒样颗粒与Ig M进一步复合制备得到IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物，所述IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物能够更早地刺激机体产生高浓度的抗体。

附图说明

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图1：重组转移载体的构建与鉴定：（A）采用基因合成公司提供的引物，通过菌落PCR可以扩增得到约1200bp的GP5-M基因片段，其中M为marker，通道1为菌落PCR扩增结果，通道2为空白对照；（B）重组载体酶切结果，其中M为marker，通道1为提取纯化的、未经酶切重组载体，通道2为酶切后重组载体，酶切后得到的约1200bp的GP5-M基因片段以及约5500bp的载体片段。

图2 重组蛋白的表达与鉴定：A为空白细胞；B为重组杆状病毒感染的细胞。

图3：重组蛋白电镜观察结果。

图4：Western blot鉴定结果：M为marker，通道1为PRRSV VLP检测结果。

图5：IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物免疫仔猪的抗体消涨规律：第一组为试验组，RPPSV VLPs（10μg）+ ISA 206 +5D9 (50μg)，第二组为对照组，RPPSV VLPs（10μg）+ ISA206。

具体实施方式

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根据下述实施例，可以更为清楚地理解本发明。本发明所述技术步骤，如未特殊说明，均为本领域的常规技术手段，或为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1：重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的构建

（1）PRRSV GP5与M基因序列的合成：

以PRRSV-SD16株的序列为基础（Genbank Accession No：JX087437.1），经过人工修饰之后，得到基因序列如SEQ ID No：1所示的PRRSV GP5-M基因，送基因合成公司进行基因序列合成，并分别在5’端和3’端设置Bam H I和Hind Ⅲ酶切位点，得到插入片段。

（2）重组转移载体的构建与鉴定：

含有目的基因序列GP5-M的质粒以及载体pBAC-5（由陕西诺威利华生物科技有限公司提供，载体上有GFP标记基因，可以用于荧光检测，参见ZL201811114020.6）分别进行Bam H I和Hind Ⅲ双酶切，回收纯化之后，使用T4连接酶进行连接反应，化学法转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后提取质粒，通过菌落PCR（图1-A）与质粒酶切鉴定（图1-B），获得成功构建的重组转移载体pBAC-5-PRRSV GP5-M。

基于图1-A的结果可知，采用基因合成公司提供的引物，通过菌落PCR可以扩增得到约1200bp的GP5-M基因片段；而图1-B的结果表明，酶切后得到的约1200bp的GP5-M基因片段以及约5500bp的载体片段，以上结果表明，本发明成功构建了重组转移载体pBAC-5-PRRSV GP5-M。

（3）重组Bacmid的构建与鉴定

将重组转移载体pBAC-5-PRRSV GP5-M的质粒DNA分别转化至DH10 Bac感受态细胞，转移载体与感受态细胞内的骨架载体通过同源重组，获得包含PRRSV目的基因的重组杆粒rBac-PRRSV GP5-M。

（4）重组杆状病毒的制备，根据本发明人在先专利（ZL201811114020.6）记载的方法，制备重组杆状病毒，具体步骤如下：

4.1重组杆粒转染昆虫细胞：sf9细胞铺板至六孔板，待其细胞汇合度至80%时，用脂质体转染试剂Lipofectamine3000进行转染，具体如下：

4.1.1 将2μg重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M和2μL p3000加入到250μL不含血清和抗生素的opti-MEM培养液中，轻轻混匀；

4.1.2将4μl Lipofectamine3000脂质体加入到250μl不含血清和抗生素的opti-MEM培养液中，轻轻混匀；

4.1.3将步骤4.1.1和步骤4.1.2的液体混合均匀后室温静置10-15分钟；

4.1.4 将步骤4.1.3混合液逐滴滴入六孔板sf9细胞中，然后将六孔板sf9细胞置27℃恒温培养并持续观察。

重组杆状病毒的收获及扩增

4.2.1重组杆状病毒的收获:对转染后的细胞每天进行细致观察，当细胞出现变大、变不规则甚至开始上漂至液面等情况时，收集细胞及上清，提取样品RNA并进行RT-PCR检测，鉴定目的基因GP5-M是否存在，一般在转染后第4-5天可见明显细胞病变时，反复冻融收集的细胞与上清，于4℃按12000r/min离心10分钟，收集上清并标记为P1代重组杆状病毒；

4.2.2重组杆状病毒的扩增:将P1代重组杆状病毒按照1:10接种sf9细胞，于27℃培养4-5天，待细胞病变明显产生时，收获P2代重组杆状病毒；按同样方法获得P3代以及更高代次重组杆状病毒，收集的重组杆状病毒于-70℃保存备用。

4.2.3重组杆状病毒的滴度测定：将P2与P3代病毒分别进行10倍系列稀释，然后接种96孔板sf9细胞，每个稀释度接种8孔，置于27℃恒温培养并每天观察细胞病变情况，然后按Karber法计算病毒TCID₅₀值，得出重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M的P2、P3代病毒滴度分别约为10^5.58TCID₅₀/ml和10^6.62TCID₅₀/ml，相比在先研究，本发明的病毒滴度有很大程度的提高。

（5）重组蛋白的表达与鉴定

5.1重组蛋白的免疫荧光检测：重组杆状病毒按10%比例感染健康sf9细胞，同时设置空白对照孔，27℃培养48-72小时并持续观察，待细胞病变达到80%以上时，用预冷的80%丙酮固定细胞2小时，然后PBST洗涤3次，5%脱脂牛奶（使用TBST配制）在4℃过夜封闭，然后PBST洗涤3次，加入1:1000稀释的GP5单克隆抗体（由陕西诺威利华生物技术有限公司提供），37℃避光孵育1小时，然后PBST洗涤3次，加入1:1000稀释的FITC荧光标记羊抗鼠二抗，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次后荧光显微镜下观察并判定结果，重组杆状病毒感染的细胞可见明显绿色荧光而对照组无荧光，由此证实目的基因能在昆虫细胞sf9中表达（图2）。

5.2重组蛋白电镜观察：将新鲜收集的重组杆状病毒液送电镜观察，结果显示检测到形态与PRRSV病毒粒子相似的病毒样颗粒，直径约46-66 nm，证实GP5与M蛋白可在体外形成病毒样颗粒（图3）。

5.3 Western blot鉴定：配置 10%聚丙烯酰胺凝胶，加入本发明制备得到的PRRSVVLPs 样品后进行 SDS-PAGE 电泳；湿转法将 SDS-PAGE 胶中蛋白转至 PVDF 膜；利用封闭液室温封闭 2 h；用封闭液1：200倍稀释鼠抗 GP5单克隆抗体（由陕西诺威利华生物技术有限公司提供），PVDF 膜分别与单抗在 4℃孵育过夜；PBST 清洗 PVDF 膜；用封闭液 1：4000倍稀释 HRP 标记羊抗鼠 IgG 抗体，PVDF 膜与其室温孵育 1 h；PBST 清洗 PVDF 膜；Thermo 曝光液均匀滴加至 PVDF 膜，曝光。结果如图4所示，在40kDa附近检测目标蛋白条带，与预期的蛋白大小一致。

在研究过程中，发明人对多种基因改造方案进行了研究和尝试，特别是针对GP5蛋白的A表位和B表位，其中对照组1在A和B表位之间仅采用一个刚性linker（EAAAK）得到对照组1，其核酸序列如SEQ ID No：3所示，氨基酸序列如SEQ ID No：4所示；对照组2采用三个柔性linker（GGGGS）替换本发明中的“GGGGSSHIQLIYNLGGGGS”将改造后的GP5蛋白和M蛋白进行连接，其核酸序列如SEQ ID No：5所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；对照组3为发明专利ZL201811114020.6所构建的重组杆状病毒。

对于对照组1和对照组2分别采用实施例1的方法，制备得到相应的重组杆状病毒，并在昆虫细胞sf9中表达制备得到相应的病毒样颗粒，并用于后续相应病毒样颗粒疫苗的制备。对照组3由陕西诺威利华生物科技有限公司提供病毒样颗粒样品。

经测定，基于实施例1同样的培养条件，对照组1重组杆状病毒的P3代病毒滴度约为10^5.72TCID₅₀/ml；对照组2重组杆状病毒的P3代病毒滴度约为10^5.76TCID₅₀/ml。

实施例2：

（1）重组PRRSV病毒样颗粒疫苗的制备：

将实施例1制备得到的重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M按10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，最后与Seppic ISA 206佐剂混合乳化配制疫苗，置于2-8℃备用。

在疫苗制备过程中，本发明实施例1、对照组1、对照组2和对照组3的重组杆状病毒经培养后，均调整到病毒滴度在10⁵TCID₅₀/ml，而后继续后续的冻融等操作。在疫苗制备过程中，控制蛋白浓度为100μg/mL。

（2）疫苗外观和安全性实验

根据本发明人在先专利（ZL201811114020.6）记载的方法对疫苗进行检验，分别进行性状检验、无菌检验、外源病毒检验、支原体检验、安全检验，同时分别针对仔猪和妊娠母猪进行疫苗安全性检验，该部分实验由陕西诺威利华生物科技有限公司完成，检验结果表明本发明的重组PRRSV病毒样颗粒疫苗符合兽药典的相关规定，且对仔猪和妊娠母猪都是安全的。

（3）小鼠免疫

取4-6周龄的雌性Balb/C小鼠共60只，随机分为6组，每组10只，共免疫两次，首免后间隔3周进行加强免疫。其中实施例1-对照组3分别注射对应的重组PRRSV病毒样颗粒疫苗；弱毒疫苗组接种市售的JXA1-R株弱毒活疫苗；空白组不进行接种注射。

（4）中和抗体测定试验

4.1 分离待检血清，经56℃灭活30min后于-20℃保存备用；

4.2 用DMEN基础培养基在96孔板上将待检血清进行连续倍比稀释，从1:2至1:256，每孔50μL；

4.3 将PRRSV SD-16病毒培养液稀释至200个TCID₅₀，在上述已经加有血清的孔中，每孔加入50μL病毒稀释液，于37℃ 5%CO₂培养箱中感染1h；

4.4 在每孔中加入100μL Marc -145细胞悬液（约5×10⁵个/mL），轻轻摇晃均匀后，置于37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养6-8h；其中猪阳性血清由陕西诺威利华生物科技有限公司提供，并测定中和抗体效价为1:16。

4.5 观察并记录细胞病变情况，直至结果稳定为止。具体结果如下:

表1 重组PRRSV病毒样颗粒疫苗诱发的中和抗体水平

基于以上表1的结果可知，本发明实施例1的重组PRRSV病毒样颗粒疫苗相比对照组1-3以及弱毒疫苗能够更早的刺激机体产生中和抗体，首免3周后，80%的小鼠产生1:8以上的中和抗体；而首免6周后，中和抗体效价均达到1:32以上，其中3只小鼠中和抗体效价达到1:64，2只达到1:128，从中和抗体产生的时间和效价水平来看，本发明实施例1的重组PRRSV病毒样颗粒疫苗相对具有很好的免疫保护效果，其有助于动物在感染早期抵抗病毒和防止病情恶化。

实施例3：“IgM-RPPSV VLPs”免疫复合物的制备

（1）RPPSV VLPs的制备：

将实施例1制备得到的重组杆状病毒Ac-PRRSV GP5-M按10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，而后通过Labscale TFF 切滤仪使用100kD分子量滤膜（EMD Millipore公司)使用100kD分子量滤膜浓缩50倍，再通过液相色谱纯化RPPSV VLPs粒子，即得到RPPSV VLPs。

（2）IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物的制备：

将RPPSV VLPs与单克隆抗体5D9（以质量计算）按照1:5的比例混合，37 ℃放置2小时形成复合物。

（3）疫苗的配制

将复合后的“IgM-RPPSV VLPs”免疫复合物（以体积计算）以46:54比值与Montanide ™ ISA 206 油包水佐剂，混合乳化后，得到疫苗组合物。

（4）IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物免疫仔猪的抗体消涨规律

4.1筛选PRRSV抗原抗体双阴性的一月龄健康仔猪6头，随机分为2组，每组3头。第一组为试验组，RPPSV VLPs（10μg）+ ISA 206 +5D9 (50μg)，第二组为对照组，RPPSV VLPs（10μg）+ ISA 206。

首次免疫后30天再进行加强免疫，分别于首次免疫后7日、14日、21日、28日、60日采血，用商品化PRRSV抗体Elisa试剂盒（BioChek）进行抗体检测，以OD值为阳性的血清最大稀释倍数的抗体效价，计算各组的平均抗体效价。检测结果如图5所示。

基于图5的结果可知，采用IgM-RPPSV VLPs 免疫复合物对仔猪进行免疫，相比单独采用RPPSV VLPs免疫能够更早的刺激机体产生较高滴度的抗体。

序列表

<110> 陕西诺威利华生物科技有限公司

西北农林科技大学

<120> 重组PRRSV病毒样颗粒抗原抗体复合物及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttgggga agtgcttgac cgcgtgctgt tgctcgcgat tgcttttttt gtggtgtatc 60

gtgccgtctt atcttgctgt gctcgtcaac gccgaagctg ccgctaagga agctgccgct 120

aagagctctc atattcagtt gatttataac ttaacgctat gtgagctgaa tggcacagat 180

tggctggcac aaaaatttga ctgggcagtg gagacttttg tcatcttccc cgtgttgact 240

cacattgttt cctatggggc actcaccacc agccatttcc ttgacacagt tggtctggcc 300

actgtgtcca ccgccggata ttatcacggg cggtatgtct tgagtagcat ttacgcagtc 360

tgtgctctgg ctgcgctgat ttgctttgtc attaggcttg cgaagaactg catgtcctgg 420

cgctactctt gtaccagata taccaacttc cttctggaca ctaagggcag actctatcgt 480

tggcggtcgc ccgtcattgt ggagaaaggg ggtaaggttg aggtcgaagg tcacctgatc 540

gacctcaaga gagttgtgct tgatggttcc gcggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg 600

gaacaatggg gtcgtctcgg aggtggagga tcatctcata ttcagttgat ttataactta 660

ggaggtggag gatcaatggg gtcgtctcta gacgacttct gcaatgatag cacagctcca 720

cagaaggtgc ttttggcgtt ttccattacc tacacgccag tgatgatata tgctctaaag 780

gtaagtcgcg gccgactgct agggcttctg caccttttga tcttcctgaa ttgtgctttt 840

accttcgggt acatgacatt cgtgcacttt gagagcacaa atagggtcgc gctcactatg 900

ggagcagtag ttgcacttct ttggggagtg tactcagcca tagaaacctg gaaattcatc 960

acctccagat gccgtttgtg cttgctaggc cgcaagtaca ttctggcccc tgcccaccac 1020

gtcgaaagtg ccgcgggctt tcatccgatt gcggcaaatg ataaccacgc atttgtcgtc 1080

cggcgtcccg gctccactac ggtcaacggc acattggtgc ccgggttgaa aagcctcgtg 1140

ttgggtggca gaaaagctgt taagcaggga gtggtaaacc ttgttaaata tgccaaa 1197

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Glu

20 25 30

Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ser Ser His Ile Gln Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Gln

50 55 60

Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr

65 70 75 80

His Ile Val Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr

85 90 95

Val Gly Leu Ala Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr

100 105 110

Val Leu Ser Ser Ile Tyr Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys

115 120 125

Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys

130 135 140

Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg

145 150 155 160

Trp Arg Ser Pro Val Ile Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu

165 170 175

Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala

180 185 190

Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu Gly Gly

195 200 205

Gly Gly Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Pro

225 230 235 240

Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile

245 250 255

Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu

260 265 270

Leu Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val

275 280 285

His Phe Glu Ser Thr Asn Arg Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val

290 295 300

Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile

305 310 315 320

Thr Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala

325 330 335

Pro Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala

340 345 350

Asn Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val

355 360 365

Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg

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Lys Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttgactggg cagtggagac ttttgtcatc ttccccgtgt tgactcacat tgtttcctat 240

ggggcactca ccaccagcca tttccttgac acagttggtc tggccactgt gtccaccgcc 300

ggatattatc acgggcggta tgtcttgagt agcatttacg cagtctgtgc tctggctgcg 360

ctgatttgct ttgtcattag gcttgcgaag aactgcatgt cctggcgcta ctcttgtacc 420

agatatacca acttccttct ggacactaag ggcagactct atcgttggcg gtcgcccgtc 480

attgtggaga aagggggtaa ggttgaggtc gaaggtcacc tgatcgacct caagagagtt 540

gtgcttgatg gttccgcggc aaccccttta accagagttt cagcggaaca atggggtcgt 600

ctcggaggtg gaggatcatc tcatattcag ttgatttata acttaggagg tggaggatca 660

atggggtcgt ctctagacga cttctgcaat gatagcacag ctccacagaa ggtgcttttg 720

gcgttttcca ttacctacac gccagtgatg atatatgctc taaaggtaag tcgcggccga 780

ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttc ctgaattgtg cttttacctt cgggtacatg 840

acattcgtgc actttgagag cacaaatagg gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 900

cttctttggg gagtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 960

ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga aagtgccgcg 1020

ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 1080

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<210> 4

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Glu

20 25 30

Ala Ala Ala Lys Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ala Thr

85 90 95

Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile

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115 120 125

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Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg

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Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ser His

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Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Ser Thr Ala Pro Gln Lys Val Leu Leu

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Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr Ala Leu Lys Val

245 250 255

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Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr Ser Arg Cys Arg

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Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro Ala His His Val

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Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn Asp Asn His Ala

340 345 350

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Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys Ala Val Lys Gln

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385 390

<210> 5

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5